专利名称：一种编码人溶菌酶的基因的dna序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明所属的技术领域是生物技术领域。
本发明涉及编码人溶菌酶的一种DNA序列以及此序列的植物表达载体、由此表达载体转化的植物细胞和由这些转化细胞产生的抗病原菌的转基因植物及其后代，包括植物种子、完整植株及植物体的器官、组织和细胞。
本发明的技术背景细菌、真菌和病毒是危害农作物的三大病害。其中细菌和真菌病害是世界范围内制约农作物产量的重要因素。尽管采用了多种防治措施，全球因病害造成的损失仍占粮食总产的12％。
由于植物病原微生物对各种农药逐渐产生抗药性，并且，由于农药易造成环境污染，残留的农药进入食物链后又会对人和动物的健康造成损害，因而，农药的使用受到限制。长期以来，人们一直借助传统育种方法来培育具有抵抗不同病害的新作物品种，然而，由于传统育种周期长、病原菌变异迅速和可利用的抗源匮乏等原因，致使传统育种方法难以满足需要。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性就成为一条崭新途径。
真菌和细菌细胞都具有细胞壁结构，细胞壁位于细胞表面，具有保护细胞免受机械性或渗透压的破坏、维持细胞外形的作用。
几丁质和肽聚糖分别是真菌和细菌细胞壁的主要成分。在植物、动物和微生物中都存在可降解几丁质和肽聚糖的几丁质酶和溶菌酶。利用外源几丁质酶和溶菌酶是基因工程抗病育种的一个重要方向。
几丁质酶可催化水解几丁质多聚体N-乙酰葡萄糖胺间的β-1,4-键。Broglie等(Broglie等，Science,254:1194-197,1991)把菜豆液泡几丁质酶基因导入烟草和油菜，使转基因植株对Rhizoctonia solani(立枯丝核菌)具有一定抗性，与对照相比发病轻，死亡率明显降低。之后，在烟草中又有类似报道(Zhu等，Bio/technology,12:807-812,1994；Jach等，Plant,J.,8:97-109,1995)。Lin(Lin等，Biotechnology,13:686-691,1995)和Nishizawa等(Nishizawa等，Theor.Apl.Genet,99:383-390,1999)将水稻Ⅰ类几丁质酶基因分别导入籼稻和粳稻，转基因水稻对R.solani(立枯丝核菌)和Magnaporthe grisea(水稻稻瘟病病原真菌)的抗性显著提高。相同的基因也介导了黄瓜对灰霉病的抗性(Tabei等，Plant Cell Rep.,17:15-164,1998)。
溶菌酶，又称胞壁质酶，可以水解N-乙酰胞壁酸与β-N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键。
T4噬菌体溶菌酶对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的杀菌活性，表达T4噬菌体溶菌酶的马铃薯对马铃薯软腐病病原菌Erwinia carotovora ataoseptica(胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐致病型)产生一定抗性(During等，Plant,J.,3:587-598,1993)。
人溶菌酶(human lysozyme，以下简称HL)是人体内的一种非特异性免疫因子，由130个氨基酸残基组成，分子量为14.7kD。人溶菌酶是一种双功能酶，它既能催化水解细菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4-糖苷键，还可降解真菌细胞壁的几丁质。它的溶菌活性比较高，是鸡蛋清溶菌酶的2.5倍。它也是所发现的动物溶菌酶中唯一的双功能酶(Jolles和Jolles,Molecular and cellular Biochemistry,63:165-189,1984)。
表达人溶菌酶基因(按细菌偏爱密码子优化合成)的转基因烟草对病原真菌Erysiphe cichoracearum(菊科白粉菌)和细菌P.syringae pv.tabaci(丁香假单胞杆菌烟草转化型)都表现出较强的抗性(Nakajima等，Plant Cell Rep.,16:674-679,1997)。表达人溶菌酶基因(按细菌偏爱密码子优化合成)的转基因萝卜高抗两种主要病原菌Erysiphe heraclei(独活白粉菌)和Alternaria dauci(胡萝卜链格孢)(Takaichi和Oeda,Plant Science,153:135-144,2000)。
