专利名称:一种防治害虫的方法
技术领域
本发明涉及一种对农作物害虫防治的方法,特别是涉及通过种植一种转基因抗虫玉米植物来防治亚洲玉米螟为害玉米的方法,具体地说,本发明涉及一种用在玉米中表达的来源于自然界存在的土壤细菌苏云金杆菌库斯塔基亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki,B.t.k.)中的CryIAb蛋白来防治亚洲玉米螟为害玉米的方法,更具体地说,本发明涉及一种其体内可表达B.t.k.中CryIAb蛋白的转基因抗虫玉米品系MON810用于防治亚洲玉米螟为害玉米的方法;本发明也涉及所述的转基因抗虫玉米,特别是转基因抗虫玉米品系MON810作为防治亚洲玉米螟为害玉米的用途。
玉米螟在中国所有玉米产区都有为害发生,是玉米生产上的第一大害虫。一般年份春玉米受害减产7~10%,大发生年减产30%以上。夏玉米由于生长季节短,因玉米螟为害造成的损失更大。玉米是中国第三大粮食作物,年种植面积在2千万公顷以上。按每公顷平均单产4,500公斤计算,每年因玉米螟为害而减产达60~90亿公斤,折合人民币约20~30亿元。
亚洲玉米螟一生经历卵、幼虫、蛹和成虫4个虫态。幼虫是玉米螟一生中为害作物的唯一虫态。亚洲玉米螟属典型的兼性滞育昆虫,从北到南一年可发生1~7代,但在玉米的整个生育期只发生两代为害,即心叶期世代和穗期世代。如在北方春玉米地区,第一代卵盛期在玉米生长发育的心叶中期,所以也叫心叶期世代。卵多产于叶片背面中脉附近,以植株中上部完全展开叶的叶片为多。幼虫一经孵化既表现潜藏习性,爬入心叶丛蛀食心叶或在叶片间隙取食幼嫩叶片的叶肉造成针孔或窗户纸状的花叶,若3龄以上的幼虫蛀穿纵卷的未展开心叶,则叶片抽出时即出现排孔。一般来说,叶片轻微受害对玉米生长无明显影响。但若种植感虫品种,且螟虫发生较重,叶片严重受害时,则受害后的雄穗不能正常抽出,植株高度会显著降低。幼虫取食心叶组织发育至3龄前后时,玉米进入打苞期。此时幼嫩的雄穗对螟虫比心叶更具有吸引力,所以幼虫全部转移到雄穗取食。抽雄后幼虫被带出心叶丛。在雄穗散开之前幼虫继续取食雄穗。当雄穗逐渐散开时,幼虫即失去符合其上述主要趋性所需要的条件,即生存所必需的小环境,除少数已老熟的幼虫可在雄穗上化蛹外,所有幼虫开始向下转移,由于此时的幼虫基本上已是4~5龄,开始明显地发挥其“钻蛀”的特性。除一部分蛀入雄穗柄发育至老熟或再次向下转移外,由于雄穗柄很细,一般只能容纳1~2条老熟幼虫,因此更多的幼虫必需爬过雄穗柄继续向下转移,寻找更适宜的部位钻蛀。其中,雌穗着生节及其上下节是最易遭受袭击的部位。此时玉米雌穗已开始发育,如其附近茎节被蛀后,会明显地影响其正常发育甚至中止发育。如果第一穗受害较早,则第二穗可继续发育,但已不可能长到第一穗应有的大小。如果第二穗未及时发育成熟又被螟虫钻蛀而停止发育,则此株玉米多绝产。此外,由于螟虫在植株中下部蛀茎,遇风极易造成倒折,使损失更大。第一代幼虫或在雄穗上,或在雄穗柄内,或在茎秆内发育至老熟,除一小部分进入滞育成为来年虫源外,大部分化蛹、羽化而产生第一代成虫。
第二代卵(第一代成虫所产)盛期在玉米花丝盛期,也叫穗期世代,卵仍多产于中上部叶片背面,偶尔也产在茎秆和苞叶上。初孵幼虫大多集中潜藏到雌穗顶端的花丝基部内,取食花丝继而取食雌穗顶部的幼嫩籽粒,亦有少数潜伏在叶腋处取食积存的花粉或叶腋组织。幼虫发育到3龄以后,开始出现钻蛀行为,或直接从穗头蛀入穗轴,或继续取食正在灌浆的籽粒,或从雌穗顶向下转移再次蛀入雌穗、雌穗柄或茎秆。此时玉米雌穗已经充分发育到其应有的大小,并已进入乳熟期。因此穗期螟害不会影响雌穗大小,但影响玉米正常灌浆,从而降低千粒重。如果雌穗柄被蛀空,会造成穗折而脱落。幼虫取食籽粒除直接造成产量损失外,常引发玉米穗、茎腐病的感染,更加重了产量损失和品质下降。
中国玉米螟的防治工作始于50年代。其所采用的主要防治方法有农业防治、化学防治、物理防治、性信息素防治和生物防治等。
农业防治是把整个农田生态系多因素的综合协调管理,调控作物、害虫、环境因素,创造一个有利于作物生长而不利于螟虫发生的农田生态环境。如利用处理玉米螟越冬寄主、改革耕作制度、种植抗螟品种、种植诱集田和间作等措施压低玉米螟的为害。因农业防治必须服从作物布局和增产的要求,应用有一定的局限性,不能作为应急措施,在螟害爆发时就显得无能为力。
化学防治即农药防治,是利用化学杀虫剂来杀灭害虫,是玉米螟综合治理的重要组成部分,它具有速效、方便、简便和高经济效益的特点,特别是在害虫大发生的情况下,是必不可少的应急措施,它可以在害虫造成为害前将其消灭。如目前推广面积最大的颗粒剂防治方法,效果最为稳定和可靠,但高效施颗粒剂的工具仍远未过关,严重影响其作用的发挥。此外还有撒毒土、药液喷雾、敌敌畏封垛熏蒸秸秆垛内越冬代成虫等药剂防治方法。但化学防治也有其局限性,如使用不当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性,以及杀伤天敌,污染环境,使农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。
物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应,利用各种物理因素如光、电、色、温湿度等及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。目前应用最广泛的是高压汞灯诱杀,它利用越冬代幼虫集中在村屯中的玉米秸秆垛中越冬的特点,在越冬代成虫羽化期,大范围连片在村屯设置高压汞灯,对玉米螟成虫进行诱杀,防治效果明显。高压汞灯必须是保证夜间连续供电的村屯方能应用,且操作有一定难度。
性信息素防治是利用人工合成的玉米螟性信息素直接诱杀玉米螟雄虫和干扰螟虫交配,减少田间雌蛾受精率,减轻螟害。
其中的诱杀法是利用人工合成的玉米螟性信息素在玉米螟的交尾栖息场所如长势好的麦田或菜地等诱杀玉米螟雄蛾。此法的缺点是水盆诱捕器管理费工,并且必须大面积连片使用才有效。
其中的迷向法是在越冬代玉米螟成虫羽化10%时,在其交尾场所每公顷用性信息素散发器4500~6000个挂在作物上,干扰螟蛾的交尾。利用性信息素防治一代玉米螟,方法简便,效果良好,不污染环境,不伤害天敌。不足之处是诱芯的投放费工。
生物防治是利用某些有益生物或生物代谢产物来控制害虫种群数量,以达到压低或消灭害虫的目的。其特点是对人、畜安全,对环境污染少,对某些害虫可达到长期控制的目的。最常见的生物防治有赤眼蜂和白僵菌等。但赤眼蜂防治受气候因素影响大,效果常不稳定,并且不论螟虫发生轻重均需同样投资进行。
转基因抗虫玉米就是将外源抗虫基因通过植物基因工程的手段转入玉米细胞,继而再生植株,从而使玉米获得本身所不具有的抗虫特性。
苏云金杆菌又叫苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),是一种能形成芽孢的革兰氏阳性土壤芽孢杆菌,在其孢子形成期能在菌体内形成伴孢晶体。这些伴孢晶体主要由(27~140KD)蛋白质组成,具有高度专一的抗虫作用,对人畜及非靶标昆虫无毒。不同菌株产生的晶体蛋白(Cry)对不同种类昆虫表现出特异的杀虫活性,到目前为止,全世界已分离出几万株苏云金杆菌菌株。
Cry蛋白根据其抗虫谱的不同可分为I、II、III、IV类,I类抗鳞翅目,II类抗鳞翅目和双翅目,III类抗鞘翅目,IV类抗双翅目,各类中又根据氨基酸同源性的多少分成若干小类。例如,在cryI基因间,氨基酸同源性为82%~90%的归为cryIA;55%~71%的归为cryIB;cryIC和cryID彼此之间不同,也不同于cryIA。在cryIA基因中,根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小,又分为cryIAa,4.5kb;cryIAb,5.3kb;cryIAc,6.6kb亚类基因。
