专利名称：一种紫菜纯系培育方法
技术领域：
本发明涉及一种紫菜细胞进行苗种培育生产技术领域。
紫菜生活史由配子体世代--叶状体(n)和孢子体世代-丝状体(2n)组成。叶状体成熟后产生雌雄生殖器官果胞(n)及精子囊器。精子(n)放散后使果胞细胞受精，成为受精果胞(2n)，经有丝分裂形成果胞子。果胞子脱离藻体钻入石质基质中(自然条件下多为贝壳)，萌发成丝状体。丝状体是紫菜的渡夏形式。丝状体发育一段时间，经减数分裂产生壳孢子(n)。秋季气温骤降，壳孢子放散，附着于自然或人工生长基上萌发成叶状体(n)幼苗。除有性生殖外，紫菜还有单孢子、无配孢子、内生孢子等多种无性生殖方式，请参见曾呈奎、王素娟、刘思俭等编注《海藻栽培学》(上海科技出版社，1985)。
同时我们及其他研究者对紫菜进行的遗传学及分子生物学研究表明，紫菜的遗传多样性十分丰富，栽培群体的遗传多样性也没有明显的降低。我们的实验数据进一步表明紫菜的等位基因极为丰富，参见贾建航、王萍、金敏德等撰写的《RAPD标记技术在紫菜多样性检测合种质鉴定中的应用》(植物学报，2000，42(4)403-407)。虽然紫菜的染色体数目较少(n＝2至7)，重组组合不多，但由于等位基因数目大，所以群体中等位基因杂合的机率很高，遗传多样性丰富，个体差异大。这种现象对生产实践是十分不利的。
近来生物技术种系培育方法一般是收集一个叶片上成熟的果胞子，使其生长为丝状体，并以此作为种保留起来。虽然不排除叶状体上生殖细胞自体受精的可能，但是大多数情况下，使果胞细胞受精的精子来自栽培群体中的不同个体。所以作为受精结果的果胞子虽然同在一个叶片上，但是实际是群体自然受精的结果。这样得到的丝状体品系实际是一个群体的集合。即使是由单一果孢子细胞发育而成的丝状体(2n)，因其同源染色体多来自不同的亲本个体，所以是杂合的。由于群体中等位基因杂合的机率很高，在减数分裂形成壳孢子(n)时，就会发生孟德尔分离。
90年代，有人利用紫菜营养细胞进行苗种生产，参见方宗熙、戴继勋、唐延林等《紫菜细胞的酶法分离合在水产养殖中的应用》(海洋科学，1986，10(3)46-47)和其相关专利报道，中国专利号分别为85104059和96116039.X，但是它仅从营养体到营养体，单倍体到单倍体的过程，并没有进行纯系的培育；由于生产中难以控制异体受精的发生，所以不能保证遗传学意义上的种系纯合。当然，也有的学者提出取紫菜叶状体基部叶片分割成小片培养丝状体进行品系培育。但是该方法不能排除小区域内嵌合细胞的存在，所以仍然面临品系不纯的问题。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为该种紫菜纯系培育方法，其特征在于步骤为1)选取未成熟的紫菜叶片，并清除杂藻和抗生素处理；2)利用海洋植食性贝类蛋白提取液分解叶片，获得紫菜叶片单细胞或者原生质体；3)分离单细胞或原生质体进行培养，使它们生成新叶片；或者在单倍的叶状体单细胞或原生质体的基础上诱导其染色体自然增倍，生成纯合的二倍体丝状体纯系；4)对于雌雄同体的种类，可将培养出来的叶状体单独培养至性成熟，使其自体受精，产生纯合的二倍丝状体，从而进行保种或苗种的生产；对于雌雄同体或雌雄异体的种类，经过染色体增倍直接获得的完全纯合的紫菜丝状体进行放大培养，用于保种或苗种生产。
上述的海洋植食性贝类为滨螺、嵘螺或牡蛎或鲍鱼。
与现有技术相比，本发明的优点在于本发明技术建立在单细胞无性繁殖的基础之上，以未经性别分化的体细胞(n)为材料，分离出单细胞或者原生质体，直接诱导染色体自然加倍而形成丝状体(2n)；或者进行无性繁殖形成新的叶状体(n)，控制雌雄同体的紫菜进行自体受精，进一步发育成丝状体(2n)。利用条件诱导染色体自然加倍和自体受精两种途径获得的丝状体，其两套同源染色体完全一致，等位基因完全纯合，所以在以后的繁殖中性状不会发生分离。因此该方法培育出的是真正遗传学及育种学意义上的纯系。