基于HL的双酶活性，本发明试图将其应用于植物抗病育种中。但由于人HL基因中的许多密码子并非植物偏爱密码子，因此不适合在植物中高效表达。
为提高HL在植物中的表达效率，本发明按照植物偏爱的密码子，同时考虑影响mRNA稳定性的因素，修饰合成了适于在植物中表达的HL基因。
对人溶菌酶基因的分析表明(Castanon等，Gene,66:223-234,1988)，其密码子使用偏爱性与植物基因差异很大，不适合在植物中表达。为了使HL在植物中高效表达，本发明以植物偏爱密码子为主要依据，设计了HL基因。本发明设计的HL基因序列中，G+C总量从原来的20.3％提高到了51.3％，密码子第三位碱基的G+C含量由原来的41.5％提高到59.2％。
在设计中，本发明同时注意消除或避免出现一些可能影响高效表达的序列。无论是在病毒中还是在植物和动物中，RNA聚合酶(polymerase)Ⅱ会在编码mRNA3’端处终止转录，mRNA的多聚腺苷化(polyadenylation)就发生在这一终止位点。在多聚腺苷化位点上游10-33核苷酸处有一保守序列AATTAAA，通过突变研究得知，它是mRNA多聚腺苷化的识别位点，mRNA中如含有这一序列，则可能在其下游进行切割并多聚腺苷化。因此，本发明在HL基因的DNA序列设计中，避免出现AATTAAA序列及与之类似的序列，如AATAAA等序列。
另一类富含A-T序列如ATTTA序列与mRNA的稳定性有关，它是mRNA代谢的识别信号。富含A-T序列的存在，会大大降低mRNA的稳定性，缩短mRNA的半衰期，因此本发明在设计中也予避免。
由于病原菌对植物的侵染最早发生在细胞表面，并且许多病原真菌就是寄生在植物细胞的外层空间而不进入细胞内，而胞内合成的抗菌蛋白需要跨过液泡膜和质膜等才能进入外层空间，即它们不能很快接触到病菌，故限制了它们的抗菌作用，细胞破裂后则又可能造成抗菌蛋白被降解。更多的情况下，定位于胞内的抗菌蛋白可能是在植物被病原菌侵染后产生的过敏性反应中发挥作用。为提高抗菌蛋白的抑菌作用，本发明给HL基因的前端加接了大麦α-淀粉酶的前导肽，以指导表达的HL被运送到胞外，在细胞表面建立保护机制。
为了使外源基因在植物细胞转录和翻译水平得以高效表达，在外源基因侧翼必须连接有适当的表达调控元件。本发明设计了为在受体植物中高效表达上述HL基因所需的启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸序列、以及便于在适当培养基中筛选被转化细胞的选择标记等。
根据本发明的一个优选实施方案，在所构建的表达载体中，5’端非编码区由两个增强子序列、一个启动子序列、一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列和一个外源基因在植物细胞内翻译过程中起促进作用的短核苷酸序列组成。
上段提到的衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列是Ω序列。该序列富集AAC序列，在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点(Richards等，Eur.J.Biochem.,84:513-519,1987)。促进外源基因在植物细胞内翻译过程的短核苷酸序列是Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak等，Nucleic Acids Research,12:857-872,1984；Kozak M.,Cell,44:283-292,1986)。
适于本发明植物表达载体中的HL基因在植物细胞中启动该编码DNA序列转录的启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性的启动子。例如，它们包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子、甘露碱合成酶(MAS)启动子、胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子、玉米乙醇脱氢酶启动子、二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基启动子以及适于在单子叶植物中表达的Ubi、Emu、ActinI启动子等。本发明中选用的是带有加倍增强子元件的CaMV 35S启动子。此外，很多植物病害是维管束病害或是由土传病原菌引起的，因此，通过加接维管束特异表达或植物根部组织特异表达的启动子，可提高外源基因产物的抗菌作用。