CryIAb蛋白是人们发现的一种由苏云金杆菌库斯塔基亚种(Bacillusthuringiensis subsp.kurstaki,B.t.k.)产生的伴孢结晶蛋白,它是不溶性晶体蛋白。晶体蛋白以蛋白原毒素的形式组成。CryIAb晶体蛋白的杀虫性要求蛋白被吸收。在昆虫肠道中,由于高pH值,蛋白原溶解,通过酶的作用与蛋白的活性核紧密结合,不再被昆虫肠道中的蛋白酶降解。核心蛋白在鳞翅目昆虫肠道中与有特异性的受体结合,插入肠膜,形成离子特异性通道。这些生化反应打乱了消化过程,导致昆虫死亡。非靶标昆虫、哺乳类动物、鸟类和鱼类的消化道组织不含能与CryIAb蛋白结合的受体,因此,CryIAb蛋白不能被破坏消化,从而也无毒性。
随着分子遗传技术的发展,已分离出多种杀虫结晶蛋白的基因并测定了其DNA序列。已用这些基因在大豆、玉米、土豆等作物上创建了一些遗传工程植株。已证明这种基因工程植株抗多种鳞翅目(Lepidoptera)害虫的侵害。然而,至今尚无关于通过产生表达CryIAb蛋白的转基因玉米植株来控制亚洲玉米螟对玉米为害的报道。
不同实验室和公司由于使用cry基因种类的不同,构建表达载体所使用调控元件如启动子、内含子、终止子等不同,导致其所得转化体抗虫种类和程度有差异。MON810抗虫玉米品系是由美国孟山都公司利用现代分子生物学技术开发出来的转基因产品,其在体内表达的是B.t.k.中的CryIAb,其商品名称中文为保丰玉米,英文为YieldGard。其产品在美国已进行了商业化,在美国市场可以买到。
虽然MON810抗虫玉米品系在美国已进行了商业化,但其防治对象是欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis),而本发明的防治对象是亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)。
欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)和亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)虽都隶于昆虫纲,鳞翅目,螟蛾科,且都是为害玉米等作物的蛀食性害虫,但两者是在生物学上清晰的、截然不同的两个物种,至少存在以下主要区别(植物保护学报,1988,Vol.15(3)145-152;农业百科全书-昆虫卷,1990,456-459)1、在中国玉米主产区,亚洲玉米螟是为害玉米的主要害虫,还没有发现欧洲玉米螟为害玉米的证据中国玉米螟综合防治研究协作组经过多年的调查和研究,证明亚洲玉米螟主要分布在中国东半壁黑龙江至广东的广大地区,是玉米、谷子、高粱等作物的大害虫。中国主要玉米产区均在此范围内,包括黑龙江、吉林、辽宁、北京、河北、河南、湖北、广东、四川、云南、江苏、宁夏、贵州、内蒙古、山东、甘肃等17省市(自治区)。
欧洲玉米螟到目前为止仅发现分布于新疆的伊宁、内蒙古的呼和浩特、宁夏的永宁和河北的张家口、芦台。除在新疆的伊宁为害玉米外,其它地区主要寄生于苍耳和大麻等,还没有发现为害玉米的证据。
2、在美国,亚洲玉米螟是不存在的亚洲玉米螟分布在亚洲温带和热带、澳大利亚和大洋洲密克罗尼西亚等地区。除中国外,亚洲玉米螟广泛分布于日本、东南亚和澳大利亚,而在上述地区均未见有关欧洲玉米螟存在的报道。
欧洲玉米螟分布在欧洲、北美洲、西非及小亚西亚,在这些地区未见有亚洲玉米螟存在的报道。
3、二者对玉米的为害习性不同据报道,四龄前的欧洲玉米螟幼虫在玉米穗期为害时隐藏在叶鞘与茎秆交界处为害;而四龄前的亚洲玉米螟玉米穗期为害时多在玉米雌穗上为害花丝和嫩籽粒。
4、二者在形态上不同大多数昆虫种群的鉴定最终是靠解剖比较其雄或雌性昆虫的外生殖器的结构来决定的。也就是说,有许多昆虫种群在外观上非常相似,但生殖器却有所不同,实际为完全不同的物种;反之亦然。
中国玉米螟综合防治研究协作组经过多年的研究,证明了在中国发生的亚洲玉米螟在形态上是和欧洲玉米螟截然不同的两个物种,二者在雄性外生殖器(抱器腹)特征上存在以下区别●亚洲种一般具3-4个大刺或2个大刺及1个小刺,平均数多于欧洲种。
●亚洲种具刺区长于无刺区,欧洲种相反。
●两侧抱器腹的两区长度关系不一致。
5、二者之间存在生殖隔离生物不同种之间的根本区别是其间存在生殖上的隔离,即不同种之间不能交配产生具有正常繁殖能力的后代。中国玉米螟综合防治研究协作组用了5年时间,对1300余对采自不同地区(包括奥地利)的玉米螟,进行多种组合交配。试验发现,所有来自中国东部玉米产区玉米上的玉米螟均与来自奥地利的欧洲玉米螟存在生殖隔离,只有来自新疆伊宁玉米及宁夏和张家口苍耳等地区的玉米螟与欧洲玉米螟无生殖隔离。因此,在中国玉米主产区发生的玉米螟和欧洲玉米螟之间存在生殖隔离。
6、二者对性信息素的反应不同不同种昆虫的性信息素化学结构是不同的。昆虫性信息素由多种化合物组成。而且以化合物的种类和混合比不同来完成性的隔离。已有报道证明,欧亚两种玉米螟性信息素的化学结构截然不同。
中国玉米螟综合防治研究协作组用了5年时间,在20个省市34个地区进行了欧亚两种玉米螟性信息素的诱蛾活性试验。结果表明,在中国发生的亚洲玉米螟对欧洲玉米螟性信息素不发生反应。
7、二者的性信息素化学成分及结构不同性信息素的化学成分及各组分的配比是区分不同昆虫种群的重要指标之一。对玉米螟性信息素结构的分析结果表明,在中国发生的亚洲玉米螟的性信息素的化学成分为顺、反12-十四烯醇乙酸酯,配比为47∶53,而欧洲玉米螟的性信息素的化学成分为97∶3的顺、反11-十四烯醇乙酸酯,二者是不一样的。
综上所述,由于亚洲玉米螟与欧洲玉米螟存在诸多方面的不同,因此,本发明所述的转基因抗虫玉米用于防治亚洲玉米螟为害玉米的方法并非是显而易见的。
本发明是利用转基因抗虫玉米来防治亚洲玉米螟的为害。该转基因抗虫玉米本身可表达CryIAb蛋白,从而使得玉米产生了抵抗亚洲玉米螟的能力。
因此,本发明的目的是提供一种可以表达CryIAb蛋白的转基因抗虫玉米,特别是转基因抗虫玉米品系MON810,来防治亚洲玉米螟为害玉米的方法。
本发明的另一目的在于提供一种所述的转基因抗虫玉米,特别是转基因抗虫玉米品系MON810作为防治亚洲玉米螟为害玉米的用途。
本发明涉及一种防治亚洲玉米螟为害玉米的方法,其特征在于,通过种植一种在其体内可表达CryIAb蛋白的转基因抗虫玉米植物,从而使摄取该植物组织的亚洲玉米螟的取食和生长受到抑制,并最终导致死亡,来实现对亚洲玉米螟为害玉米的防治。
按照本发明所述的防治亚洲玉米螟为害玉米的方法,其中所述的CryIAb蛋白具有下述的CryIAb蛋白的氨基酸序列CryIAb蛋白的氨基酸序列如下,其与自然存在的CryIAb蛋白相同1 MDNNPNINEC IPYNCLSNPE VEVLGGERIE TGYTFIDISL SLTQFLLSEF51 VPGAGFVLGL VDIIWGIFGP SQWDAFLVQI EQLINQRIEE FARNQAISRL101 EGLSNLYQIY AESFREWEAD PTNPALREEM RIQFNDMNSA LTTAIPLFAV151 QNYQVPLLSV YVQAANLHLS VLRDVSVFGQ RWGFDAATIN SRYNDLTRLI201 GNYTDHAVRW YNTGLERVWG PDSRDWIRYN QFRRELTLTV LDIVSLFPNY251 DSRTYPIRTV SQLTREIYTN PVLENFDGSF RGSAQGIEGS IRSPHLMDIL301 NSITIYTDAH RGEYYWSGHQ IMASPVGFSG PEFTFPLYGT MGNAAPQQRI351 VAQLGQGVYR TLSSTLYRRP FNIGINNQQL SVLDGTEFAY GTSSNLPSAV401 YRKSGTVDSL DEIPPQNNNV