专利名称：增加转基因生物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高转基因生物质的数量和质量的方法，并且将以玉米为例进行更具体地说明。
延缓具有治疗用途的重组蛋白在植物中表达的开发的因素是获得含有所述重组蛋白的植物原材料所需要的时间，这一时间不能够减少。
这一问题在诸如玉米的某些物种中显得尤为突出，因为一方面获得初级转化体所需要的时间比较长，另一方面，进行所述重组蛋白表达的器官(在这里是组织)的产量较小。因此，这种类型植物的使用，在纯化并提取所产生的重组蛋白之前，需要繁殖阶段。这些阶段对于工程动力学来说是有害的。
本发明的目的是增加第一代所获得的生物质，并因此减少为了获得大量的生物质所需要繁殖阶段的数量。这将有可能极显著地缩短研究和开发过程时间，并获得较廉价的、大量的植物原材料或生物质，同样还能缩短分析感兴趣的重组蛋白的一致性所需要的时间。
种子繁殖是一种对数现象在每一代，所获得的具有典型的可转化基因型的种子的数量大约增殖100倍，这一过程的农艺价值是较低的。根据所采用的杂交技术——回交或者自交，由可变比例的所形成的种子会含有感兴趣的基因。
本申请人业已发现，这一问题的解决方案在一定程度上有赖于增加有性繁殖之前的原始种子库，这样，有可能获得一个繁殖周期，并极迅速的获得另人满意的生物质的数量，用于在上述类型的植物中进行实验和重组蛋白生产。
因此，本发明的一个目的是增加转基因植物生物质的方法，其特征在于它包括以下步骤(a)繁殖植物愈伤组织，该愈伤组织含有一个感兴趣的遗传转化事件，并且能够再生；(b)可选地选择至少含有一个感兴趣的遗传转化事件的愈伤组织；(c)由所述愈伤组织再生完整的转基因植株，称之为原始转化体或T0植株；
(d)用非转基因花粉给所述原始转化体授粉；(e)收获所得到的种子，称之为T1，它里面至少整合了一个感兴趣的转基因；(f)播种所述转基因T1种子，并通过自花授粉或自由授粉形式让所产生的植株授粉；(g)收获T2种子。
该方法优选预先[有遗漏]还包括另一个对T2种子实施收获后表型分类的步骤。
更优选所述分类是对来自仅被用作母本的植株的T2种子进行的。在本发明的一种优选实施方案中，转基因T2种子具有不同于非转基因种子的有色表型。
特别优选的是，来自被用作父本植物和用作母本植物的植株的T2种子是彼此独立地收获的。
所述植物优选是异花授粉的，所述植物更优选是玉米。
在一种优选实施方案中，所述在用非转基因花粉授粉之前，对所述原始转化体进行割穗或去雄。
在另一种优选实施方案中，所述繁殖步骤包括产生几十个，优选大约20个拷贝的含有每一种遗传转化事件的植株。例如，对玉米来说，为了获得含有一个或多个转基因的玉米愈伤组织，可以使用用农杆菌属转化玉米的技术，涉及到使用未成熟的胚胎。该技术包括一个再生阶段，由此产生能够有效拷贝的转化体。这一拷贝过程比较容易实施，从而有可能体外获得幼小的转化T0植株，这些植株在转基因上是严格相同的。这些植株可用肉眼分离，并且是具有良好的可靠性的原始植株的拷贝。所涉及到的额外的工作相当于克隆工作，在人工气候室中培养所有的克隆，然后在温室中培养，以及通过分子分析有价值的克隆的性质而进行的控制。可以对所有的原始转化体进行所述克隆，然后，再进行一次生化筛选之后，举例来说，仅有最有价值的(有与插入片段一致的最强的表达)转化体被保留下来。
根据另一种优选实施方案，播种转基因T1种子，培养并用作父本植物。
优选地，所述转基因T1种子优选以4/2或6/2的比例与用作母本植物的非转基因植物成行地相间种植。
在这种情况下，更优选的是所述母本转基因植物是雄性不育植物。
根据上述实施方案的一种优选变体，所述母本非转基因植物是去过雄的。
最后，与父本植物相比，所述母本植物优选具有较高的农艺价值。
下面的详细说明通过非限定性实施例的形式说明了本发明的优选对玉米进行遗传转化的技术，如Y.Ishida等所述(自然生物技术，14卷，1996年6月，745-749)，要么使用粒子枪要么使用农杆菌，包括繁殖具有再生潜力的转化的愈伤组织。本发明的第一部分包括扩大由遗传转化事件所获得的再生的数量。