根据本发明的一个优选实施方案，在所构建的高效植物表达载体中，3＇端非编码区包括一个多联终止密码子序列、一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。
另外，在适用于本发明的HL基因高效植物表达载体上还应包括衍生于花椰菜花叶病毒或胭脂碱合成酶(Nos)基因或其他基因的终止子。在本发明的一个实施方案中，我们使用了Nos基因的终止子。
使用本领域已知的方法，可将本发明提供的适于在植物细胞中表达的HL基因构建体，连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体上。这样的载体包括例如衍生于大肠杆菌的质粒载体pUCl8、pUC19(Yanisch-perron等，Gene,33:103-119,1985)，尤其是植物表达载体pBI101,pBI121,pBI131系统(Jefferson等，EMBO J.,16:3901,1987)及pCAMBIA1301(Hajdukiewicz等，Plant Mol Biol,25:989-994,1994；Hiei等，The Plant J.,6:271-282,1994)等。在本发明的一系列优选实施方案中，携带上述HL基因构建体的载体是pUC19、pBI121等，后者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体。
当然，如前所述，为正确选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组表达载体还应含有可选择标记基因。所使用的选择标记基因的两侧可带有各自的调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同载体中。本发明优选的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)基因，一同包含于同一个重组表达载体内，以保证选择被转化细胞或植株的可靠性。
归纳起来，本发明提供的适于在植物细胞中表达HL的植物表达载体包括1)HL基因表达盒a)5＇端非编码区；b)HL基因的编码区；c)3＇端非编码区。
2)来源于pBI121的载体部分a)新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)表达盒；b)起始复制子及与植物转化相关的T-DNA左右边界序列等功能结构。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的5＇端非编码区和3＇端非编码区分别具有如前所述的构成元件及其功能。例如，5＇端带有加倍增强子元件的启动子、Ω序列和Kozak序列；3＇端带有多联终止序列、正确切割和加工序列、多聚腺苷酸信号序列。
应当指出，上面所说的表达载体只是本发明的一个优选实施例，它并不构成对本发明的限制。凡是应用本发明所描述的HL基因所构建的任何表达载体均包括在本发明之内。这些表达载体包括如下实现方式
1)与其它一种或几种基因重组，构建多价基因的表达载体并转入植物；2)与其它一种或几种基因融合，构建表达载体并转入植物；3)与其它一种或几种基因相协同，分别构建植物表达载体，同时或分步导入同一种植物受体。
为在植物细胞中，特别是整株植物中表达外源抗病基因，以赋予整株植物及其种子和后代以抗病能力，必须使用适当的方法将携带HL基因的重组表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。
将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不限于1)农杆菌介导的转化法(Agrobacterium-mediated transformation)；2)物理法，如基因枪法(Particlebombardment或Particle gun或Gene gun)、电击法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Electrophoretic transfection)等；3)化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等；4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法(子房注射法)、浸泡法等；5)以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法等。