PPRQGFSHRL SHVSMFRSGF SNSSVSIIRA451 PMFSWIHRSA EFNNIIPSSQ ITQIPLTKST NLGSGTSWKGPGFTGGDIL501 RRTSPGQIST LRVNITAPLS QRYRVRIRYA STTNLQFHTS IDGRPINQGN551 FSATMSSGSN LQSGSFRTVG FTTPFNFSNG SSVFTLSAHV FNSGNEVYID601 RIEFVPAEVT FEAEYDLERA QKAVNELFTS SNQIGLKTDV TDYHIDQVSN651 LVECLSDEFC LDEKKELSEK VKHAKRLSDE RNLLQDPNFR GINRQLDRGW701 RGSTDITIQG GDDVFKENYV TLLGTFDECY PTYLYQKIDE SKLKAYTRYQ751 LRGYIEDSQD LEIYLIRYNA KHETVNVPGT GSLWPLSAPS PIGKCAHHSH801 HFSLDIDVGC TDLNEDLGVW VIFKIKTQDG HERLGNLEFL EGRAPLVGEA851 LARVKRAEKK WRDKREKLEW ETNIVYKEAK ESVDALFVNS QYDRLQADTN901 IAMIHAADKR VHSIREAYLP ELSVIPGVNA AIFEELEGRI FTAFSLYDAR951 NVIKNGDFNN GLSCWNVKGH VDVEEQNNHR SVLVVPEWEA EVSQEVRVCP1001 GRGYILRVTA YKEGYGEGCV TIHEIENNTD ELKFSNCVEE EVYPNNTVTC1051 NDYTATQEEY EGTYTSRNRG YDGAYESNSS VPADYASAYE EKAYTDGRRD1101 NPCESNRGYG DYTPLPAGYV TKELEYFPET DKVWIEIGET EGTFIVDSVE1151 LLLMEE
按照本发明所述的防治亚洲玉米螟为害玉米的方法,其中所述的转基因抗虫玉米为转基因抗虫玉米品系MON810,其包括任何MON810自交系、杂交种、综合种或其群体,例如,自交系LH185MON810和Mo17MON810等,杂交种LH198×LH185MON810、B73×Mo17MON810等。
按照本发明所述的防治亚洲玉米螟为害玉米的方法,其中所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗虫玉米的整个植株对亚洲玉米螟为害玉米的防治;所述的整个植株对亚洲玉米螟的防治包括其叶片、茎杆、雄穗、花药和花丝等对亚洲玉米螟为害玉米的防治;按照本发明所述的防治亚洲玉米螟的方法,其中所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗虫玉米的全生育期对亚洲玉米螟为害玉米为害玉米的防治;所述的全生育期对亚洲玉米螟的防治包括其苗期、新叶期、打苞期、抽雄期、花丝期等对亚洲玉米螟的防治;按照本发明所述的防治亚洲玉米螟的方法,其中所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指不因种植地点的改变而改变,不因种植时间的改变而改变;另外,按照本发明所述的防治亚洲玉米螟为害玉米的方法,其中所述的对亚洲玉米螟危害玉米的防治是指转基因抗虫玉米在大田人工接种亚洲玉米螟条件下所表现出的增产作用、籽粒重量的提高、茎杆抗性的改善等,以及其在大田亚洲玉米螟自然发生为害条件下所表现出的增产作用、籽粒重量的提高、茎杆抗性的改善等。
本发明还涉及所述的转基因抗虫玉米特别是转基因抗虫玉米品系MON810作为防治亚洲玉米螟为害玉米的用途。
本发明与现有的对亚洲玉米螟防治的最明显的区别,即本发明所产生的有益效果是本发明具有明显的增产作用。玉米是中国重要的粮食作物,常年播种面积在2000万公顷以上,每公顷平均单产约5,000公斤,若全部改种抗虫玉米MON810,以本实验的增产幅度19.6%计算(实施例6),每年可为中国增收粮食近200亿公斤,折合人民币约160亿元;即使以10%的增产幅度计算,每年也可为中国增收粮食近100亿公斤,折合人民币约80亿元。可见本发明具有重要的社会效益和经济效益。这是目前采用的任何亚洲玉米螟防治方法所无法比拟的。
现阶段使用的化学杀虫剂防治亚洲玉米螟的方法,虽对控制亚洲玉米螟对玉米的为害起到了一定作用,但同时也带来了对人体、家畜和土壤本身的危害,使用本发明的方法,可消除这些危害。
现有的亚洲玉米螟防治方法主要是通过外部作用即外因来达到对亚洲玉米螟为害玉米的防治。而本发明是通过植物体内产生能杀死亚洲玉米螟的CryIAb蛋白来防治亚洲玉米螟的,即通过内因来防治;现有的亚洲玉米螟防治方法都不是全生育期的,而本发明是对玉米进行全生育期的保护,抗虫玉米品系MON810从玉米生长的苗期,到新叶期,到打苞期,到吐丝期乃至成熟期,都免遭亚洲玉米螟的侵害。这是现有的亚洲玉米螟防治方法所无法达到的;现有的对亚洲玉米螟的防治方法不存在所谓全植株的防治,而本发明是对玉米整个植株进行保护,抗虫玉米品系MON810的叶片、茎秆、花药、花丝等都是抗亚洲玉米螟的,这也是目前亚洲玉米螟防治所无法解决的;现有的亚洲玉米螟防治方法,其效果是不稳定的,而本发明对亚洲玉米螟为害玉米的防治效果是稳定的,抗虫玉米品系MON810对亚洲玉米螟的防治效果在不同地点、不同时间、不同遗传背景都是稳定一致的;现有的亚洲玉米螟防治方法,其效果是不彻底的,只起到减轻作用,本发明的抗虫玉米品系MON810对初孵亚洲玉米螟幼虫的防治效果几乎为百分之百,极个别存活幼虫体形极小,都是明显的发育不良,且已停止发育,很难再对玉米造成为害;
与现有亚洲玉米螟防治方法相比,本发明具有简单、方便、经济和对环境不产生污染等优点。采用本发明的技术,只需种植能表达CryIAb蛋白的抗虫玉米品系MON810即可,而不需要采用其它措施,从而节省了大量人力、物力和财力,亦不会对环境产生污染;本发明与现有亚洲玉米螟防治的不同之处还在于,本发明可使玉米籽粒性状和茎秆的表现得到改善;本发明与现有亚洲玉米螟防治的不同之处还在于,虽然MON810玉米品系表现的活性CryIAb蛋白的氨基酸序列与做为微生物杀虫剂的苏云金杆菌产生的蛋白完全一致,但两者却差异很大。由于苏云金杆菌制剂需要直接喷施到作物表面,因此就造成了有活性的结晶蛋白(包括CryIAb蛋白)在环境中被降解,导致杀虫剂的重复生产和重复应用,并为在农业生产上的实际应用带来困难,大大增加了成本。而本发明是使这种CryIAb蛋白在植物体内进行表达,有效地避免了生物杀虫剂在自然界不稳定等缺点,节省了人力和物力。
下面对附图进行简要说明


图1为PV-ZMBK07和PV-ZMGT10的质粒示意图Southern分析用到的限制位点及其位置(用碱基对表示)如本图所示。
图2为玉米品系MON810DNA的Southern分析图,即为插入片段数目的分析。泳道1和泳道2分别是下列DNA的NdeI消化产物,PV-ZMBK07是杂交探针。泳道1MON818的DNA;泳道2MON810的DNA。
→表示从分子量标记得出的DNA片段大小的符号;≈表示从分子量标记和质粒消化产物得出的DNA片段大小的符号;*表示背景带的符号。
图3为玉米品系MON810DNA的Southern分析图,即对CryIAb基因的分析。泳道1、泳道2和泳道3分别是下列DNA的NcoI/EcoRI消化产物,cryIAb基因是杂交探针。泳道1约50pg PV-ZMBK07;泳道2MON818的DNA;泳道3MON810的DNA。
→表示从溴化乙锭(EB)染色的凝胶中分子量标记得出的DNA片段的大小的符号;—表示从质粒消化产物得出的DNA片段大小的符号;≈表示从分子量标记和质粒消化产物得出的DNA片段大小的符号;**表示临近泳道的杂交区域。该符号只在泳道1出现,因为其DNA电泳时以某一角度偏离泳道1。
