专利名称：：改良禾本科作物品质的方法
技术领域：
：本发明涉及改良禾本科作物品质的方法，具体地说利用植物基因工程技术改良作物的品种，即利用高赖氨酸蛋白基因转化禾本科作物，从而提高禾本科作物种子中蛋白质和赖氨酸含量。随着我国农产品产量的增加和人民生活水平的提高，主要农作物品质较差的问题更加突出，导致杂交水稻和棉花的大量积压，不仅满足不了人民生活水平的需要，更难进入国际市场。而利用植物基因工程改良作物营养及加工品质在国际上已成为研究热点之一，其应用潜力不仅仅在于提高初级农产品本身的价值，更涉及到加工成本的降低、加工工艺的简化、产品市场竞争力的提高等相关联的多个环节。赖氨酸作为人及单胃动物所必需的氨基酸，在主要禾谷类作物如玉米、水稻、小麦的种子中含量很低，成为主要的限制性氨基酸，严重影响了其营养品质。通过转基因的途径提高作物种子的赖氨酸含量，目前主要有以下两个方面的进展1．人工改造或设计高赖氨酸蛋白基因先锋种子公司(PionnerHi-bredInc.)曾通过改造天然的基因编码，用必需氨基酸替代天然蛋白中的部分非必需氨基酸，从而达到提高必需氨基酸含量的目的，利用该方法所设计的高赖氨酸蛋白基因，其编码的蛋白赖氨酸含量约14％(重量比)。先锋种子公司对该研究方法拥有专利(WO9410315)。另外，少数文献所报道的从头合成(demovosynthesis)高赖氨酸蛋白基因的工作，完全是设计出自然界不存在的基因，难以全面了解其所编码的蛋白的特性，目前只在转基因模式植物(烟草)的种子上获得表达(Othanietal.,1991；Keeleretal.,1997)。进行国际专利检索没有发现有关从头合成高赖氨酸蛋白基因的专利。2．天然高赖氨酸蛋白基因夏威夷大学(HaiwaiiUni.)对从四棱豆中所克隆的一个高赖氨酸蛋白基因拥有专利(WO9707665)。该基因所编码的蛋白赖氨酸含量约为11％(重量比)。本发明人从马铃薯花粉中克隆的cDNA片段，其编码的蛋白质赖氨酸含量达到19％(重量比)，远远高于迄今已报道的天然或经改造过的高赖氨酸蛋白。将此cDNA与玉米19Z种子特异表达启动子构建植物表达载体转化玉米，在转基因玉米种子中赖氨酸含量最高达种子干重的0.48％，蛋白质达种子干重的15％，而且高赖氨酸蛋白基因可以稳定遗传，R2,R3代株系中赖氨酸平均含量比对照提高25-35％，个别植株提高50％以上，蛋白质提高10％，个别植株提高38％。本发明的目的是利用转基因技术改良禾本科作物的品质，即通过将来自马铃薯花粉的编码高赖氨酸蛋白的cDNA转化到玉米、水稻等禾本科植物，以获得种子中蛋白质和赖氨酸含量明显提高的禾本科植株。附图简述图1．PCR产物电泳检测laneA；PCR产物；laneB；DNA/HindⅢ/EcoRⅠ分子量标准；图2．植物表达载体p19zKH的构建；图3．抗性愈伤的筛选及分化，图3A，筛选六周后玉米抗性愈伤；图3B．抗性愈伤分化出芽；图4．玉米再生植株，图4A．温室中玉米再生植株；图4B．再生植株结穗；图5．转基因玉米的Southern杂交，图5A．R0代再生植株的Southern杂交；图5B．R1代再生植株的Southern杂交；图5C,R2代再生植株的Southern杂交；图6．R2代转基因玉米种子的Northern杂交；图7．R2代转基因玉米种子的Western杂交；表转基因玉米植株中赖氨酸含量的遗传稳定性分析；本发明按照如下所述方法实现的将马铃薯花粉中特异表达的编码高赖氨酸蛋白的cDNASB401与玉米花粉特异表达19Z启动子，来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域构成植物转化载体。将该载体用基因枪轰击玉米愈伤组织，获得种子中蛋白质和赖氨酸含量提高的玉米植株。利用本发明的方法制备的转基因玉米种子中赖氨酸含量最高达种子干重的0.48％，蛋白质达种子干重的15％，而且高赖氨酸蛋白基因可以稳定遗传，R2,R3代株系中赖氨酸平均含量比对照提高25-35％。将该PCR产生的片段用E.coliT4DNA聚合酶进行末端补齐，并插入到pUCl9SmaⅠ位点，得到阳性克隆pCS1，提取质粒在ABI-370核酸自动测序仪上进行序列分析，结果全部序列共694bp，该序列示于SEQIDNo.3(梁华等，(1996)生物工程学报12(3):296-300)。SEQIDNo3:TCCTAAGCTTCTTCCTAGTGTTTTTTGTTGTGATTGAGTCGACACAGCAACAACACTGCACTATTACAACCAGTACGACTATATCAACTAGCAATGTCTTCCTTATATGTTACTATTTATTTTGCTCATATTCATTATGTTTAAATCACATAGGCACCTTTCTATTGGCTTCAAAAAATTAGTATCAACTTTCTAGATTAAAATGAAACTAAAAGTACATAAATTTCTATCGGTGGGGAACGAGTGATTCTTTAAACCGATTATTACACAAGTTAACCACACTAAAATTAACATTGGTGAATCGTGCCATG^TTTTTTTTTAGTGGAAAATAGCCAAACCAAGCAACACATATGTGGCTATCCTTACACATGTGTAAAGGTATTGCATCACACCATTGTCACCCATGTATTTGGACAATACCGAGAGGAAAAACCACTTATTTATTGTATTTTATCAGTTTATCTTGCTTACGTATAAATTATAACCCAACAAAGTAATCACTAAATGTCAAAACCAACTAGATACCATGACATCTCTACCTTATCTTACTAATATTCTTTTTGCAAAATCCAAAAGTAATCTTGCACAAGCACAAGGACTGATATGTGTATAAATATCTCTTAGATTAGTAGTTAATACATCACTCATATTAAGACCAACTAGCAACATAGAAAGCACAATAGTGTACCAACA具体构建过程示于图2将19Z启动子替换Rok219的35S启动子，再将高赖氨酸蛋白基因SB401插入到35S和Nos终止子之间，得到质粒p19zk。