专利名称：醋酸锂介导的香菇基因转移技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及食用菌基因工程技术。
近几年来，食用菌基因工程研究取得了长足的进展，一批目的基因已被克隆出来，但在食用菌遗传转化方面有关的报道较少，在国内，有人利用电击法将糙皮侧耳的总DNA导入紫孢侧耳，获得了转化菌株；在国外，有将潮霉素抗性基因转入糙皮侧耳和双孢蘑菇，URAI基因转入柳松菇和结实基因(Frt1)转入裂褶菌等。上述转化利用的主要是氯化钙/聚乙二醇(CaCl2/PEG)介导原生质体转化和电击法。在香菇基因转移方面，仅有日本岩手大学建立的限制酶/聚乙二醇介导的一种转化技术，但该技术中使用的限制性内切酶价格昂贵，转化成本较高。
本发明的目的在于提供一种简便、经济、有效的醋酸锂介导的香菇基因转移技术。
本发明包括外源目的基因的提取和纯化、受体原生体质的制备、外源目的基因的导入和转化、原生质体的筛选和鉴定四个部分；各过程内容如下1、外源目的基因的提取和纯化过程采用常规的“碱裂解法”来提取质粒DNA，提取后的质粒DNA采用聚乙二醇分级沉淀法纯化，用紫外吸收法检测质粒DNA浓度和纯度，浓度要求达到1毫克/毫升，纯度要求达到OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥2.0，并在1％水平琼脂糖凝胶上电泳，检测质粒大小，然后放入-20℃冰箱内待用；2、受体原生质体的制备为防止原生质体破裂，在原生质体的酶解液中加入一定的压力，以浓度为0.4～0.8摩尔的甘露醇或蔗糖或氯化钾作为渗透稳定剂，在渗透稳定剂中加入溶壁酶，配制浓度1.5～3％的溶壁酶酶解液，取培养3～10天的香菇菌丝球，放入酶解液中，在20～35℃条件下进行酶解，制备受体原生质体，经过滤纯化，得到原生质体纯液，纯液中受体原生质体浓度在106个/毫升以上；3、外源目的基因的导入按以下步骤进行(1)取制备好的受体原生质体纯液，进行离心，弃上清液，再用浓度0.6摩尔甘露醇洗涤一离心2次以上，洗去培养基的成份；(2)加入起介导作用的浓度为0.1～0.5摩尔的醋酸锂(LiAc)与受体原生质体混合，进行高速离心，吸除醋酸锂，再用0.1～0.5摩尔的醋酸锂与受体原生质体混合，调整受体原生质体浓度，要求受体原生质体数在106～109个/毫升之间；(3)制备外源运载DNA，用于提高转化效率将单链运载DNA加入DNA缓冲液中，浓度为2微克/毫升，煮沸，然后迅速在冰水中冷却，待用；(4)取第(2)步得到的原生质体进行离心，去掉醋酸锂，得到前处理的纯原生质体；(5)在纯原生质体中依次加入浓度50～60％的聚乙二醇、浓度为1.0～1.2摩尔的醋酸锂、外源运载DNA、外源质粒DNA和无菌水，构成反应液，体积比为聚乙二醇占50～60％，醋酸锂10～15％，外源运载DNA12～15％，其余为无菌水，使反应液中受体原生质体数在106～109个/毫升之间；质粒DNA含量1.0～20微克/毫升；(6)用力充分混匀反应液，然后在25～35℃下培养；(7)在35～45℃水浴中摇动培养20～40分钟；(8)将反应液离心，然后将转化混合物吸除，得到转化后的原生质体；(9)在MYG(麦芽糖0.5％、酵母粉0.5％、葡萄糖1％、其余为水)培养基中加入蔗糖，使培养基的蔗糖浓度为0.4～0.6摩尔，将转化后的原生质体与培养基混合，摇动培养20小时以上，然后移入固体培养基上培养。
3、转化原生体质的筛选和鉴定(1)根据报告基因鉴定将前述(9)经过摇动培养的原生质体与培养基的混合液离心，吸除上清液，加入蔗糖浓度为0.4摩尔的MYG培养基和X-Glux检测液，在30～40℃下摇动培养20小时以上，再在2～10℃下培养48小时以上，然后在光学显微镜下检兰色原生体质，计算转化率；(2)根据选择抗性标记基因筛选根据转化质粒携带的卡那霉素抗性标记基因，在MYG培养基中加入卡那霉素，形成选择培养基，将上述(9)培养的原生质体平铺于选择培养基上，在20～30℃下培养，对形成的菌落进行多聚酶链式反应(PCR)检测，对检测阳性菌株，进行分子杂交(Southern Blot)分析，呈阳性的菌株进一步培养利用。
本发明的优点如下1、提高了转化效率。本发明的转化率约为104转化子/微克质粒DNA，而氯化钙/聚乙二醇(CaCl2/PEG)介导法的转化率为103转化子/微克质粒DNA，前者是后者的十倍。
2、转化成本低。本发明不需要特殊的仪器设备，电击法所用的脉冲仪，国产价格为3万元左右，进口价格为10万元左右；与限制酶/聚乙二醇法相比，处理1毫克原生质体所需限制酶的成本为5000元人民币，本发明处理同量的原生质体所需醋酸锂的成本仅为1元人民币。
3、本发明提供的方法所需设备和条件简单，操作过程容易掌握，在一般实验室的条件下均能进行，便于普及推广。