根据本发明的一个优选实施方案，本发明选择烟草作为HL基因转化的受体植物。
因此，本发明涉及编码HL基因的DNA序列，包含所说的DNA序列的高效植物表达载体，用所说的表达载体转化植物细胞、组织和整株植物的方法，以及由此产生的对植物病害具有抵抗能力的转基因植物。
本发明提供了获得抗病原菌植物的方法，该方法包括1)构建包含所说HL基因的植物表达载体；2)用任何一种可行方法将步骤1)中得到的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得抗病原菌的转基因植物及其后代，包括任何部分的植物器官、组织和种子。
应特别指出的是，虽然在下述实施例中以转基因烟草为例详细描述了本发明，但这并不意味本发明的HL基因的植物表达载体只能用于转化和生产具有抗病能力的转基因烟草。
因此，使用本发明所述的HL基因的植物表达载体，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的具有抗病能力的植物及其后代的种子和植物部分，均包括在本发明之内。以该转基因抗病植物作亲本，通过杂交或转育所产生的植株、品系或品种，亦均包括在本发明之内。
1)HL基因全长约400bp，两条链共约800个碱基。本发明将其分为16个片段合成，F1～F16(其核苷酸序列分别如SEQ NO 2-SEQ NO 17所示)。为了便于操作和手工测序，本发明利用基因中的XbaⅠ位点将其分为Ⅰ、Ⅱ两部分。第Ⅰ部分190bp，第Ⅱ部分216bp。先分别操作，最后将两部分连接；2)除第Ⅰ部分的两个5’片段F1、F8和第Ⅱ部分的两个5’片段F9、F16外，用T4DNA激酶分别将其余各片段磷酸化(在10mM ATP、T4 DNA激酶缓冲液条件下，37℃反应1小时)；3)按1∶1的摩尔比混合每部分的各片段，90℃水浴5 min后自然冷却至室温；4)将退火后的Ⅰ、Ⅱ两部分片段用T4 DNA连接酶连接，分别克隆于pUC19的BamHⅠ、XbaⅠ和XbaⅠ、EcoRⅠ位点之间；5)以克隆产物转化大肠杆菌DH5α，以蓝白菌落筛选。挑选白色菌落经HindⅢ+XbaⅠ,EcoRⅠ+XbaⅠ酶切鉴定正确；6)经筛选得到正确的Ⅰ、Ⅱ序列克隆，分别命名为pHL1和pHL2。再经XbaⅠ+EcoRⅠ双酶切回收pHL2的目的片段HL2，连接于pHL1的相应位点间，得到序列正确的HL基因的克隆pHL。经HindⅢ+XbaⅠ、EcoRⅠ+XbaⅠ、HindⅢ+EcoRⅠ、BamHⅠ+EcoRⅠ、BamHⅠ+XbaⅠ酶切及上海生物工程公司测序鉴定证明连接正确(结果见图2)。
实施例2、分泌型HL基因植物表达盒的构建如前所述，本发明利用大麦α-淀粉酶信号肽指导表达的HL分泌于胞外。将pHL通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收HL基因片段，克隆于pSC的相应位点之间，使HL基因与信号肽编码序列连接，重组质粒命名为pSH。酶切鉴定证明连接正确。
本实施例所构建的分泌型几丁质酶基因表达盒中包括以下基因表达调控元件5’端的CaMV 35S启动子、加倍的增强子、Ω序列及Kozak序列，3’端的多联终止序列、切割序列、NOS终止子。pSH经EcoRⅠ酶解后用Klenow酶补平，再以PstⅠ酶切，回收HL基因片段(约460bp)并克隆于pTΩ4A的EcoRⅠ和HpaⅠ位点间。重组质粒命名为pTSH。
实施例3、分泌型HL基因植物表达载体的构建pTSH以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收片段(约2kb)克隆于pBI121的相应位点间，得到植物表达载体pBTH。这就是所构建的分泌型HL基因植物表达载体pBTH，其质粒图谱见图3。