将含有潮霉素选择标记基因质粒pHyg(Gritz,LandDaviesJ.1983)用HindⅢ酶切，Klenow补齐后，回收2.0kb片段，连接到p19zk的EcoRⅠ酶切，Klenow补齐后的位点，构建得到p19zKH。Rok219制备过程质粒pBI121(购自Clontech公司)用HindⅢ/XbaⅠ双酶切，将得到的片段即35S启动子插入到质粒pUC19(MessingJ.1983)HindⅢ/XbaⅠ位点，得到质粒pUC35S，将pBⅠ121用SacⅠ/EcoRⅠ双酶切，将得到的片段插入到质粒pUC35S的SacⅠ/EcoRⅠ位点，得到质粒Rok219。转基因植株种子中RNA和蛋白质的检测RNA的提取及Northern分析操作采用现有技术公知的技术，以32P-标记的SB401作用探针进行杂交，结果表明高赖氨酸蛋白基因在转基因玉米种子中积累(图6)。利用高赖氨酸蛋白的抗血清进行Western杂交，结果表明高赖氨酸蛋白在玉米种子中稳定积累(图7)。转基因玉米中赖氨酸和蛋白质的测定及遗传稳定性的分析。转基因植株结实后(R1代种子)进行赖氨酸和蛋白质含量测定，选含量高的植株种子按株行种植(R2代)，依此得到R3代，并对R2和R3代种子中赖氨酸和蛋白质含量进行测定(表1)。结果在转基因玉米种子中赖氨酸含量最高达种子干重的0.48％，蛋白质达种子干重的15％，而且高赖氨酸蛋白基因可以稳定遗传。R1代含量高的，其后代株系中赖氨酸含量也高。并且R2,R3代株系中赖氨酸平均含量比对照提高25-35％，个别植株提高50％以上，蛋白质提高10％，个别植株提高38％。赖氨酸和蛋白质含量测定委托农业部谷物品质监督检验测试中心进行。参考文献LiuJQ,SeulUandThompsonR(1997)Cloningandcharacterizationofapollen-specificcDNAencodingaglutamic-acid-richprotein(GARP)frompotatoSolanumberthaultii.PlantMol.Biol.33:291-300.MatzkeAJM,StogerEM，MatzkeMAetal.(1993)PlantMol.Biol.22:553-554.Othanietal.(1991)Normalandlysine-containingzeinsareunstableintransgenictobaccoseeds.PlantMol.Biol.34:15-29.梁华，马崇烈，赵倩，敖光明(1996)玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子RCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达。生物工程学报12(3):295-300。Gritz,L,Davies,J.(1983)Plasmid-encodedhygromycinBresistancethesequenceofhygromycinBphosphotransferasegeneanditgexpressioninEscherichiacoliandSaccharomycescerevisise.Gene25:179-188.MessingJ.(1983)NewM13vectorsforcloning.MethodsEnzymol.101:20.Depickereetal.(1982)J.Mol.Apll.Genet.1:561-570.表(1)转基因玉米植株中赖氨酸含量R1代植株中赖氨酸含量★共检测转基因植株70株，赖氨酸含量提高10％以上的26株，占36.8％。R1代植株中总蛋白的含量★共检测转基因植株数70株，总蛋白提高10％以上的43株，占61.4％。R1代植株中赖氨酸与蛋白质的关系★赖氨酸和蛋白质其中一项提高10％以上的共51株，占72.9％。(2)遗传稳定性R2、R3代植株中赖氨酸含量R2、R3代植株中蛋白质含量权利要求1．改良禾本科作物品质的方法，包括a．将从马铃薯中克隆的高赖氨酸蛋白的cDNA和启动子构建植物表达载体；b．将获得的表达载体转化禾本科植物，获得种子中赖氨酸和蛋白质含量明显提高的植株。2．根据权利要求1所述的方法，其中所述的启动子是玉米种子中特异表达的19Z启动子。3．根据权利要求1所述的方法，其中所述的禾本科植物包括玉米、水稻等。4．根据权利要求1所述的方法，其中所述的高赖氨酸蛋白cDNA是SB401。全文摘要本发明公开了一种改良禾本科作物品质的方法，该方法包括将从马铃薯中克隆的编码高赖氨酸蛋白的cDNA与玉米特异性表达的19Z启动子构建成植物表达载体，以此转化禾本科植物如玉米，从而获得了种子中蛋白质和赖氨酸含量明显提高的禾本科植株。文档编号A01H1/04GK1317572SQ0111829公开日2001年10月17日申请日期2001年5月29日优先权日2001年5月29日发明者敖光明,赵倩,于静娟,朱登云,彭鹏,张秀君,孙学辉申请人:中国农业大学