实施例将外源目的基因质粒载体PGBI131SABC转化到香菇L26上，该质粒携带BT毒蛋白基因和豇豆胰蛋白酶抑制素基因(CPTI)，另外还带有卡那霉素抗性选择标记基因和β-葡萄糖苷酸酶报告基因。
1、受体原生质体的制备以浓度为0.6摩尔甘露醇作为渗透稳定剂，配制2.5％的溶壁酶酶解液，取培养5天的“香L26”香菇菌丝球，加入酶解液中，在30℃条件下进行酶解，制备原生质体，过滤纯化，纯化后的原生质体浓度为106个/毫升；2、外源目的基因的导入按以下步骤进行(1)取制备好的原生质体纯液30毫升，在3000转/分条件下离心5分钟，弃上清液，用浓度0.6摩尔甘露醇洗2遍；
(2)加入20毫升浓度为0.1摩尔的醋酸锂(LiAc)与原生质体混合，在最高速下离心15秒，吸除醋酸锂，再用0.1摩尔的醋酸锂混合原生质体，调整原生体质浓度，使原生质体数在3×106个/毫升；(3)制备外源运载DNA，将单链运载DNA小牛胸腺肽或鲑鱼精子DNA加入TE缓冲液中，浓度为2微克/毫升，制备15毫升，煮沸5分钟，然后迅速在冰水中冷却，待用；(4)取第二步得到的原生质体14毫升离心，去掉醋酸锂；(5)向原生质体中依次加入浓度为50％的聚乙二醇60毫升，浓度为1.0摩尔的醋酸锂10毫升，运载DNA14毫升、浓度为1毫克/毫升PGBI131SABC质粒DNA1毫升，其余用无菌水，使其终体积为100毫升；(6)用力充分混匀混合液，然后在30℃下培养30分钟；(7)在42℃水浴中摇动培养30分钟；(8)在8000转/分钟离心15秒，然后将转化混合物吸除；(9)在MYG培养基中加入蔗糖，使培养基的蔗糖浓度为0.4摩尔，将转化后的原生质体与培养基混合，摇动培养24小时，然后移入固体培养基上培养。本实施例可获得约106个具有抗虫基因的转化原生质体。
权利要求
1.醋酸锂介导的香菇基因转移技术，采用常规的“碱裂解法”来提取外源目的基因的质粒DNA，提取后的质粒DNA采用PEG分级沉淀法纯化，用紫外吸收法检测质粒DNA浓度和纯度，浓度要求达到1毫克/毫升，纯度要求达到OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥2.0，并在1％水平琼脂糖凝胶上电泳，检测质粒大小，然后放入-20℃冰箱内待用，其特征在于其方法还包括A、受体原生质体的制备；以浓度为0.4～0.8摩尔的甘露醇或蔗糖或氯化钾作为渗透稳定剂，在渗透稳定剂加入溶壁酶，配制浓度1.5～3％的溶壁酶酶解液，取培养3～10天的香菇菌丝球，放入酶解液中，在20～35℃条件下进行酶解，制备受体原生质体，经过滤纯化，使受体原生质体浓度在106个/毫升以上；B、外源目的基因的导入按以下步骤进行(1)取制备好的受体原生质体纯液，进行离心，弃上清液，再用浓度0.6摩尔甘露醇洗涤—离心2次以上，洗去培养基的成份；(2)加入浓度为0.1～0.5摩尔的醋酸锂与受体原生质体混合，进行高速离心，吸除醋酸锂，再用0.1～0.5摩尔的醋酸锂与受体原生质体混合，调整受体原生质体浓度，要求受体原生质体数在106～109个/毫升之间；(3)制备外源运载DNA将单链运载DNA加入缓冲液中，浓度为2微克/毫升，煮沸，然后迅速在冰水中冷却，待用；(4)取第(2)步得到的原生质体进行离心，去掉醋酸锂，得到前处理的纯原生质体；(5)在纯原生质体中依次加入浓度50～60％的聚乙二醇、浓度为1.0～1.2摩尔的醋酸锂、外源单链运载DNA、外源质粒DNA和无菌水，构成反应液，体积比为聚乙二醇占50～60％，醋酸锂10～15％，外源运载DNA12～15％，其余为无菌水，使反应液中受体原生质体数在106～109个/毫升之间；质粒DNA含量1.0～20微克/毫升；(6)充分混匀反应液，然后在25～35℃下培养；(7)在35～45℃水浴中摇动培养20～40分钟；(8)将反应液离心，然后将转化混合物吸除，得到转化后的原生质体；(9)在MYG培养基中加入蔗糖，使培养基的蔗糖浓度为0.4～0.6摩尔，将转化后的原生质体与培养基混合，摇动培养20小时以上，然后移入固体培养基上培养。
2.根据权利要求1所说的醋酸锂介导的香菇基因转移技术，其特征在于渗透稳定剂为甘露醇。
3.根据权利要求1所说的醋酸锂介导的香菇基因转移技术，其特征在于单链运载DNA为小牛胸腺肽或鲑鱼精子DNA。
全文摘要
醋酸锂介导的香菇基因转移技术。受体原生质体的酶解液中加入渗透稳定剂,外源目的基因的前处理以醋酸锂为介导质,在原生质体中依次加入聚乙二醇、醋酸锂、单链运载DNA、外源质粒DNA和无菌水,构成反应液。将反应液培养、离心、分离混合物,得到转化后的原生质体;将转化后的原生质体与培养基混合,摇动培养,然后移入固体培养基上培养。本发明转化效率高,转化成本低,所需设备和条件简单,便于普及推广。
文档编号A01H1/00GK1384202SQ0111392
公开日2002年12月11日 申请日期2001年4月29日 优先权日2001年4月29日
发明者王丕武, 李玉, 于彦春, 武丽敏 申请人:吉林农业大学