实施例4、冻融法转化根癌农杆菌1)从平板上挑取农杆菌LBA4404单菌落，接种于5 ml YEB培养基，28℃、250rpm摇菌培养过夜；2)取2ml菌液，加入50mlYEB培养基，28℃、250rpm摇菌培养至OD600约0.6；3)将菌液转至50ml离心管中，冰浴30分钟，然后5000rpm离心5分钟；4)弃上清，沉淀用2ml20mM CaCl2悬浮，每份100ul分装到1.5ml离心管中，液氮中保存备用；5)取2ugpBTH质粒DNA，加入到100ul感受态细胞中，混匀，冰浴5分钟；6)将离心管置液氮中冷冻5分钟，迅速转至37℃水浴中温浴5分钟；7)加入1mlYEB培养基，28℃、250rpm摇菌培养4-5小时；8)取适量菌液涂布于含抗生素的YEB平板上，28℃培养24-48小时。
实施例5、根癌农杆菌介导转化烟草1)农杆菌的活化从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5mlYEB液体培养基(Kan 100 mg/L,pH5.5)中，剧烈振荡培养至OD600为0.4～0.5(约3～4h)，5000rpm离心5min，菌体用MS液体培养基(pH5.8)重悬，至OD600为0.1～0.2；2)共培养将侵染过的叶块摆放在铺有2层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L)上，25℃暗培养4天；3)抗性芽的筛选将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)上，2～3周后即可生芽；4)生根待抗性芽长到1cm左右时，将其转移到生根培养基(MS+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)上，1～2周后即有不定根形成。
实施例6、转基因烟草的分子生物学鉴定1．植物总DNA的提取1)取1克叶片于液氮中研磨，置于50ml离心管中；2)加入6mlDNA提取缓冲液(100mM Tris HCl pH8.0,100mM NaCl,100mM EDTA，4％Sarkosyl)，混匀，冰水浴10min；3)加入6ml酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，乳化，冰水浴10min，其间混匀数次；
4)10000×g，4℃离心10min；5)取上清转移到新管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，乳化；6)10000×g，4℃离心10min；7)取上清转移到新管，加入1/10体积3M NaAc(pH4.8)和等体积预冷的异丙醇。颠倒混匀以利于DNA析出；8)用玻棒挑出丝状DNA，置于1.5ml小离心管中；9)70％乙醇漂洗数次后晾干；10)加500mlTE及RNase(至终浓度50μg/ml)溶解DNA；11)37℃温育60min；12)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇和氯仿∶异戊醇各抽提一次；13)上清加入1/10体积3M NaAc(pH4.8)和2倍体积的无水乙醇；14)-20℃放置15min；15)12000×g,4℃离心10min；16)沉淀用70％乙醇漂洗一次，离心，晾干；17)加适量TE溶解。
2．Southern检测1)取转基因植株叶片提取总DNA；2)取20μg总DNA，以PstⅠ和EcoRⅠ充分酶解；3)以pTSH/PstⅠ+EcoRⅠ为阳性对照，以未转基因植株总DNA的双酶切产物为阴性对照，进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳；4)电泳结束后，切去胶的左下角为记号；5)将胶置于10倍体积的0.25mol/L HCl中处理30min，然后用蒸馏水漂洗；6)将胶置于10倍体积的0.4mol/L NaOH中处理30min；7)用滤纸包裹一块稍大于凝胶的玻璃板，置于0.4mol/L NaOH上方，仅使滤纸接触液体，将凝胶置于湿润后的滤纸上，赶出气泡，并以Parafilm封边；8)取一张长宽比凝胶约略大的带正电荷尼龙膜，首先用重蒸水浸润，然后在0.4mol/L NaOH中浸泡10min，置于凝胶上，赶出气泡；9)用0.4mol/L NaOH浸润2张与凝胶同样大小的滤纸，放在尼龙膜上方，赶出气泡。注意不要使滤纸接触凝胶下的滤纸，以防短路；10)切一叠略小于滤纸的吸水纸，放在滤纸上方，吸水纸上放一块玻璃板，再压一500g的重物；11)转移≥2h；12)转移结束后，将尼龙膜在2×SSC中漂洗后于室温下晾干，待用；13)预杂交将结合有DNA的带正电荷尼龙膜置于6×SSC中浸润2min。放入杂交瓶中，按每平方厘米100μl的量加入预杂交液；预杂交液/杂交液5×SSC5×Denhardt1％SDS100μg/ml变性鲑精DNA置杂交炉内，68℃温育15min。
