专利名称：栉孔扇贝三倍体苗种生产方法
技术领域：
本发明属于细胞生物技术中的细胞染色体操作技术，是在生产规模下对栉孔扇贝受精卵进行诱导，生产三倍体苗种的一种技术方法。
本发明做出之前，贝类多倍体育种在美、日、英等国都有研究，目前贝类多倍体生产性育种只在牡蛎中获得了成功，而在海湾扇贝、华贵栉孔扇贝、大扇贝等经济扇贝种类中，三倍体诱导虽已获得成功，但均局限于试验规模，没有实现产业化。由于栉孔扇贝为中国独有养殖种类，因此国外没有这一种类三倍体诱导技术的研究。
国内对栉孔扇贝三倍体诱导技术已有研究，如大连水产学院的王子臣等(1990)采用温度休克法进行了栉孔扇贝的三倍体诱导，青岛海洋大学的吕隋芬等(1992)采用细胞松弛素B进行了栉孔扇贝三倍体的诱导，但上述研究也是仅限于试验规模，至今未见用于生产的大规模栉孔扇贝三倍体育苗技术的研究内容。
人工诱导多倍体的方法，不外乎物理、化学和生物的方法，应用较多的主要有温度休克法、静水压处理法和细胞松驰素B(以下简称CB)、咖啡因、6-二甲氨基嘌呤(简称6-DMAP)等化学药物诱导法。上述的三倍体诱导技术虽然获得成功，也可达到较高的三倍体率，但由于试验目的是进行科学研究，试验规模小，对生产性问题没有加以考虑，故技术内容难以在生产中推广使用。
本发明的目的是提出一种新的、利用6-DMAP作为诱导剂，可以应用于大规模生产中的栉孔扇贝三倍体育苗技术，培育出具有生长快、个体大、出柱率高、抗逆能力强等优良品质的栉孔扇贝三倍体苗种。
本发明是按以下操作技术完成的在栉孔扇贝三倍体一定规模苗种生产过程中，首先要解决影响卵子同步发育主要因素的调控技术，主要包括卵子同步受精、同步发育技术和合理用药(6-DMAP)技术；再是掌握适宜诱导技术参数，主要包括起始处理时间、药物浓度，持续处理时间。
卵子同步受精、同步发育技术受精卵发育的同步性与精卵的质量有关，应尽量延长亲贝的暂养时间，亲贝暂养的有效积温应在200℃以上，避免人为刺激提早产卵，以获得充分成熟的卵子。精卵产出后应尽快受精，卵子产出后不超过2小时，精子不超过1小时，否则精卵质量下降，影响受精和发育。受精卵发育的同步性还与操作过程中的方法有关，如受精过程应同步、避免精子污染，雌雄亲贝在暂养时应严格分开，亲贝分别产卵排精后进行人工授精，精子用量应比正常二倍体生产多，保证精、卵比例不少于100∶1，授精后应不断搅动，水的温度不要过低，在较高的水温下，受精卵发育的同步性较高，可获得较高的三倍体率。
合理用药技术采用二级积卵处理方法，先将卵子收集在较大的容器内，密度达到2000个/ml左右开始受精，受精后再将卵子浓缩冲洗收入较小的水槽内，加适量的6-DMAP进行处理，一般用量为10-70mg/L，这样既可以保证一定的药物浓度，又可以减小药物用量，降低生产成本。药物处理时的卵子密度应在3000万粒/L左右，不断搅动，以保证药物作用均匀。
起始处理时间以在光学显微镜下观察到第一极体出现35-45％时效果最好。
药物处理浓度在10-70mg/L的浓度下，6-DMAP可以诱导栉孔扇贝三倍体。
处理持续时间一般为15-20分钟，可获得较高的诱导率和三倍体率，能满足规模化生产的要求。
下面通过实施例详细叙述本发明的大规模苗种生产技术
最佳实施例具体操作工艺过程生产中诱导栉孔扇贝三倍体时，一般采用二级积卵处理方法，即先将卵子收集在一个较大的容器内，常用0.3立方米水槽，卵子密度达到2000个/ml左右开始受精，精子的用量要比正常二倍体生产多，至少保证精子与卵子的比例不少于100∶1，受精后再浓缩冲洗入标有16.6L刻度的较小的水槽内，观察第一极体出现35-40％时，加入1克6-DMAP(60mg/L的浓度)进行处理，处理卵子的密度在3000万粒/L左右，为保证受精及药物作用均匀，必须不断搅动，处理15min后直接入池孵化。
完成上述操作过程首先要解决1.影响卵子同步发育的主要因素的调控技术，主要包括大批量卵子同步受精、同步发育技术和合理用药技术；2.生产栉孔扇贝三倍体苗种的适宜诱导技术参数，包括起始处理时间、药物浓度、持续处理时间。
1.影响卵子同步发育的主要因素及调控技术卵子同步受精、同步发育技术使用6-DMAP诱导栉孔扇贝三倍体，要获得较高的三倍体诱导率，关键问题是保证被处理的受精卵具有较高的同步发育性。受精卵发育的同步性与精卵的质量有关，对栉孔扇贝而言，尽量延长亲贝暂养时间，亲贝暂养的有效积温应在200℃以上。应尽量避免人为刺激提早产卵，是目前研究条件下获得充分成熟卵子的有效方法。一般不采用人工刺激的方法进行催产。另外，在整个生产过程应注意，精卵产出后应尽快受精，卵子产出后不超过2小时，精子不超过1小时，否则，精卵质量下降，将会影响受精率。