图4为玉米品系MON810DNA的Southern分析图,即对CP4 ESPSP基因和gox基因的分析。泳道1、泳道2、泳道3和泳道4分别是下列DNA的NcoI/BamHI消化产物泳道1和泳道3是约50pg的质粒PV-ZMBK07和PV-ZMGT10,泳道2和泳道4是MON810的DNA,泳道1和泳道2的杂交探针是CP4 ESPSP基因,泳道3和泳道4的杂交探针是gox基因;→表示从溴化乙锭(EB)染色的凝胶中分子量标记得出的DNA片段大小的符号;—表示从质粒消化产物得出的DNA片段大小的符号。
图5为玉米品系MON810DNA的Southern分析图。泳道1-6分别是下列DNA的NcoI/EcoRI消化产物泳道1和泳道4是约50pg的质粒PV-ZMBK07;泳道2和泳道5是MON818的DNA,泳道3和泳道6是MON810的DNA;泳道1-3的探针是nptII区域;泳道4-6的杂交探针是ori-pUC区域。
→表示从溴化乙锭(EB)染色的凝胶中分子量标记得出的DNA片段大小的符号;
—表示从质粒消化产物得出的DNA片段大小的符号。
为进一步说明本发明,对所述的可表达CryIAb蛋白的转基因抗虫玉米品系MON810的基本情况进行如下描述1.目的基因cryIAbcryIAb基因是插入MON810抗虫玉米品系中的抗虫目的基因,来源于自然界存在的土壤细菌苏云金芽孢杆菌库斯塔基亚种(Bacillusthuringiensis subsp.kurstaki,B.t.k.)。用于转化的PV-ZMBK07质粒载体中的cryIAb基因为结构基因,长度为3468个核苷酸。与原B.t.k.中的cryIAb相比,它的基因序列经过改变,从而使CryIAb蛋白在玉米中的表达水平大大提高。
2.目的基因cryIAb编码的CryIAb蛋白目的基因cryIAb编码的B.t.k.HD-1[CryIAb]蛋白由1156个氨基酸组成,此蛋白经胰蛋白酶处理后,产生一种在植株体内和体外约含600个氨基酸的具有抗胰蛋白酶的蛋白产物。MON810玉米品系编码的CryIAb蛋白的结构及其所表现的活性与苏云金杆菌产生的蛋白完全一致。
CryIAb蛋白的氨基酸序列与自然界存在的CryIAb蛋白相同。
3.质粒载体的构建MON810抗虫玉米品系的产生使用两种质粒PV-ZMBK07[含cryIAb基因]及PV-ZMGT10[含CP4EPSPS和gox基因]。二种质粒载体的遗传成分列于表1和表2,两种质粒载体的遗传图谱见
图1。
PV-ZMBK07质粒载体显示的cryIAb基因处于增强的CaMV35S启动子E35S的控制之下,该启动子大小约为0.6Kb。位于E35S启动子和cryIAb基因之间的是来自玉米hsp70(热激蛋白)基因的0.8Kb的内含子,其作用是提高基因转录水平。Hsp70内含子后面是大小为3.46Kb的cryIAb基因。cryIAb基因插入到0.26Kb的胭脂氨酸合成酶3′末端非翻译序列,NOS3′,该序列提供mRNA多聚腺苷化信号。
有关PV-ZMGT10质粒载体序列的标记基因及其功能的叙述纯粹是知识性的,因为MON810抗虫玉米品系未曾查出PV-ZMGT10载体的有关基因序列。PV-ZMGT10质粒含有gox和CP4EPSPS标记基因,它们参与了叶绿体中转CTP1和CTP2肽。两个编码区均在含有CaMV35S启动子、玉米hsp70内含子和NOS3′终止子序列的控制之下。
CP4EPSPS基因是从土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)CP4菌株中分离出来的,引入植物后表明对草甘膦抑制作用有强大的抵抗力。草甘膦和目的酶EPSPS结合,阻塞了其活性,EPSPS是芳香族氨基酸生物合成途径中的一个酶。与大多数EPSPS相比,CP4EPSPS对草甘膦的抑制作用有强大的忍受力,并有高度催化作用。因为芳香化合物的存在满足了有忍受力的EPSPS酶的连续作用,使植物细胞表达的CP4EPSPS蛋白对培养基中的草甘膦有抗性。
在PV-ZMGT10中的CP4EPSPS基因含有从拟南芥菜EPSPS中分离出来的叶绿体中转移肽CTP2,它将CP4EPSPS蛋白导向叶绿体,即EPSPS在植物中的位置和芳香氨基酸合成的位点。携带CTP2的CP4EPSPS基因的大小约为1.7Kb。CP4EPSPS基因族(通过3′末端序列的启动子)整合到gox基因族中。
为草甘膦编码、使草甘膦氧化还原酶(GOX)发生代谢变化的gox基因是采用克隆技术从无色杆菌属(新属褐黄杆菌)的LBAA菌株取得。GOX蛋白被整合到含有叶绿体转移肽序列CTP1的质粒中。CTP1是来自拟南芥菜核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(SSU1A)基因的一个小亚单位基因。GOX酶降解草甘膦,使其转化为氨甲基磷酸和乙醛酸。
编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因的α区在细菌控制的启动子存在下,出现在PV-ZMBK07和PV-ZMGT10中。该区域含有一个多接头,允许相容的基因在质粒载体中进行克隆。lacZ-α区之后是0.65KbpUC质粒(ori-pUC)复制起始点,该质粒也可在大肠杆菌中复制。
ori-pUC区域之后是II型新霉素磷酸转移酶(nptII)基因。该酶对氨基糖苷类抗生素有耐药性(例如卡那霉素和新霉素),被用于在构建质粒时作为抗性标记。编码nptII基因的序列是在其本身的细菌启动子存在的条件下从原核生物转座子Tn5衍生而来。
表1PV-ZMBK07质粒中DNA成分一览表
<p>表2PV-ZMGT10质粒中DNA成分一览表
4.受体材料导入目的基因的最初玉米受体为Hi-II,是来自于一个由A188和B73二个玉米自交系杂交而产生的后代。A188和B73分别是美国明尼苏达大学和衣阿华州立大学选育的自交系,在美国种子市场上可以买到。该受体在组织培养阶段有较强的再生能力。
5.转化方法转化载体和受体系统建成后,就可通过适当的转化方法进行操作,将外源目的基因cryIAb导入受体Hi-II。本研究采用的转化方法是基因枪法。
用氯化钙和精脒使DNA沉淀到钨与金的微粒上。将裹有DNA的微粒滴在塑料大载体上,用火药的爆炸力使其通过枪筒高度加速。大载体击中塑料挡板,大载体的飞行被阻,但裹有DNA的微粒继续飞行。微粒穿透靶标植物细胞,DNA沉淀,与细胞染色体整合。
6.转化体筛选再生转化后要从未转化细胞中筛选出转化体。细胞被培养于含有植物生长激素2,4-D的组织培养基上生长。虽然用于转化的DNA溶液含有能编码构成对草甘膦有耐受性的基因(例如CP4EPSPS及gox基因),便于在含有草甘膦的介质中选择遗传改变的细胞,但这些基因在MON810抗虫品系的植株中并不存在。因此,MON810品系中得出的细胞有可能是草甘膦选择过程中的“漏网者”。在以后的阶段中,在没有草甘膦的情况下,愈伤组织再生植株,加以化验,鉴定是否存在CryIAb蛋白产物。
7.转基因植株的鉴定分析整合在MON810品系中的DNA经过分析,以便确定每一基因的插入物数目(玉米染色体组内结合点的数目)以及复制数量。鉴定时采用Southern印迹法,分析从对照玉米植株和抗虫品系玉米植株叶片组织中分离出来的染色体组的DNA。
MON810抗虫玉米品系的产生是通过基因枪方法,所用DNA溶液含有两种质粒PV-ZMBK07[含cryIAb基因]及PV-ZMGT10[含CP4EPSPS和gox基因]。MON810玉米品系并未并入PV-ZMGT10质粒序列。该品系包含一个约5.5KbNdeI片段所整合的DNA,其中含有一个E35S启动子、hsp70内含子和cryIAb基因。nptII基因和PV-ZMBK07质粒的主链并未整合在内。该品系不含CP4EPSPS、gox或nptII基因,也不含PV-ZMGT10质粒的质粒主链.
