专利名称：转基因抗菌肽家蝇繁育蝇蛆中提取基因抗菌肽用于种子包衣添加剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及种子包衣技术，特别是转基因抗菌肽家蝇繁育蝇蛆中提取基因抗菌肽用于种子包衣添加剂。
农作植物病害包括细菌、真菌和病毒病害。青枯病是一种细菌性病害，对马铃薯危害可减产25％，严重时导致绝收。中国农科院生物技术研究中心将人工合成抗菌肽基因导入我国马铃薯主栽品种米拉，获得抗病性提高1-Ⅲ级的转基因马铃薯株系。目前，抗菌肽基因，已经供给国内外10多个研究单位，进行抗水稻白叶枯病、马铃薯软腐病、花生和番茄的青枯病、大白菜软腐病、柑桔细菌性溃疡病、桑树和桉树青枯病、樱桃根肿病等基因工程的研究。
抗真菌病害的基因工程研究近几年很活跃，科学家们已经把几丁质酶基因、葡聚糖酶基因转入烟草，转基因烟草表现抗病作用。此外，抗病毒的基因工程国内进展也很快。中科院微生物研究所、北京大学已得到抗烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的转基因烟草，并在东北、山东、河南等地区大面积试种。在水稻研究中已获得了抗矮缩病毒的基因工程植株。不少单位也将抗菌肽基因相继在水稻、大豆、番茄等作物上做试验获得很好效果，将抗菌肽基因转到水稻里，培育出的植株能抗水稻常见的白叶枯病，并能稳定遗传。
目前防治农作物病害仍然大量使用喷洒型、带毒性的化学农药为主，对环境有严重污染，严重危害人类的生存和健康。转基因技术将抗病基因直接转入农作物中，因它是取之自然物种，方法先进，贴近自然，对环境和人类健康意义重大。现在研究证实1、抗菌肽广泛存在于动物(昆虫)、植物和微生物体内，采用一般提取纯化方法难于获取大量抗菌肽。
2、正常生物体内抗菌肽降低或消失，就会出现细菌、真菌、病毒等感染而发生病害。
3、生物体在一定条件诱导下如物理学、化学、生物学等都能提高抗菌肽含量。用现代生物技术，重组抗菌肽基因均能在不同生物体内互相转移一即转基因抗菌肽，如柞蚕抗菌基因可转入沙田柚。
4、提取、纯化的抗菌肽包括天然的、合成的、基因的，其结构功能和特异性差异很小，也就是说种属差异性不明显，只有因抗菌肽种类不同作用强弱，范围有存在差异。因此，同一种抗菌肽可以用于不同动、植物和微生物，如基因酵母菌抗菌肽可以抗植物的病原微物。
本发明的目的是利用种子包衣技术，提供一种转基因家蝇繁育蝇蛆中提取基因抗菌肽用于种包衣添加剂，来防治农作物病虫害，取代现代化学药物。
转基因抗菌肽家蝇繁育蝇蛆中提取基因抗菌肽用于种子包衣添加剂，每100ml中包括，抗菌肽500-1000单位，吸水剂0-1％，磷矿粉2.5％,1065粉2.5％，硫酸锌1％，甲基纤维4％，硼砂0-1.5％，石膏粉0-5％，加水至100ml。
按每公斤包衣剂加5000-10000单位基因抗菌肽活性蛋白，用0.5％-1％的吸水剂进行种子涂层处理，晾干，再将可作粘着剂用的4％甲基纤维素溶液按40ml拌0.5kg种子的比例充分拌匀，放入包衣机，边旋转边加入制衣材料，并不断稍加(在包衣中)喷水，待种料比1∶(4-5)时即可。
一、转基因抗菌肽蝇蛆繁育提取工艺流程家蝇虽然没有完善的免疫防御体系，但却具有高效的无细胞免疫系统。抗菌肽是家蝇免疫后血淋巴中的一类抗菌多肽，它具有分子量小，热稳定，水溶性好，无免疫原性，抗菌谱广等特点。现在，它被认为是从细菌到高等哺乳动物普遍存在的一类防御性多肽，称之为“第二防御体系”。抗菌肽不仅抗菌谱广，而且可以抑杀某些真菌、病毒及原虫，并对多种癌细胞及动物实全瘤有明显的杀伤作用，而不破坏正常细胞。
抗菌肽即将成为一代新的抗菌、抗病毒抗癌药物。但天然抗菌肽的来源少，成本高，无法满足实际应用的需要。因此我们通过DNA重组技术实现转基因抗菌肽蝇蛆繁育家蝇收集蝇蛆获得大量抗菌肽已成为现实。其工艺流程是抗菌肽基因工程家蝇的构建→扩大工程蝇繁育→收集蝇蛆→蝇蛆灭菌技术处理→蝇蛆抗菌肽含量测试→低温深冻、贮存原料→低温粉碎、制成超微匀浆→抽提去除杂质→浓缩→分离干燥→鉴定各项指标→调配不同规格制品→用于科子包衣添加剂。
该工艺具有如下显著优点工艺过程简便；技术稳定，具有很高的重复性；表达效率高，抗菌肽的收率可达到0.60mg/ml；规模灵活，改变工艺规模时不需要重新通过中试校验工艺参数；转基因工程家蝇蝇蛆繁育快，含量高，原料供应丰富并且价格低廉，适宜规模化生产。
二、基因抗菌肽用于种类包衣添加剂的作用特点抗菌肽是一种有35个氨基酸组成的多肽化合物，其分子量为3835道尔顿，等电点大约为10左右，具有优良的耐热性，对极端的PH值环境和离子强度环境也具有优良的抗性，同时，抗菌肽对胃蛋白酶具有一定程度的耐受性。