受精卵发育的同步性还与操作过程中的方法有关，如受精过程是否同步、避免精子污染等。在实际生产中，由于亲贝的产卵和排精均有一定的时段，不可能在同一时间同时进行，因而自然受精的受精卵发育的同步性较差，为了解决这一问题，亲贝在暂养期间，雌雄要严格分开，分别产卵排精后进行人工授精。授精时的精子用量要比正常二倍体生产多，应保证精子与卵子的比例不少于100∶1，授精后必须不断搅动，这样才能才能达到较高的受精率，同时使受精卵有较好的同步发育性。
6-DMAP诱导贝类三倍体对温度没有依赖性，在较低温度下并不影响减数分裂恢复的能力。正常情况下，水温主要影响到受精卵减数分裂的进程，在较高温度下受精卵发育的同步性较高，可获得较高的三倍率。因此在诱导贝类三倍体时应采用较高的水温。
合理用药技术由于6-DMAP价格较高，为了确保一定的药物处理浓度，同时又能尽可能的降低生产成本，采取二级集卵处理的方法，以保持卵子的活力。先将卵子收集在一个较大的容器内，常用0.3立方米水槽，卵子密度达到2000个/ml左右开始授精。受精后的卵子浓缩冲洗入较小的水槽内，加入适量的6-DMAP进行处理，一般为10-70mg/L，这样既可以保证一定的药物浓度，又可以减少药物用量。药物处理卵子的密度在3000万粒/L左右，为保证受精及药物作用均匀，必须不断搅动。
2.适宜的诱导参数1)最适起始处理时间适宜的诱导参数，是保证较高三倍体率和成活率的关键。在水温20℃条件下，受精后第20min、25min、30min，受精卵分别用60mg/L的6-DMAP处理15min，其三倍体率和成活率见表1、表2表1.不同起始时间处理的三倍体诱导率和孵化率
表2.不同起始处理时间对三倍体率和D型幼虫成活率的影响
试验结果表明，处理时机的选择对三倍体率和D型幼虫成活率有显著影响，卵子受精后第25min开始处理，可获得较高的三倍体率和D型幼虫成活率，但是，在实验条件相同的情况下，采用相同的起始处理时间，在不同批次的诱导中也会得到不同的三倍体率和成活率，这主要是不同批次卵子的发育进程有所差异造成，因此起始处理不应孤立的确定，而应以受精卵发育的生物学时间，即第一极体出现的百分率计算较为准确，经实验最适起始处理时间，以观察到第一极体出现35-45％为好，40％时效果较好，在规模化生产中，还需要参照大概的发育时间过程，留有充分的准备时间。
2)处理持续时间卵子受精后25min(水温20℃)，第一极体占40％时，用60mg/L的6-DMAP处理10-20min，结果见表3表3.不同持续处理时间对D型幼虫成活率和三倍体率的影响
在试验条件下处理10-20min，延长6-DMAP处理时间三倍体率有所增加，但胚胎死亡率也明显上升。持续处理时间15min，可获得较高的诱导率和成活率，能够满足规模化生产的要求。
3)药物处理浓度适宜的药物处理浓度，是获得较高三倍体率的前提下，提高存活率的关键。卵子受精后25min(水温20℃)，第一极体占40％时，用10-70mg/L的6-DMAP处理15min，结果见表4表4.不同药物浓度对三倍体率和D型幼虫成活率的影响
从表中可以看出，10-70mg/L的6-DMAP都可以诱导栉孔扇贝三倍体，随着药物浓度的增加三倍体率上升，但D型幼虫成活率下降，60mg/L的6-DMAP浓度可达到较高的三倍体率和成活率。
本发明技术，规模生产的三倍体诱导率可稳定在80％以上，成体的三倍体率达70％左右。1999年和2000年两年在中国水产科学研究院长岛增殖站进行了生产性试验，1999年，育苗水体100方，共诱导卵子20亿，2000年，育苗水体700方，共处理卵子150亿，两年的D-型幼体三倍体率均达80％以上，稚贝三倍体率达70％以上。
经14个月养殖试验表明，三倍体比二倍体壳高平均增加12.6％，闭壳肌明显大于二倍体，鲜肉柱得率提高66.3％，扇贝养殖产量在现有条件下提高20-30％。
