专利名称：黄花杓兰种子无菌繁殖方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及杓兰属植物种子无菌繁殖方法。
杓兰属是著名的兰科(Orchidaceae)观赏属之一。该属全世界有47种，中国有32种，主要分布于中国西南的横断山区和北美。杓兰花色艳丽，花型奇特，其唇瓣呈拖鞋状，故有“拖鞋兰”之称，具有很高的观赏和开发价值。杓兰属是温带陆生兰，种子人工无菌萌发很困难，有些杓兰种类的种子萌发率还不到1％。杓兰种子无菌繁殖在欧美等国家开展较多，但繁殖率并不十分理想，黄花杓兰(Cypripedium flavum P．F．Hunt et Summerh．)为中国特有种，目前国内外尚未见黄花杓兰种子无菌繁殖实生苗的报道。
本发明的目的在于提供一种黄花杓兰种子无菌繁殖实生苗的方法，该方法具有操作简单，种子萌发率高，易于大规模生产。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案黄花杓兰种子无菌繁殖方法，包括种子的采集、预处理，培养基的配制，播种，原球茎培养步骤，培养基采用Harvais培养基改良型，将Harvais培养基中的NH4NO3去除，添加2．0mg／L甘氨酸，100mg／L谷氨酰胺，500mg／L酪蛋白水解物；原球茎培养将刚萌发形成的原球茎转移到无激素的Harvais培养基中，置于黑暗中23℃恒温培养，培养一个月后，将原球茎转移到添加了0．5g／L活性炭的无激素Harvais培养基中继续培养，当原球茎分化出芽和根，形成幼苗时，将幼苗转移到光下培养，光照强度为2000lux，待幼苗叶片转绿，出瓶栽培。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果和优异性1)进行了黄花杓兰种子无菌繁殖研究，成功得到实生苗；2)采用的种子萌发培养基为本研究首次研制的改良型培养基，黄花杓兰种子萌发率很高，可达90％以上；3)采用本发明的种子萌发和原球茎培养技术，黄花杓兰原球茎成苗过程不需要经过低温春化处理，与国外报道的杓兰属其它种的成苗技术不同。大大缩短了实生苗成苗周期，实生苗粗壮，易移栽成活。
下面用实施例来进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例11、种子的采集采用人工授粉后第15周的黄花杓兰(Cypripedium flavum P．F．Hunt et Summerh．)蒴果。2、种子的预处理1)将蒴果在自来水中冲洗干净，置于75％的酒精中浸泡0．5小时。
2)无菌条件下剖开蒴果，取出种子，将种子置于0．5％NaClO溶液中处理10分钟，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干。3、培养基配制
1)培养基Harvais培养基(见表1)改良型，即是将Harvais培养基中的NH4NO3去除。添加2．0mg／L 甘氨酸，100mg／L 谷氨酰胺，500mg／L酪蛋白水解物。
2)配制改良型Harvais培养基＋0．4mg／L激动素＋20g／L葡萄糖＋2％土豆＋6．5g／L琼脂，pH值用1N的NaOH调节至5．5。
将配好的培养基分装到100mL的玻璃三角瓶中，每瓶约30mL，用橡皮塞塞住瓶口。培养基在121℃，15个大气压条件下灭菌15分钟。冷却备用。4、播种无菌条件下将黄花杓兰种子播于改良型Harvais培养基中。置于黑暗中23℃恒温培养。5、原球茎培养1)将刚萌发形成的原球茎转移到无激素的Harvais培养基中培养，100mL玻璃三角瓶中每瓶约播原球茎10个。置于黑暗中23℃恒温培养。
2)约培养一个月后，将原球茎转移到添加了0．5g／L活性炭的无激素Harvais培养基中继续培养。
3)当原球茎分化出长约1．0cm的芽和1-3条根，形成幼苗时，将幼苗转移到光下培养，光照强度为2000lux。2周后幼苗叶片转绿，即可出瓶栽培。
附表1Harvais培养基大量元素 每升培养基用量 母液Ca(NO3)2·4H2O 400mg4g／LNH4NO31400mg 14g／LKH2PO4200mg2g／LMgSO4·7H2O 200mg2g／LKNO3200mg2g／LKCl 100mg1g／L微量元素H3BO30．5mg 500mg／LCuSO4·5H2O 0．025mg 25mg／LZnSO4·7H2O 0．5mg 50mg／LNa2MoO4·2H2O 0．02mg 20mg／LCo(NO3)2·6H2O 0．025mg 25mg／LKI 0．1mg 100mg／LMnSO4．H2O 1．54mg 1540mg／L柠檬酸铁盐(NH4)3C6H5O719mg 190mg／LFe(NH4)3(C6H5O7)225mg 250mg／L有机成分烟酸 10mg100mg／L泛酸钙5mg 50mg／L维生素B15mg50mg／L土豆 2％葡萄糖20g琼脂 6．5gpH＝5．权利要求
1.黄花杓兰种子无菌繁殖方法，包括种子的采集、预处理，培养基的配制，播种，原球茎培养步骤，其特征在于培养基采用Harvais培养基改良型，将Harvais培养基中的NH4NO3去除，添加2．0mg／L甘氨酸，100mg／L谷氨酰胺，500mg／L酪蛋白水解物；原球茎培养将刚萌发形成的原球茎转移到无激素的Harvais培养基中，置于黑暗中23℃恒温培养，培养一个月后，将原球茎转移到添加了0．5g／L活性炭的无激素Harvais培养基中继续培养，当原球茎分化出芽和根，形成幼苗时，将幼苗转移到光下培养，光照强度为20001ux，待幼苗叶片转绿，出瓶栽培。
全文摘要
提供一种杓兰属黄花杓兰种子无菌繁殖实生苗的方法,该方法包括种子的采集、预处理,培养基配制,播种,原球茎培养步骤,操作简单,大大缩短了实生苗成苗周期,实生苗粗壮,易移栽成活,种子萌发率高,易于大规模生产。
文档编号A01G31/00GK1278401SQ00109999
公开日2001年1月3日 申请日期2000年8月10日 优先权日2000年8月10日
发明者胡虹, 黄家林, 王 华, 李树云, 罗桂芬 申请人:中国科学院昆明植物研究所