A.Southern杂交结果质粒PV-ZMBK07具有cryIAb基因,质粒PV-ZMGT10具有CP4EPSPS基因和gox基因。PV-ZMBK07和PVZMGT10这两种质粒载体以及在Southern杂交中用到的限制位点的位置如
图1所示。
MON818和MON810植株的DNA在经过多种限制酶消化之后,用于Southern杂交,以鉴定在粒子轰击时进入玉米基因组的基因。具体地说,就是检测插入片段的数目(玉米基因组中整合位点的数目),各个基因的拷贝数及其完整性。
B.NdeI的消化结果NdeI消化实验的目的是确定在玉米品系MON810中质粒DNA插入片段的数目。质粒PV-ZMBK07和PV-ZMGT10都没有NdeI位点。因此,该酶在插入片段之外进行有效地切割,释放出一条含有插入DNA和临近的玉米基因组DNA的片段。MON818的对照DNA和MON810的DNA经过NdeI消化,用质粒PV-ZMBK07作探针进行杂交,结果如图2所示。MON818的DNA(泳道1)产生一条很亮但扩散的约21.0Kb的带;这是一条背景带,因为在MON818和MON810中它都存在。MON810产生一条约5.5Kb的带(泳道2)。这个结果证明抗虫玉米品系MON810含有一个整合的DNA片段。插入的DNA加上临近的直到NdeI限制位点的玉米基因组DNA,约有5.5Kb。
C.插入片段的成份1).cryIAb基因的整合MON818和MON810的DNA用NcoI/EcoRI消化,以产生cryIAb基因,在Southern杂交中用cryIAb基因作为探针。实验结果如图3(泳道1-3)所示。阳性杂交对照(泳道1)产生1个3.46Kb的片段,相当于预期的cryIAb基因的大小(参考
图1的质粒示意图)。由于质粒DNA中没有对照的基因组DNA,这条带看起来比其实际的分子量要大。MON818的DNA(泳道2)没有产生带,这与对照品系的预期结果相同。MON810(泳道3)产生一条约3.1Kb的带。
2).CP4ESPSP基因的整合质粒DNA(PV-ZMBK07和PV-ZMGT10)和抗虫玉米品系MON810DNA用NcoI/BamHI消化,以产生CP4ESPSP基因,在Southern杂交中用CP4ESPSP基因作为探针。实验结果如图4(泳道1-2)所示。约50pg的两种质粒的混合DNA(泳道1)产生1条3.1Kb的带,相当于预期的CP4ESPSP片段的大小,这与从质粒示意图(
图1中的PV-ZMGT10)估计的结果相同。MON810的DNA(泳道2)没有与CP4ESPSP探针杂交的片段,证明玉米抗虫品系MON810没有CP4ESPSP基因。
3).gox基因的整合质粒DNA(PV-ZMBK07和PV-ZMGT10)和抗虫玉米品系MON810DNA用NcoI/BamHI消化,以产生gox基因,在Southern杂交中用gox基因作为探针。实验结果如图4(泳道3-4)所示。约50pg的两种质粒的混合DNA(泳道3)产生1条约3.1Kb的NcoI/NcoI片段,相当于预期的gox片段的大小,这与从质粒示意图(
图1中的PV-ZMGT10)估计的结果相同。MON810的DNA(泳道4)没有与gox探针杂交的片段,证明抗虫玉米品系MON810没有gox基因。
4).载体骨架的整合质粒PV-ZMBK07、对照品系MON818和抗虫玉米品系MON810的DNA用NcoI/EcoRI消化,以产生nptII/ori-pUC骨架,在Southern杂交中用nptII基因作为探针。实验结果如图5(泳道1-3)所示。约50pg的质粒PV-ZMBK07的DNA产生两条分别为2.5Kb和1.8Kb的带(泳道1)。2.5Kb和1.8Kb的带相当于预期的来自载体PV-ZMBK07的片段的大小(参考
图1)。MON818的DNA(泳道2)没有产生带,这与未被转化的对照品系的预期结果相同。MON810的DNA(泳道3)没有产生带,证明载体的骨架序列没有整合进抗虫玉米品系MON810。
Southern杂交膜洗净后用ori-pUC区域作为杂交探针。质粒PV-ZMBK07和PV-ZMGT10的DNA(泳道4)具有1条1.8Kb的带。1.8Kb的带相当于预期的来自PV-ZMBK07骨架的片段的大小(参考
图1)。MON818的DNA(泳道5)没有产生带,这与未被转化的对照品系的预期结果相同。MON810的DNA(泳道6)没有产生带,证明载体的骨架序列没有整合进抗虫玉米品系MON810。缺少与oripUC探针和nptII探针杂交的带证明抗虫玉米品系MON810不含任何骨架序列。
8.转基因后代遗传,表型稳定性鉴定MON810抗虫玉米品系等位基因分离和稳定性数据经过收集整理,表明与cryIAb基因组DNA单一活性的插入点的数据一致。
转入基因及其对玉米螟抗性的稳定性在七代杂交和随后的产品商业应用中均已证实。
9.回交转育采用常规杂交和回交育种方法,以任何MON810抗虫玉米作为供体,就可得到我们所需遗传背景的MON810抗虫玉米。
为了更好的理解本发明,我们对下述实施例中所采用的一些技术作如下阐述1.玉米螟的来源本实施例凡涉及到人工接种亚洲玉米螟的研究,所用亚洲玉米螟均为河北省衡水地区越冬种群。采用中国农业科学院植物保护研究所玉米螟研究室发明并获国家专利的无琼脂半人工饲料和周大荣(1980)标准的亚洲玉米螟人工大量饲养方法饲养。实验所用亚洲玉米螟卵块和初孵幼虫均为高质量的。
2.室内生测方法第一步按照下述配方的要求,配制用于饲养亚洲玉米螟的基础饲料。混合后,置于食品搅拌器中搅拌3次,每次1分钟(以防连续搅拌过热)。
成分 用量 (g)1 大豆粉15.02 玉米粉18.03 啤酒酵母 9.04 葡萄糖(或食用白糖)7.55 维生素0.56 红霉素0.157 山梨酸0.58 JSMD(琼脂代用品) 10.0第二步称取45g供鉴定的组织剪成碎片后放入搅拌杯;取90ml自来水,加4滴(约0.2ml)40%甲醛后倒入搅拌杯;开机搅拌3次,每次1分钟,间隔30秒。
第三步将一、二两步所得物在烧杯中混合均匀,制成含MON810和非MON810玉米组织的两种测试饲料备用。
第四步将测试饲料分装入2.5cm×8.0cm的指形管,每管6g,各接初孵玉米螟幼虫10头,用镶有铜纱的橡皮塞堵紧管口,置28-30℃恒温、70-80%RH条件下培养7-1 0天后进行观察。调查存活幼虫数并称其体重。
3.改进的室内生测方法在原室内生测方法上,做了进一步改进。将从田间采回的新鲜MON810和非MON810玉米的叶片、雄穗和花丝等分别切碎,再放入研钵中。倒入适量液氮速冻,研磨成浆后,将其与一定量经加工过的无琼脂半人工饲料分别混匀,制成测试饲料备用。
取一普通透明胶卷盒,在其盖上打一直径为5mm的圆孔,并在内侧粘一片不锈钢纱片,做成测试盒。将每份测试饲料分装到100个测试盒,每盒约2g,接一头初孵亚洲玉米螟幼虫,每10盒为一组,放在28-30℃恒温、RH为70-80%的条件下饲养,8天后检查并记录每组的亚洲玉米螟活虫数和虫重。
4.食叶级别采用国际玉米螟协作组制定的9级分级标准。
1~3级虫孔针刺状(又称针孔)。
1级稀少、分散,2级中等数量,3级大量。
4~6级虫孔火柴头大小。
4级稀少、分散,5级中等数量,
6级大量。
7~9级虫孔大于火柴头。
7级稀少、分散,8级中等数量,9级大量。其中,1~2.9级为高抗型;3~4.9级为抗型;5~6.9级为中抗型;7~9级为感虫型(超过8级即为高感型)。
实施例1证明抗虫玉米品系MON810在叶片中表达的CryIAb蛋白使得其叶片抗亚洲玉米螟。
实施例1的下述各实验于1997年在中国农业科学院植物保护研究所玉米螟研究室(北京)进行。供试材料MON810玉米为杂交种B73×Mo17MON810,而非MON810为其同型的常规杂交种B73×Mo17。B73由美国衣爱华州立大学选育,Mo17由美国密苏里州立大学选育,Mo17MON810由美国Holden′s基础种子公司通过回交转育而成。B73×Mo17MON810和B73×Mo17可从美国Holden′s基础种子公司买到(Holden′s Foundation Seeds L.L.C.,Williamsburg,Iowa,USA)。
实验1生测方法表明,抗虫玉米品系MON810在新叶组织中表达的CryIAb蛋白使得其新叶组织抗亚洲玉米螟。
称取45g玉米新鲜心叶组织,采用室内生测方法进行鉴定。观察发现,非MON810的对照管中,极易看到发育良好的3~4龄幼虫,而MON810各管中则没有看到3~4龄幼虫。在MON810各管中,可见的是没有发育即死亡的幼虫附着在绿色的测试饲料上和指形管的管壁上。
实验2田间鉴定表明,抗虫玉米品系MON810在玉米新叶中期的叶片中表达的CryIAb蛋白使得玉米新叶中期的叶片抗亚洲玉米螟。
供鉴定的MON810和非MON810玉米于1997年4月23日播种,鉴定于6月17和20日在玉米的心叶中期进行,每株接黑头卵2块(每块约40-50粒),于6月28日调查结果,共2项指标一是国际食叶等级,二是每株幼虫成活数。结果见表3,清楚表明极佳的防治效果在MON810玉米植株上未发现存活幼虫。
表3玉米心叶期对亚洲玉米螟的抗性结果
实验3抗虫玉米品系MON810在玉米新叶期的不同叶片中表达的CryIAb蛋白使得玉米新叶期的不同叶片抗亚洲玉米螟表4心叶期不同叶片对亚洲玉米螟的抗性
在田间生长的MON810和非MON810玉米植株发育至心叶中期时,标出其自下而上的第5片叶片,然后齐地面将植株割断取回。进一步将全部叶片按自下而上分别标明叶序,并齐茎秆着生处逐片剪下,分成5组,即第5、6叶,第7、8叶,第9、10叶,第11、12叶以及最后2-3片尚未展出的紧包雄穗芽的嫩叶。将所有从6株MON810和6株非MON810玉米上剪下的各5组叶片剪碎、分别按组混合,按室内生测方法加工处理和接虫观察。结果列于表4。
表4结果清楚表明所有来自不同高度的MON810叶片以及心叶组织含有的CryIAb均有足以杀死几乎全部供试初孵幼虫的能力。在全部MON810叶片喂养试验中,所接种的1000头初孵幼虫中,只发现1头明显发育不良、体形极小的活虫,表现在停留在2龄阶段,而不是像非MON810处理对照均已达3~4龄。
实验4抗虫玉米品系MON810在包裹幼嫩雄穗的最上部两片叶中表达的CryIAb蛋白使得包裹幼嫩雄穗的最上部两片叶抗亚洲玉米螟将在抽雄期的MON810和非MON810玉米植株地上部取回实验室,将包着雄穗的最上部两片剪下。生测方法同前,结果表明包裹幼嫩雄穗的最上部两片叶都含有足够的CryIAb毒蛋白,初孵幼虫死亡率达到100%(见表5)。
表5包裹雄穗的最后两片叶对亚洲玉米螟的抗性
<
<p>表6露雄期包裹雄穗的两片叶片的杀虫活性处理 幼虫数(头)存活虫数总重 死亡率 虫重/头饲料∶组织 接虫数 存活虫数 (g)(%) 平均(mg) 平均1∶1 非MON81011 8 0.182227.278.73 22.775021.066410 8 0.235720 29.462511 11 0.20610 18.736412 12 0.20650 17.208310 10 0.17690 17.690010 10 0.19450 19.450010 9 0.169210 18.800010 9 0.195710 21.744410 10 0.20460 20.460010 8 0.194720 24.33751∶1 MON810 10 0 100 99 0.010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 1 0.0000900.010 0 10010 0 10010 0 10010 0 1003∶2 MON810 10 0 100 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 100
实验6抗虫玉米品系MON810抽雄期包裹雄穗的两片叶以下的5片展开叶片中表达的CryIAb蛋白使得抽雄期包裹雄穗的两片叶以下的5片展开叶片抗亚洲玉米螟将在抽雄期的MON810和非MON810玉米植株地上部取回实验室,将包着雄穗的两叶片以下的5片展开叶片剪下。依改进的室内生测方法测定其抗性,结果列于表7。从表7中可以看到,MON810玉米叶片的处理含有足够的CryIAb蛋白,亚洲玉米螟幼虫死亡率分别为98%和100%,而非MON810仅为3%和6.91%;且MON810和非MON810存活幼虫体重差异很大。
表7露雄期包裹雄穗的两片叶以下的5片展开叶片的杀虫活性处理幼虫数(头) 存活虫数总重 死亡率 虫重/头饲料∶组织 接虫数 存活虫数(g) (%)平均(mg) 平均3∶2 非MON81088 0.178 0 3 22.2500 19.846410 8 0.137 20 17.125011 11 0.20490 18 627310 10 0.184 0 18.400010 10 0.21430 21.430010 10 0.17540 17.540010 9 0.170310 18.922210 10 0.21860 21 860010 10 0.22640 22.640010 10 0.19670 19.67003∶2 MON810 10 1 0.000090 98 0.0 0.010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 1 0.0000 90 0.0
10 0 10010 0 10010 0 1001∶1 非MON810 10 8 0.18 20 6.9122.5000 22.341410 10 0.24820 24.820010 10 0.22420 22.420010 8 0.148420 18.550010 10 0.22380 22.380012 12 0.299 0 24.916711 10 0.22599.1 22.590010 8 0.174320 21.787510 10 0.19870 19.870010 10 0.23580 23.58001∶1 MON81010 0 100 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 100实施例2证明抗虫玉米品系MON810雄穗中表达的CryIAb蛋白使得其雄穗抗亚洲玉米螟。
该实施例的下述各实验于1997年在中国农业科学院植物保护研究所玉米螟研究室(北京)进行。供试材料MON810玉米为杂交种B73×Mo17MON810,而非MON810为其同型的常规杂交种B73×Mo17。B73由美国衣爱华州立大学选育,Mo17由美国密苏里州立大学选育,Mo17MON810由美国Holden′s基础种子公司通过回交转育而成。B73×Mo17MON810和B73×Mo17可从美国Holden′s基础种子公司买到(Holden′s Foundation Seeds L.L.C.,Williamsburg,Iowa,USA)。
实验1雄穗抗性的鉴定技术是将2块黑头卵放在幼嫩雄穗上,然后套上一个授粉袋并扎紧袋口以减少逃逸或被鸟类啄食。1997年7月4日对MON810和非MON810的玉米各26株进行了接种,7月16日调查成活幼虫数,结果见表8。MON810和非MON810的雄穗差别显著,MON810玉米雄穗含有足够的CryIAb蛋白,没有发现存活幼虫,幼虫死亡率达到100%。
表8MON810雄穗对亚洲玉米螟的抗性
实验2室内生测方法同前,只是搅碎组织时加水量减少10ml,因新鲜雄穗含水量远较心叶为多。结果表明,MON810玉米雄穗含有足够的CryIAb蛋白,初孵幼虫死亡率达到100%(见表9)。
表9雄穗芽对亚洲玉米螟的抗性
实验3散粉前的雄穗中表达的CryIAb蛋白使得散粉前的雄穗抗亚洲玉米螟采用前述改进的室内测定方法,结果表明,含有MON810玉米散粉前雄穗组织的饲料可杀死93%以上的亚洲玉米螟初孵幼虫,存活下来的幼虫发育停滞(见表10),可见其含有足够的CryIAb蛋白。
表10散粉前的雄穗对亚洲玉米螟的抗性处理幼虫数 存活虫数总重 死亡率虫重/头饲料∶组织 接虫数 存活虫数(g) (%) 平均 (mg)平均3∶2 非MON81010 10 0.150101.2515.01 17.322611 11 0.2123019.3010 10 0.1513015.1310 9 0.207 10 23.0011 11 0.1572014.2910 10 0.1352013.5210 10 0.1871018.7110 10 0.1962019.623∶2 MON810 11 1 0.000290.9193.980.20 0.150010 1 0.0001900.1011 1 0.000090.91 0.010 0 10010 1 0.0002900.2010 0 10010 0 10010 1 0.000190 0.101∶1 非MON81010 9 0.09 10 2.5010.00 14.272110 9 0.190510 21.1710 10 0.1252012.5210 10 0.1402014.0210 10 0.1134011.3410 10 0.1598015.9810 10 0.1344013.4410 10 0.1571015.711∶1 MON810 11 2 0.000281.8295.23 0.10 0.233310 0 10010 1 0.000390 0.3010 0 10010 0 10010 1 0.000390 0.3010 0 10010 0 100
实施例3证明抗虫玉米品系MON810在花药中表达的CryIAb蛋白使得其花药抗亚洲玉米螟。
实验于1997年在中国农业科学院植物保护研究所玉米螟研究室(北京)进行。供试材料MON810玉米为杂交种B73×Mo17MON810,而非MON810为早代系MC-37。B73由美国衣爱华州立大学选育,Mo17由美国密苏里州立大学选育,Mo17MON810由美国Holden′s基础种子公司通过回交转育而成。B73×Mo17MON810可从美国Holden′s基础种子公司买到(Holden′s Foundation Seeds L.L.C.,Williamsburg,Iowa,USA)。非MON810玉米为早代系MC-37,由中国农业科学院植物保护研究所玉米螟研究室提供。
花药的采集用授粉袋套住散粉期的雄穗,第二天抖动雄穗,将散落在袋中的花药用分样筛与花粉分开,带回室内。生测方法同前。
结果表明,MON810玉米的花药含有足够的CryIAb蛋白,含有MON810玉米花药的饲料能杀死100%的亚洲玉米螟初孵幼虫(见表11)。
表11花药的杀虫活性处理 幼虫数 存活虫数总重 死亡率 虫重/头接虫数存活虫数(g)(%)平均(mg)平均MON810 5 0 100 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 100MC-37(CK)5 30.010140 16 3.37 4.76825 50.034106.82
54 0.0204205.1055 0.01670 3.3454 0.0171204.2855 0.00770 1.5453 0.0228407.6054 0.0222205.5555 0.01720 3.4454 0.0266206.65实施例4证明抗虫玉米品系MON810在花丝中表达的CryIAb蛋白使得其花丝抗亚洲玉米螟。
该实施例中的下述各实验于1997年在中国农业科学院植物保护研究所玉米螟研究室(北京)进行。供试材料MON810玉米为杂交种B73×Mo17MON810,而非MON810为其同型的常规杂交种B73×Mo17。B73由美国衣爱华州立大学选育,Mo17由美国密苏里州立大学选育,Mo17MON810由美国Holden′s基础种子公司通过回交转育而成。B73×Mo17MON810和B73×Mo17可从美国Holden′s基础种子公司买到(Holden′s Foundation Seeds L.L.C.,Williamsburg,Iowa,USA)。