非纯系紫菜由于群体中等位基因丰富，所以遗传差异大，个体差异明显。纯系紫菜由于等位基因完全纯合，个体遗传背景完全一致，在栽培环境相同的情况下，个体差异就会非常小。选择个体性状优良的个体为材料培育出的纯系紫菜，由于子代不出现分离，完全保持亲本的所有优良性状，所以栽培紫菜可以在产量和质量上会有较大的提高，经济效益和社会效益十分明显。
具体实施例方式
以下对本发明的实施例作进一步详细描述。
1、选取新鲜未成熟的紫菜叶片；或边缘部分成熟的紫菜叶片，尽量切除边缘，保留中心未成熟区域。清除杂藻，用0.7％KI和1％青霉素分别处理10分钟，然后用消毒海水多次冲洗以备无菌操作使用。将处理好的叶片中心区域剪成1mm2左右的小片。
2、利用海洋潮间带植食性贝类如滨螺、嵘螺、牡蛎等等蛋白提取液，其浓度1％，另加NaCl或葡萄糖，使其终浓度分别为NaCl 1.5mol/L或葡萄糖2mol/L，将1步处理的1mm2小片于20℃进行酶解，注意观察酶解情况，当叶片外围5-6层细胞松动后即可用消毒海水多次冲洗，洗掉酶液，并用300目筛绢过滤，获得紫菜叶片单细胞或者原生质体。
3、分离单细胞或原生质体进行细胞培养。细胞培养在光照培养箱或其他可控制条件的空间内进行。培养液为加营养盐的海水，其含N-4ppm、P-0.4ppm，开始4-5天培养条件为20℃，1500LUX，光周期为L∶D＝12∶12，当培养条件改为15℃左右，1500LUX，光周期为L∶D＝10∶14，单细胞或原生质体可以生成新叶片；或者当条件改变为20℃左右，1500LUX，光周期为L∶D＝14∶10在单倍的叶状体单细胞或原生质体的基础上诱导其染色体自然加倍，生成纯合的二倍丝状体纯系。
4、1对于雌雄同体或雌雄异体的种类，均可直接将获得的完全纯合紫菜丝状体，并进行放大培养，用于保种或苗种生产。具体的扩增培养条件因为种类不同而异，例如条斑紫菜丝状体为19℃，1500LUX，光周期为L∶D＝12∶12，坛紫菜丝状体为21℃，1500LUX，光周期为L∶D＝12∶12。
4.2对于雌雄同体的种类，还可将上述方法培养出的叶状体单独培养至性成熟，使其进行自体受精，形成果孢子，果孢子放散，产生纯合的二倍丝状体，从而进行保种或苗种生产。
权利要求
1.一种紫菜纯系培育方法，其特征在于步骤为1)选取未成熟的紫菜叶片，并清除杂藻和抗生素处理；2)利用海洋植食性贝类蛋白提取液分解叶片，获得紫菜叶片单细胞或者原生质体；3)分离单细胞或原生质体进行培养，使它们生成新叶片；或者在单倍的叶状体单细胞或原生质体的基础上诱导其染色体自然增倍，生成纯合的二倍体丝状体纯系；4)对于雌雄同体的种类，可将培养出来的叶状体单独培养至性成熟，使其自体受精，产生纯合的二倍丝状体，从而进行保种或苗种的生产；对于雌雄同体或雌雄异体的种类，经过染色体增倍直接获得的完全纯合的紫菜丝状体进行放大培养，用于保种或苗种生产。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的海洋植食性贝类为滨螺、嵘螺或牡蛎或鲍鱼。
全文摘要
本发明涉及紫菜细胞进行苗种培育生产技术领域。其为提供一种紫菜纯系培育方法而设计的。其采用海洋植食性贝类蛋白提取液分解紫菜未成熟叶片产生单细胞或者原生质体,然后进行培养或诱导染色体增倍生成二倍体丝状体纯系,雌雄同体的种类,可将培养出来的叶状体单独培养至性成熟,使其自体受精,产生纯合的二倍丝状体,从而进行保种或苗种的生产;对于雌雄同体或雌雄异体的种类,经过染色体增倍直接获得的完全纯合的紫菜丝状体进行放大培养,用于保种或苗种生产。它能选择个体性状优良的个体为材料培育出的纯系紫菜,由于子代不出现分离,完全保持亲本的所有优良性状,所以栽培紫菜在产量和质量上会有较大的提高,适合在紫菜苗种培育上推广使用。
文档编号A01H13/00GK1346591SQ0113216
公开日2002年5月1日 申请日期2001年11月8日 优先权日2001年11月8日
发明者刘必谦, 杨锐, 骆其君, 王亚军, 周湘池 申请人:刘必谦, 杨锐