抗菌肽N端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，C端富含丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸等非极性氨基酸并且酰胺化，其中间部坠毁则富含脯氨酸。通过对抗菌肽的圆二色性分析，抗菌肽表明能够在一事实上条件下形成α-螺旋和β-折叠。抗菌肽的α-螺旋具有近科完美的两亲性，被普遍认为是抗菌肽活性的结构基础。抗菌肽除了表现出对细菌具有强大的杀伤作用外，还表现出了对肿瘤细胞和真菌以及部分病毒的强大杀伤作用。种子进行种衣剂包衣，是集多学科成果于一体的综合性高新技术，基因抗菌肽作为添加剂是增加科技含量的重要组成部分，也是防制农作物病害重要措施，有十分显著的经济效益。
三、基因抗菌肽种子包衣添加剂的应用范围将基因抗菌肽现代生物工程技术应用于种子包衣，是一种新型种衣添加剂可广泛用于小麦、玉米、花生、芝麻、大豆以及蔬菜、水果、花卉等和种衣添加剂。它是一种可有效杀死真菌的蛋白质，杀菌力强，抗菌谱广，分子量小。对动物(包括人体)及植物无毒、无害，对环境也不会造成污染，是一种符合现代农业要求的环保型生物农药。
实施例1芝麻是重要的经济作物，为了解决与小麦腾荐接口，控制病害发生，提高单位产量，节省种子，用基因抗菌肽制作芝麻的包衣，这是因为包衣处理芝麻给芝麻穿上一层融吸水、营养、杀虫杀药保护衣，对苗期病菌害防治效果达100％，增产效果达45％以上，而且籽粒饱满，成熟度高，1000粒增重明显，具体实施方法是按每公斤包衣剂加8000单位活性基因抗菌肽蛋白，用1％吸水剂进行芝麻种子净层处理，晾干，再将4％甲基纤维溶解液粘着剂按40ml拌0.5公斤芝麻种子的比例充分拌匀放入大盆，用棒旋转搅拌使其将种子均匀，此不断加2.5％磷矿粉，2.5％1065粉，1％硫酸锌，边加边喷水，待种料成1∶6即可。用此种办法处理，可随处理随时播种，也可存放20天内，若长期贮存可在最后工序中加膜制剂使芝麻种子外形成一层膜，以保护营养水份及相关成分不丢失和失活。
实施例21、首先称取10公斤待包衣种子，置于盆式器皿中或足够大的塑料薄膜上。然后将含有8000单位基因抗菌肽，1公斤乳剂倒在种子上，用不伤害种子的木棍或其它可以搅拌的工具，将种子与乳剂搅拌，或用手看着塑料薄膜的四个角反复折混，直到包衣均匀。
2、将包了衣的种子分散摊放在塑料薄膜上或干净的地面上，在无阳光直接照射的地方，自然风干后即可播种。
3、最好在播种前一天包衣，风干至不粘即可播种。若有必要可以采用机械方法按上述过程包衣。
注乳剂中可按一定上比例复合配有强力吸收剂，微肥，稀土元素、微量元素，植物调节剂、抗菌肽生物农药，抗旱节水，营养调节为一体，获更大经济效益，社会效益与环境效益。
权利要求
1.转基因抗菌肽家蝇繁育蝇蛆中提取基因抗菌肽用于种子包衣添加剂，每100ml中包括，抗菌肽500-1000单位，吸水剂0-1％，磷矿粉2.5％1065粉2.5％，硫酸锌1％，甲基纤维4％，硼砂0-1.5％，石膏粉0-5％，加水至100ml。
2.根据权利要求1所述的基因抗菌肽用于种子包衣添加剂，按每公斤包衣剂加5000-10000单位基因抗菌肽活性蛋白，用0.5％-1％的吸水剂进行种子涂层处理，晾干，再将可作粘着剂用的4％甲基纤维素溶液按40ml拌0.5kg种子的比例充分拌匀，放入包衣机，边旋转边加入制衣材料，并不断稍加(在包衣中)喷水，待种料比1∶(4-5)时即可。
3.根据权利要求1所述的基因抗菌肽用于种子包衣添加剂，按每公斤包衣剂加8000单位活性基因抗菌肽蛋白，用1％吸水剂进行芝麻种子净层处理，晾干，再将4％甲基纤维溶解液粘着剂按40ml拌0.5公斤芝麻种子的比例充分拌匀放入大盆，用棒旋转搅拌使其将种子均匀，不断加2.5％磷矿粉，2.5％1065粉，1％硫酸锌，边加边喷水，待种料成1∶6即可。
4.转基因抗菌肽家蝇繁育蝇蛆中提取基因抗菌肽用于种子包衣添加剂，含转基因抗菌肽家蝇繁育蝇蛆中提取基因抗菌肽和种子包衣添加剂可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及种子包衣技术,特别是转基因抗菌肽家蝇繁育蝇蛆中提取基因抗菌肽用于种子包衣添加剂。用蝇蛆原料提取,真空冷冻干燥成为基因抗菌肽生物制品,用于种子包衣添加剂,抗农作物细菌、病毒和真菌,取代化学农药,它有效杀死真菌蛋白质,杀菌力强,抗菌谱广,分子量小,对人、动物和植物无毒、无害、无环境污染,是符合现代农业要求的环保型生物农药。
文档编号A01N59/26GK1312003SQ0110636
公开日2001年9月12日 申请日期2001年3月26日 优先权日2001年3月26日
发明者苟仕金, 苟鸿鹰, 王成余 申请人:辽宁天成生物制药研究所