实验1采自田间成束的MON810和非MON810玉米新鲜花丝,先在清水中浸沾一下以便保持新鲜,略凉干后放入直径为11.5cm,高10.5cm的塑料罐内,罐底垫一张滤纸,每罐的花丝上接2块黑头卵(约30粒/块)。而后,在每塑料罐上覆扣一个完全相同的空罐,但在罐壁中部开有4个等距的孔,各孔均镶有不锈钢纱以防幼虫孵化后逃逸,上下两罐在接卵后用胶带粘合成一整体,置于28-30℃恒温、70-80%RH条件下培养6天后观察。
结果显示,饲养6天后,MON810玉米的花丝仍新鲜完好,而对照非MON810玉米的花丝已全部被吃光,只剩深棕色的粪便和碎屑,并且在MON810的处理罐中一头活幼虫也见不到,二者的差异极其明显。可见,MON810玉米的花丝中含有足够的CryIAb蛋白。
实验2选取初孵幼虫,采用CIMMYT昆虫学家Mihm博士发明的接种枪(Bazooka)接种初孵幼虫于玉米刚吐出的新鲜花丝上。调查结果见表12。可见,MON810玉米与非MON810玉米的花丝表现出极明显的差异,因此,MON810玉米的花丝中含有足够的CryIAb蛋白。
表12MON810玉米花丝的抗性
实验3实验于1997年在中国农业科学院植物保护研究所玉米螟研究室进行,实验方法采用室内改进的生测方法。结果列于表13。MON810玉米花丝含有足够的CryIAb蛋白,用其配制的饲料能杀死96%以上的亚洲玉米螟初孵幼虫,且存活下来的幼虫发育停滞。
表13花丝对亚洲玉米螟的抗性处理幼虫数存活虫数总重死亡率虫重/头饲料∶组织 接虫数存活虫数 (g) (%) 平均%(mg)平均3∶2 非109 0.13791013.75 15.3212.16MON810108 0.088420 11.05109 0.113110 12.57108 0.086120 10.76106 0.043240 7.2010100.15430 15.4310100.089 0 8.90109 0.144610 16.073∶2 MON810100 100 98.75 0.0100 100100 100
100100100100101 0.0000900.01001001001001∶1 非107 0.116 3010.81 16.5714.08MON8101010 0.16 0 16.001010 0.17340 17.34109 0.12091013.43109 0.0897109.971010 0.15780 15.78108 0.10032012.541110 0.12099.090912.09119 0.117418.1818 13.041∶1 MON810112 0.000681.8182 96.180.30 0.27100100101 0.0003900.30100100100100100100101 0.0002900.20100100100100100100实施例5证明在大田人工接种亚洲玉米螟条件下,CryIAb蛋白在抗虫玉米品系MON810中所表现的增产作用。
试验于1998年在位于中国北方玉米主栽区的沈阳市农业科学院、河南省农业科学院、吉林省农业科学院和吉林省农作物新品种引育中心4个地点进行。供试材料共计14个玉米杂交种,包括6对同型杂交种和二个当地主栽品种(对照)。以LH系组配的杂交种可由美国Holden′s基础种子公司买到(Holden′sFoundation Seeds L.L.C.,Williamsburg,Iowa,USA),其它同型杂交种可从美国孟山都公司买到。当地对照种子可在中国当地种子市场买到。每一对同型杂交种是由1个MON810抗虫杂交种和一个非MON810常规杂交种组成,二者的区别在于MON810抗虫杂交种可表达CryIAb蛋白,而非MON810杂交种则不能,而其它遗传组成是一致的。显而易见,同型杂交种之间所表现的不同是由于含或不含CryIAb蛋白的结果。
在整个玉米生长季节,接虫分三次进行。第一次在新叶期,两块亚洲玉米螟黑头卵(约50~60粒/块)被放入植株的上部新叶中;第二次在抽雄前的打苞期,上部叶片接种两块亚洲玉米螟黑头卵;第三次在吐丝期,两块亚洲玉米螟黑头卵被接种在玉米刚吐出的新鲜花丝中。这样,每株玉米接种量合计约为300~360粒亚洲玉米螟黑头卵。产量结果见表14。
表14表明,可以编码CryIAb蛋白的MON810杂交种相对其同型的非MON810杂交种,在接虫条件下,表现出明显的增产效果。表14可以看出,所有单对同型杂交种在所有试验地点,均表现为MON810杂交种增产,增产幅度最低的为6.7%,最高的为89.5%。在所有4个试验点上,6个非MON810杂交种每公顷产量平均仅为7103公斤,而它们的6个同型MON810杂交种每公顷产量平均则达9102公斤,每公顷增产粮食1999公斤,增产幅度28.1%。4个测试点,MON810杂交种相对非MON810杂交种的增产幅度,以河南农业科学院最高,达69.1%,沈阳农业科学院次之,为29.5%,其次为吉林省农业科学院,为25.1%,最低的为引育中心,亦有15.5%。尽管MON810相对非MON810的增产幅度随6对测试杂交组合的不同而不同,但均表现为增产,幅度为19.8%~32.9%。可以得出,与不含有编码CryIAb蛋白的非MON810玉米杂交种相比,含有编码CryIAb蛋白的MON810玉米杂交种产量水平较高,产量的提高是由于CryIAb蛋白对亚洲玉米螟的抗性所致。
表141998年孟山都MON810效果验证试验产量结果表
引育中心吉林省农作物新品种引育中心同型增产MON810杂交种相对同型常规杂交种的增产幅度实施例6证明在大田亚洲玉米螟自然发生为害条件下,CryIAb蛋白在抗虫玉米品系MON810中所表现出的增产作用。
试验于1998年在沈阳市农业科学院、山东农业大学、丹东农业科学院、吉林省农业科学院和吉林省农作物新品种引育中心5个地点进行。这些地点常年遭受亚洲玉米螟的为害,并导致一定的产量损失。供试材料共计22个玉米杂交种,其中20个是由10对同型杂交种组成,另外2个为当地主推玉米杂交种(对照)。以LH系组配的杂交种可由美国Holden′s基础种子公司买到(Holden′sFoundation Seeds L.L.C.,Williamsburg,Iowa,USA),其它同型杂交种可从美国孟山都公司买到。当地对照种子可在中国当地种子市场买到。同型杂交种如实施例5所述。试验是在大田自然条件下进行,所有的植株都不人为接种亚洲玉米螟,所有亚洲玉米螟的为害都是在大田自然条件下发生。产量结果列于表15。
从表15可知,每一对同型杂交种在所有试验地点,均表现为MON810杂交种产量高于其同型非MON810杂交种。在所有5个试验点上,10个非MON810杂交种每公顷产量平均仅为8066公斤,而它们的10个同型MON810杂交种每公顷产量平均则达9645公斤,每公顷增产粮食1579公斤,增产幅度19.6%。对于5个测试点而言,MON810杂交种相对非MON810杂交种的增产幅度,以丹东农业科学院最高,达46.3%,最低的为吉林省农业科学院,亦有9.8%,沈阳农业科学院、山东农业大学和引育中心位居中间,分别为22.6%、15.0%和13.4%。尽管MON810相对非MON810的增产幅度随10对测试杂交组合的不同而不同,但均表现为增产,幅度为12.3%~26.4%。本试验可以得出,与不含有编码CryIAb蛋白的非MON810玉米杂交种相比,含有编码CryIAb蛋白的MON810玉米杂交种产量较高,产量的增加是由于CryIAb蛋白对亚洲玉米螟的抗性所致。
表151998年孟山都MON810杂交种比较试验产量结果表
引育中心吉林省农作物新品种引育中心同型增产MON810杂交种相对同型常规杂交种的增产幅度实施例7证明,在大田亚洲玉米螟自然发生为害条件下,CryIAb蛋白在抗虫玉米品系MON810的表达,使得其籽粒重量增加、茎杆抗性改良(抗倒伏、减少茎腐病),而对其它性状表现影响不大。
试验方法同实施例6,结果见下述表16。
由表16中可以看到,MON810杂交种含有的CryIAb蛋白不仅使玉米籽粒的千粒重提高,同时由于茎杆质量的改善,使其茎腐病减少、倒伏性降低。就千粒重而言,MON810杂交种平均348克,而非MON810杂交种平均321克,MON810杂交种提高27克,达8.4%。茎腐病、根倒伏和茎倒伏这些性状上,MON810杂交种平均分别为9%、5%和0%,而相应的非MON810杂交种则为19%、9%和1%。显然,这是由于在含有CryIAb蛋白的玉米植株上,亚洲玉米螟的减少而引起的物理和生理破坏的降低而产生的结果。
由表16也可以看到,就株高、穗位高和生育期这些植株性状和生育性状来说,6个MON810杂交种平均为269cm、100cm和110天,相应的6个同型的非MON810杂交种分别为268cm、99cm和110天,二者没有明显区别。主要的叶部病害和穗部性状,如灰斑病、大斑病、小斑病、穗长、穗粗、穗行数、出籽率,除出籽率二者有微小差别(87%对86%)外,其余性状表现二者完全相同。
表161998年孟山都MON810杂交种比较试验主要性状结果
实施例8证明,在大田人工接虫亚洲玉米螟的条件下,CryIAb蛋白在抗虫玉米品系MON810中的表达,使得其籽粒重量增加、茎杆抗性改良(抗倒伏、减少茎腐病),而对其它性状表现影响不大。
试验方法同实验例5,观察结果见表17。
从表17可以看到,在人工大剂量接虫条件下,可以表达CryIAb蛋白的MON810杂交种和非MON810杂交种在株高、穗位高、生育期、大斑病、小斑病、粗缩病、灰斑病、穗长、穗粗、穗行数和出籽率等主要性状上没有大的差别。然而在粒重和茎秆抗性上,MON810表现为不仅千粒重增加,而且植株茎杆抗性增强(倒伏性降低,茎腐病减少)。MON810杂交种的千粒重、倒伏度和茎腐病三个性状的平均值分别为330克、12%和7%,而非MON810杂交种的相应值分别是313克、20%和12%。显然,这是由于在含有CryIAb蛋白的玉米植株上,亚洲玉米螟的减少而引起的物理和生理破坏的降低而产生的结果。
表171998年孟山都MON810杂交种效果验证试验主要性状结果表