细胞生物学家能够检测、取样并分离源于转化事件的每一种类型的细胞，因为所述细胞能够在一种选择培养基上发育(而非转化组织不能够在所述选择培养基上繁殖)。然后，通过连续改变培养基中所含的合适植物激素的平衡，可以形成遗传上修饰过的新型植株。生物学家是根据观察愈伤组织形成的确切位点来鉴定转基因愈伤组织的。这种宏观筛选不能够区分发生在相邻细胞中的两个遗传转化事件。这就是不会从同一个原始愈伤组织中明显产生各种转化事件的风险的原因，生物学家通常让所鉴定的每一种愈伤组织的1-2个植株生长到成熟。
可以通过对其DNA进行分子分析证实有关植株是否确实源于相同的转化事件。通过用针对所述转基因的一种或多种探针进行Southern分析，通过正确选择限制酶，可以证实所述转基因确实插在同一位点。经验表明，一个有经验的细胞生物学家能够很好地筛选愈伤组织，并且由同一个愈伤组织所产生的再生在绝大多数情况下是来自同一个转化事件。因此，通过在转基因愈伤组织繁殖的常规阶段增加一个或多个额外的继代步骤，有可能增加由一个转化事件所获得的再生的数量。额外的细胞生物学工作很少，并且该方法仅比常规方法延长了3周，而一种常规方法平均需要持续29周。如上文所述，通过Southern分析控制，可以证实所获得的所有植株确实原于同一个转化事件。就所述转基因而言，它们是拷贝，尽管有可能发生体细胞克隆变异。有理由设想用这种方法产生每一种转化事件的大约20个拷贝。
常规采用的遗传转化植物的技术不能够完全控制转基因的整合选择转基因的整合位点、拷贝数量。因此，通常用一种分子结构产生几十个原始转化体，目的是让所述分子结构整合到该植物的基因组中，以便能够筛选到最佳转化体(例如，以确保仅有需要的序列存在，或者能进行正确表达)。通常，这些新产生的植株被称为原始转化体，在体外经过短暂的发育之后，驯化并在温室中生长到成熟。对玉米来说，一方面由于其育性在体外培养中所遇到的问题，另一方面为了避免通过花粉混杂的任何转化事件，最常见的是对原始转化体进行割穗(去雄)。所述转基因植物的后代是通过用非转基因花粉对转基因雌穗授粉而获得的。由于一方面用于实施所述遗传转化的玉米的品种，另一方面在体外它所经受的压力，所获得的总的T0种子数量大多在50-150之间。对于转基因的单一座位整合来说(这是最常见的)，在原始转化体上所产生的种子(被称为T1)只有50％是转基因的。这些种子可以像任何种子一样使用。如果一种转基因能够产生对一种除草剂的抗性，那么通过这种除草剂很容易筛选源于转基因种子的植株。通常，让这些植株自花授粉或自由授粉，以便获得T2种子。对于适合体外培养的这一类品种来说，世代繁殖的程度大约为100倍。由于每一个转化事件制备了大约20个拷贝，这使得能够获得每一个转化事件的大约1000个转基因T1种子(而不是传统技术的平均50个)。这样能够用最低的工作量获得足够的花粉数量，用于对非转基因植物授粉。这是本发明的第二部分。在大田中或是在温室中进行的培养，是以类似玉米杂交种的常规生产的方式进行的。在这种情况下，被用作父本的转基因植物是成行地、与被用作母本的非转基因植物相间种植的(4/2或最常见为6/2系统)。这些转基因植物优选是雄性不育植物，这样可以减少去雄的工作。所述植物是成行播种的，而不是混合播种，因为必须能够用除草剂处理雄性植株，以便能够清除没有继承所述转基因的植株(50％)。另外，成行播种还能够区分父本和母本植物的雌穗。
这一方法具有双重优点——相对没有母本的培养来说，其生物质量得到极显著地提高。我们在大田中进行的两次实验可以将生物质增加6倍收获的母本植物的生物质比父本植物的生物质多5倍；
——所述生物质的质量更好，因为用作母本的植物是杂交种，它与父本植物相比具有较高的农业附加值。可将其用作母本植物，玉米杂交种是以使用所述转基因为目标的。从第二代开始，由此获得的生物质的质量与仅用父本植物进行的工作相比，更接近于未来的工业生物质。