14)探针的制备(采用Prime-a-gene labeling kit,Promega)以pHL的EcoRⅠ+HindⅢ双酶切回收的germin基因片段(400bp)为探针。在500μl离心管中依次加入下列试剂5×标记缓冲液 10μldNTP混合物(无dCTP)2μl变性DNA模板 25ng10mg/ml BSA 2μlα-32P-dCTP 5μlKlenow酶 1μl(5U/μl)加重蒸水至50μl混匀后在室温下反应60min，沸水中变性2min后立即置于冰水中，加EDTA至20mM。
15)配制预杂交液/杂交液，并预热至68℃，加入杂交瓶，再加入热变性的探针，68℃杂交过夜。
16)洗膜取出尼龙膜，在2×SSC、0.1％SDS中于室温洗膜2次，每次5min。然后在2×SSC、0.1％SDS中室温洗膜2次，每次5min。如必要，则继续在2×SSC、0.1％SDS中于42℃洗膜2次，每次15min，进而在2×SSC、0.1％SDS中于68℃洗膜2次，每次15min。最后在2×SSC中漂洗，用滤纸吸干液体，保鲜膜包裹，进行放射自显影。
结果表明，一些转基因烟草的Southern为阳性，见图4。
3．Western杂交检测1)取100mg植物组织，加于200μl 2×SDS聚丙烯酰胺凝胶上样缓冲液中研磨，然后100℃处理3min，取15μl于15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；2)胶用Bio-Rad Semi-dry Transfer Cell转移1h至硝酸纤维素膜；3)滤膜在丽春红染色液中染色5min；4)在水中脱色2min，蛋白带出现后，在水中漂洗滤膜彻底脱色；5)封闭TTBS(100mM Tris-HCl,pH7.4；0.9％NaCl；0.1％Tween20)，室温轻摇30～60min；
6)杂交兔抗人溶菌酶抗体1∶200稀释于TTBS中，摇动；7)洗膜TTBS室温下连续摇动洗4次，每次5min；8)二抗羊抗兔碱性磷酸酶(IgG-AP)按1∶1000稀释于TTBS中，于室温下连续摇动30～60min；9)洗膜同上述步骤7)；10)NBT/BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑)缓冲液中显色，显色后，用蒸馏水漂洗滤膜以终止反应。
结果表明，外源HL蛋白在转基因植株中得到表达，见图5。
注丽春红染色液(使用时配制)丽春红S 0.5g冰乙酸 1ml加双蒸水至 100mlNBT贮液NBT 50mgDMF(二甲基甲酰胺)700μl双蒸水 300μlBCIP贮液BCIP 50mgDMF 1ml碱性磷酸酶缓冲液Tris.HCl 100mM pH9.5NaCl 100mMMgCl25mMNBT/BCIP缓冲液5.5mlNBT贮液 33 ul碱性磷酸酶缓冲液 5ml混匀后加入BCIP贮液17μl附本发明所涉及的DNA序列SEQ NO 1(HL全基因的DNA序列)5’AAG GTG TTC GAG AGA TGC GAG TTG GCT AGG ACC CTT AAG AGATTG GGA ATG GAC GGT TAC AGG GGT ATC TCT CTC GCC AAC TGGATG TGC TTG GCT AAG TGG GAG AGC GGA TAC AAC ACC AGA GCTACT AAC TAC AAC GCT GGA GAT AGG AGC ACT GAC TAC GGT ATCTTC CAG ATC AAC TCT AGA TAC TGG TGC AAC GAC GGA AAG ACCCCA GGA GCT GTT AAC GCT TGC CAT CTC TCC TGC TCG GCT TTGCTT CAA GAT AAC ATT GCT GAT GCT GTT GCT TGC GCT AAG AGGGTG GTT AGA GAT CCA CAA GGT ATC AGC GCT TGG GTT GCC TGGAGA AAC AGG TGC CAA AAC AGA GAC GTT AGG CAG TAC GTG CAAGGT TGC GGA GTG 3′SEQ NO 2:F1: 5＇ag ctt gga tcc aag gtg ttc gag aga tgc gag ttg gct agg acc ctt 3＇SEQ NO 3:F2: 5＇aag aga ttg gga atg gac ggt tac agg ggt atc tct ctc gcc aac tg 3＇SEQ NO 4:F3: 5＇g atg tgc ttg gct aag tgg gag agc gga tac aac aac aga gct act aac 3＇SEQ NO 5:F4: 5＇tac aac gct gga gat agg agc act gac tac ggt atc ttc cag atc aac t 3＇SEQ NO 6:F5: 5＇a tct ctt aag ggt cct agc caa ctc gca tct ctc gaa cac ctt gga tcc a 3＇SEQ NO 7:F6: 5＇gca cat cca gtt ggc gag aga gat acc cct gta acc gtc cat tcc ca 3＇SEQ NO 8:F7: 5＇c gtt gta gtt agt agc tct ggt gtt gta tcc gct ctc cca ctt agc caa 3＇SEQ NO 9:F8: 5＇ct aga gtt gat ctg gaa gat acc gta gtc agt gct cct atc tcc ag 3＇SEQ NO 10:F9: 5＇ct aga tac tgg tgc aac gac gga aag acc cca gga gct gtt aac gct tgc c 3＇SEQ NO 11:F10:5＇at ctc tcc tgc tcc gct ttg ctt caa gat aac att gct gat gct gtt gct tgc g 3＇SEQ NO 12:F11:5′ct aag agg gtg gtt aga gat cca caa ggt atc agg gct tgg gtt gcc tgg aga a 3＇SEQ NO 13:F12:5＇ac agg tgc caa aac aga gac gtt agg cag tac gtg caa ggt tgc gga gtg taa g 3＇SEQ NO 14:F13:5＇ga gag atg gca agc gtt aac agc tcc tgg ggt ctt tcc gtc gtt gca cca gta t 3＇SEQ NO 15:F14: 5＇ct ctt agc gca agc aac agc atc agc aat gtt atc ttg aag caa agc gga gca g 3＇SEQ NO 16:F15:5＇ca cct gtt tct cca ggc aac cca agc cct gat acc ttg tgg atc tct aac cac c 3＇SEQ NO 17:F16: 5＇aa ttc tta cac tcc gca acc ttg cac gta ctg cct aac gtc tct gtt ttg g 3＇
权利要求
1．一种编码人溶菌酶基因的DNA序列，其特征是该DNA序列具有如SEQ NO1所示的DNA序列；
2．权利要求1的编码人溶菌酶基因的DNA序列，其中所说的DNA序列包括该DNA序列的同源序列；
3．权利要求1的编码人溶菌酶基因的DNA序列，其中所说的DNA序列包括该DNA序列的部分序列；
4．一种嵌合基因，其特征是该嵌合基因包含权利要求1到3的DNA编码序列；
5．一种用于转化植物细胞的载体，其特征是该载体包含权利要求4的嵌合基因；
6．一种转化植物细胞，其特征是该转化植物细胞含有权利要求5的载体；
7．一种转化植物，其特征是该转化植物来自于权利要求6的转化植物细胞；
8．权利要求7的转化植物，其中所说的转化植物包括但不限于转化植物及其后代，包括植物种子、完整植株及植物体的器官、组织和细胞；
9．权利要求7的转化植物，其中所说的转化植物具有抗植物病原性；
10．权利要求7的转化植物，其中所说的转化植物是转基因烟草。
全文摘要
本发明涉及编码人溶菌酶的一种DNA序列以及此序列的植物表达载体、由此表达载体转化的植物细胞和由这些转化细胞产生的抗病原菌的转基因植物及其后代,包括植物种子、完整植株及植物体的器官、组织和细胞。
文档编号A01H1/06GK1300852SQ0110396
公开日2001年6月27日 申请日期2001年2月16日 优先权日2001年2月16日
发明者贾士荣, 王冰山 申请人:中国农业科学院生物技术研究所