<p>实施例9证明在大田接虫条件下,抗虫玉米品系MON810在叶片、茎杆和植株中表达的CryIAb使得其叶片、茎杆和植株抗亚洲玉米螟。
试验方法同实施例5,测定项目包括单株虫孔数、食叶级别、单株隧道长度和为害株率。观察结果见表18。
由表18可知,所有参试的6对同型杂交种,在4个指标性状上,虽然其数值大小随组合的不同而上下变动,但MON810杂交种所遭受亚洲玉米螟的为害程度均远低于其同型的非MON810杂交种。参试的6个MON810杂交种在单株虫孔数、食叶级别、单株隧道长度和为害株率这4个指标性状上,分别为0.04个、0.52级、0.03cm和1.67%,而相应的6个非MON810则为5.48个、3.92级、11.09cm和85%,非MON810杂交种是MON810杂交种的137倍、7倍、370倍和50倍。当地二个常规对照品种的4个指标性状分别为5.81个、2.39级、13.56cm和85.4%,与非MON810杂交种进行比较可以发现,二者对亚洲玉米螟的感染程度是一致的。可见,可编码CryIAb蛋白的MON810杂交种所受亚洲玉米螟为害明显低于不含编码CryIAb蛋白的二个当地对照和同型杂交种。因此,表18表明,在人工接虫处理下,含有CryIAb蛋白玉米杂交种的叶片、茎秆以及整个植株所受亚洲玉米螟的为害要远远低于那些不含CryIAb蛋白的玉米杂交种。显然,这来自于CryIAb蛋白对亚洲玉米螟的防治效果。
表181998年孟山都MON810杂交种效果验证试验主要危害性状结果表
<p>实施例5和例6的综合分析表明,抗虫玉米品系MON810表达的CryIAb蛋白表现了明显的增产作用。在亚洲玉米螟自然为害的大田条件下,MON810杂交种每公顷产量平均9645公斤,而它们同型的非MON810杂交种仅为8066公斤,MON810杂交种每公顷增产粮食1579公斤,增产幅度19.6%。在人工接种亚洲玉米螟的大田条件下,非MON810杂交种每公顷产量平均仅为7103公斤,而它们的同型MON810杂交种每公顷产量平均则达9102公斤,每公顷增产粮食1999公斤,增产幅度28.1%。因此,广泛地讲,只要有亚洲玉米螟为害的地方,种植MON810抗虫玉米,其所表达的CryIAb蛋白都应该是使玉米增产的。
实施例1到例9的综合分析表明,在各种鉴定方法检测下(室内生测方法、改进的室内生测方法、田间鉴定),MON810抗虫玉米品系的叶片、茎秆、雄穗、花药和花丝等组织的CryIAb蛋白的表达量足以杀死几乎全部的亚洲玉米螟的初孵幼虫,因此,这是一种全植株的对亚洲玉米螟的防治能力。这种杀灭害虫的能力不仅体现在亚洲玉米螟最易为害玉米的新叶中期(又叫新叶期世代)和花丝盛期(又叫穗期世代),而且体现在苗期、打苞期、成熟期等,因此,这也是一种全生育期的对亚洲玉米螟的防治能力。由此可见,MON810抗虫玉米所产生的CryIAb蛋白,对玉米是一种全植株和全生育期的防护。
实施例1到例9的综合分析表明,MON810玉米品系对亚洲玉米螟产生毒杀作用的CryIAb蛋白的表达不因种植地点的不同而不同,不因种植时间的变化而变化。1997年在中国农业科学院植物保护研究所玉米螟研究室(北京)进行的实验表明,MON810玉米品系的CryIAb蛋白的表达量足以防治亚洲玉米螟对其的为害。1998年在夏玉米区的河南省农业科学院(郑州)、山东农业大学(泰安)和在春玉米区的沈阳市农业科学院(沈阳)、丹东市农业科学院(丹东)、吉林省农业科学院(公主岭)和吉林省农作物新品种引育中心(公主岭)也都显示,不管是大田亚洲玉米螟自然为害条件下,或是大田人工接虫亚洲玉米螟的条件下,MON810玉米品系表达的CryIAb蛋白亦都足以防治亚洲玉米螟对玉米的为害。因此,广泛地讲,在任何时间和地点,只要有亚洲玉米螟为害玉米的地方,种植MON810抗虫玉米,其所产生的CryIAb蛋白都应足以防治亚洲玉米螟对玉米的为害。
实施例1到例9的综合分析表明,抗虫玉米品系MON810的CryIAb蛋白的表达不因玉米遗传背景的改变而改变。中国农业科学院植物保护研究所玉米螟研究室采用的供试材料的遗传背景为B73×Mo17MON810,在大田人工接虫亚洲玉米螟条件下,供试的为六个遗传背景不同的MON810杂交种(见表14),而在大田亚洲玉米螟自然为害条件下,供试的为十个遗传背景不同的MON810杂交种(见表15),所有这些遗传背景不同的MON810杂交种,均表现出一致的防治亚洲玉米螟的良好效果。这也广泛地说明,CryIAb蛋白的表达从遗传上来说是受制于其是否是MON810抗虫玉米品系。因此,任何MON810抗虫玉米品系,不管是自交系、杂交种、群体、综合种等,都应该是抗亚洲玉米螟的。
本发明所述的转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟的防治显然是因为玉米本身可产生CryIAb蛋白,而MON810玉米仅是CryIAb蛋白表达的一个载体,因此,熟悉本领域的技术人员,根据CryIAb蛋白对亚洲玉米螟的相同毒杀作用,可产生类似的可表达CryIAb蛋白的转基因抗虫玉米,用于防治亚洲玉米螟对玉米的为害。
适用于该发明的CryIAb蛋白是本文所给出氨基酸序列的CryIAb多肽。
通过前述实施例的介绍,我们不难看出本发明的独特之处。
本发明是提供了一种防治亚洲玉米螟为害玉米的新方法,它是利用了现代生物学技术使对亚洲玉米螟产生毒性的CryIAb蛋自在植物体内的表达来实现的。广泛地讲,这种所述的防治方法不仅对玉米,而且对任何遭受亚洲玉米螟为害的作物都是如此。这些被亚洲玉米螟为害的作物包括(但不限于)棉花、谷子、高粱等。因为只要CryIAb蛋白在这些作物体内表达,就可防治亚洲玉米螟对其的为害。
权利要求
1.一种防治亚洲玉米螟为害玉米的方法,其特征在于,其通过种植一种在体内可表达CryIAb蛋白的转基因抗虫玉米植物,从而使摄取该植物组织的亚洲玉米螟的取食和生长受到抑制,并最终导致死亡,来实现对亚洲玉米螟为害玉米的防治。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的CryIAb蛋白具有所述的CryIAb蛋白的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的转基因抗虫玉米为转基因抗虫玉米品系MON810。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的转基因抗虫玉米品系MON810包括任何MON810自交系、杂交种、综合种或群体。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗虫玉米的整个植株对亚洲玉米螟为害玉米的防治。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的转基因抗虫玉米的整个植株对亚洲玉米螟为害玉米的防治包括其叶片、茎杆、雄穗、花药和花丝对亚洲玉米螟为害玉米的防治。
7.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗虫玉米的全生育期对亚洲玉米螟为害玉米的防治。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的转基因抗虫玉米全生育期对亚洲玉米螟为害玉米的防治包括其苗期、新叶期、打苞期、抽雄期、花丝期对亚洲玉米螟为害玉米的防治。
9.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟的防治不因种植地点的改变而改变。
10.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治不因种植时间的改变而改变。
11.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗虫玉米在大田人工接种亚洲玉米螟条件下所表现出的增产作用。
12.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗虫玉米在大田人工接种亚洲玉米螟条件下所表现出的籽粒重量的提高。
13.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗虫玉米在大田人工接种亚洲玉米螟条件下所表现出的茎杆抗性的改善。
14.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗虫玉米在大田亚洲玉米螟自然发生为害条件下所表现出的增产作用。
15.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗虫玉米在大田亚洲玉米螟自然发生为害条件下所表现出的籽粒重量的提高。
16.根据权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述的对亚洲玉米螟为害玉米的防治是指转基因抗玉米在大田亚洲玉米螟自然发生为害条件下所表现出的茎杆抗性的改善。
17.权利要求1至4任一项所述的转基因抗虫玉米作为防治亚洲玉米螟为害玉米的用途。
全文摘要
一种防治亚洲玉米螟为害玉米的方法,其通过种植在其体内可表达CryIAb蛋白的转基因抗虫玉米植物,特别是抗虫玉米品系MON810,从而使摄取该植物组织的亚洲玉米螟的取食和生长受到抑制,并最终导致死亡。所述方法对亚洲玉米螟的防治是全植株的和全生育期的,不因种植时间、种植地点等的改变而改变。并使抗虫玉米的产量明显提高,同时改善了其籽粒性状和茎秆性状的表现。所述方法效果好,具有简单、方便、经济和对环境不产生污染等优点。
文档编号A01H1/04GK1266616SQ00100699
公开日2000年9月20日 申请日期2000年1月28日 优先权日2000年1月28日
发明者保罗·F·约翰森, 周大荣, 刘石, 赵永亮 申请人:孟山都公司
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