尽管用两种方法得到的从父本植物上收获的转基因种子的比例为75％(转基因植物本身或杂合型培养)。从母本植物上收获的种子仅有50％是转基因的。为了弥补这一缺陷，我们提出让一种能产生能够在收获后进行商业筛选的表型形状的基因与感兴趣的转基因组合。这是本发明的第三部分。就是说，例如，通过改变负责某种色素生物合成的酶，可以改变玉米种子的颜色。我们自己业已证实，通过混合具有不同颜色的玉米可以有效的，并且以极低的代价进行商业筛选。在经过判断之后，可以通过商业筛选仪用1-2次传代获得纯度超过95％的批量种子。考虑到所使用的仪器，所述筛选可以没有任何困难地进行，并且以极低的成本进行，能生产几吨重的种子。该方法如下文所述在经过杂交类型的培养之后，可以单独收获父本和母本植物[有遗漏]，然后通过表型性质筛选。随后的生产完全是转基因的。
以上结果在表1中给出，其中，可以看出的是相对常规技术而言，使用本发明可以获得高出65倍的生物质，而质量也高出1.33倍。“质量”一词在本文中是指收获的生物质中转基因种子所占的比例。而这样做所付出的额外代价很小，并且额外的时间也很短，因为它在总共52周的时间中大约只占3周(不采用本发明时是49周)。
如果不需要在感兴趣的基因上增加一个能产生特殊表现型的基因的话，仅采用本发明的前两部分就足够了。在这种情况下，所获得的生物质比常规技术多120倍；1/6的生物质的质量就与常规技术的相同，除此之外，有20倍的数量，对于5/6的生物质来说，其质量低于1/3。
在表1中，所给出的数值是平均值，它被作为比较两种技术的相对值。数量玉米种子数。质量转基因种子的对照比例。就遗传性或背景而言，所述杂交种产生的种子比父本转基因植物更接近于工业体系。
表权利要求
1.增加转基因植物生物质的方法，其特征在于它包括以下步骤(a)繁殖植物愈伤组织，该愈伤组织含有一个感兴趣的遗传转化事件，并且能够再生；(b)可选地选择至少含有一个感兴趣的遗传转化事件的愈伤组织；(c)由所述愈伤组织再生完整的转基因植株，称之为原始转化体或T0植株；(d)用非转基因花粉给所述原始转化体授粉；(e)收获所得到的种子，称之为T1，它里面至少整合了一个感兴趣的转基因；(f)播种所述转基因T1种子，并通过自花授粉或自由授粉形式让所产生的植株授粉；(g)收获T2种子。
2.如权利要求1的方法，其特征在于它还包括一个对T2种子实施收获后表型筛选的额外步骤。
3.如权利要求2的方法，其特征在于所述筛选是对源于仅被用作母本的植物的T2种子进行的。
4.如上述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述转基因T2种子的颜色表型不同于非转基因种子。
5.如上述权利要求中任一项的方法，其特征在于源于被用作父本植物和被用作母本植物的植物的T2种子是彼此分开收获的。
6.如上述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述植物是异花授粉植物。
7.如上述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述植物是玉米。
8.如上述权利要求中任一项的方法，其特征在于在用非转基因花粉授粉之前对所述原始转化体进行割穗或去雄。
9.如上述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述繁殖步骤包括产生每一个遗传转化事件的几十个，优选大约20个拷贝的植物。
10.如上述权利要求中任一项的方法，其特征在于播种所述转基因T1种子，培养并用作父本植物。
11.如权利要求10的方法，其特征在于所述转基因T1种子是优选以4/2或6/2的比例与用作母本植物的非转基因植物成行的相间播种的。
12.如权利要求11的方法，其特征在于所述母本非转基因植物是雄性不育植物。
13.如权利要求11的方法，其特征在于所述母本非转基因植物是去过雄的。
14.如上述权利要求11-13中任一项的方法，其特征在于所述母本植物与父本植物相比具有较高的农艺价值。
全文摘要
本发明涉及一种快速提高转基因生物质数量和质量的方法,特别是用于生产能产生具有治疗用途的重组蛋白的转基因植物,特别适用于玉米。
文档编号A01H1/04GK1338896SQ00803478
公开日2002年3月6日 申请日期2000年10月10日 优先权日1999年10月12日
发明者P·布尔纳特 申请人:默里斯坦治疗公司