本发明与已有技术(以诱导剂细胞松弛素B(CB)为例)对比，具有以下特点在目前人工诱导贝类三倍体的主要方法中，物理方法，无论是温度刺激还是压力处理，一般认为只能达到70％的倍化率，而化学药物诱导法，即CB及6-DMAP的最大倍化率，在实验室小规模情况下，可达到或接近100％。采用本发明技术，可以在大生产的条件下，使D-型幼体三倍体率达80％以上，稚贝三倍体率达70％以上。
在栉孔扇贝中，6-DMAP可以取得和CB同样的诱导效果，而孵化率大为提高，可达到70％以上，是三倍体栉孔扇贝规模化生产的首选诱导剂。
与CB相比，6-DMAP毒性小，对操作者的潜在危害小。6-DMAP为水溶性，配制药物容易，处理结束时不需要洗卵可直接入池孵化，CB则需用二甲基亚砜溶解及在处理结束后需润洗去除残留的药物，因此，6-DMAP的使用比CB简便，更适合应用于大规模生产。
三倍体动物具有不育性，在生长过程中只有少量能量用于性腺发育，更多的能量用于生长，因此扇贝三倍体具有生长快、个体大、品质优、抗逆能力强等特点，可明显增加产量、提高品质并降低死亡率，这已在多种养殖扇贝的三倍体研究中得到证实。栉孔扇贝三倍体技术的开发和应用，将使扇贝养殖产量在现有条件下提高20-30％，鲜出柱率提高60％左右，并有效地遏制目前存在的品质下降、出柱率低的问题。
权利要求
1.一种栉孔扇贝三倍体苗种生产方法，其特征是在苗种培育过程中，主要是要解决影响卵子同步发育主要因素的调控技术和掌握适宜诱导技术参数，影响卵子同步发育主要因素调控技术包括卵子同步受精、同步发育，合理用药技术等；适宜诱导技术参数包括起始处理时间、药物浓度和持续处理时间。
2.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝三倍体苗种生产方法，其特征是影响卵子发育同步性主要因素调控技术中的同步受精、同步发育技术受精卵发育的同步性与精卵的质量有关，应尽量延长亲贝的暂养时间，亲贝暂养的有效积温应在200℃以上，精卵产出后应尽快受精，卵子产出后不超过2小时，精子不超过1小时。受精卵发育的同步性还与操作过程中的方法有关，如受精过程应同步、避免精子污染，雌雄亲贝在暂养时应严格分开，亲贝分别产卵排精后进行人工授精，精子用量应比正常二倍体生产多，保证精、卵比例不少于100∶1，授精后应不断搅动，水的温度不要过低。
3.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝三倍体苗种生产方法，其特征是影响卵子发育同步性主要因素调控技术中的合理用药技术采用二级积卵处理方法，先将卵子收集在较大的容器内，密度达到2000个/ml左右开始受精，受精后的卵子再次浓缩冲洗入较小的水槽内，加适量的6-DMAP进行处理，一般用量为10-70mg/L，可以保证一定药物浓度，减小药物用量，药物处理时的卵子密度在3000万粒/L左右，不断搅动，以保证药物作用均匀。
4.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝三倍体苗种生产方法，其特征是适宜诱导技术参数中的起始处理时间以在光学显微镜下观察到第一极体出现35-45％时效果最好。
5.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝三倍体苗种生产方法，其特征是适宜诱导技术参数中的药物处理浓度10-70mg/L浓度的6-DMAP均可以诱导栉孔扇贝三倍体。
6.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝三倍体苗种生产方法，其特征是适宜诱导技术参数中的处理持续时间一般为15-20分钟，可获得较高的诱导率和三倍体率，能满足规模化生产的要求。
全文摘要
一种栉孔扇贝三倍体苗种生产技术,主要是解决影响卵子同步发育主要因素的调控技术和掌握适宜诱导参数,保证精卵质量,使卵子同步受精发育,利用6－DMAP作为诱导剂,保持一定药物浓度,掌握起始时间和持续处理时间。上述技术可用于大规模生产栉孔扇贝三倍体苗种,培育出生长快、个体大、出柱率高、抗病能力强的优良品种,经生产养成试验,可提高产量20－30%,鲜出柱率提高60%左右。
文档编号A01K61/00GK1340297SQ0011130
公开日2002年3月20日 申请日期2000年8月25日 优先权日2000年8月25日
发明者王清印, 杨爱国, 张岩, 刘志鸿 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所