专利名称：一种抗病无核葡萄高效聚合育种方法
技术领域：
本发明涉及植物育种技术，特别是涉及一种抗病无核葡萄高效聚合育种方法。
背景技术：
葡萄作为世界性水果，其种植面积和产量均居世界第二。而无核性状是葡萄商业生产中一种特殊的性状标志，在发达国家和地区，无核葡萄产量已占到葡萄生产总量的60％以上。在我国，随着市场需求量的增大，无核葡萄的栽培面积也呈上升趋势，但因无核葡萄育种技术的滞后以及新品种的缺乏，严重阻碍了无核葡萄产量及品质的提高。目前，在世界范围内对无核葡萄的育种一般采用传统常规杂交育种技术，即以有核品种作母本，以无核品种作父本杂交后，播种分离，通过对后代选择以选育无核葡萄品种，这种方法效率极低，而且鉴定杂种的无核性状至少需要3～5年结果后方可进行，这种耗时低效的育种方法已远远不能满足生产的需要。
美国《园艺科学》杂志1990年25卷第4期393～398页报道的离体胚挽救技术，提高了无核葡萄品种间杂交后代无核杂种出现的比率，同时较常规传统杂交技术相比，缩短了4～5年时间，但对杂交后代目的性状的观察是通过胚挽救幼苗定植大田结果后才进行，在幼苗期没进行分子标记辅助选择，因而效率较低，且选育的无核葡萄品种缺乏抗病性。1990年首次报道的随机扩增多态性脱氧核糖核酸技术作为植物育种的分子标记技术，在分子生物学研究领域得到迅猛发展，并在实践中取得了明显成效，利用该技术寻找遗传的分子标记，可达到快捷、简便、成本低、多态性丰富、又不需同位素示踪和安全可靠的效果，因而受到世界分子生物学界的广泛重视，但该技术目前仅属于一种辅助育种技术，还没有被广泛应用于抗病无核葡萄的育种技术领域。
发明内容
本发明的目的就是要克服利用常规传统杂交育种技术培育抗病无核葡萄周期长、效率低的缺点，发明了一种融常规杂交技术、胚挽救技术、分子标记辅助育种技术于一体用于培育抗病无核葡萄新品种的高效聚合育种方法体系，从根本上提高抗病无核葡萄的育种效率。
本发明采用经济性状好的无核葡萄品种作母本，以中国野生葡萄中抗病性强的种、株系或杂种作父本进行田间人工杂交，40～53天后，采用幼小杂交胚珠进行离体胚珠内胚挽救，以获得大量杂交后代的胚挽救幼苗，对获得的大量抗病无核葡萄胚挽救苗后代，用检测葡萄无核基因和抗病基因的随机扩增多态性脱氧核糖核酸标记，进行幼苗期分子标记辅助选择抗病性状和无核性状，以获得抗病无核葡萄新品种。
利用本发明培育抗病无核葡萄新品种，仅需3～4个月即可得到胚挽救幼苗，较常规杂交育种及常规等待杂种苗结果后进行鉴定总共至少缩短时间7～9年，极大的提高了育种效率，达到同行业世界领先地位，为充分利用我国特有丰富的野生葡萄抗病基因，快捷培育优质抗病无核葡萄新品种开创了广阔前景。
具体实施方法
a.以中国野生葡萄抗病性强的种、株系或杂种作父本，在开花前1～2天采集其花粉。
b.将采集的花粉烘干研磨装于玻璃瓶中，将瓶置于干燥器内放入-20℃冰箱保存备用。
c.以优质欧洲无核葡萄品种为母本，在开花前2～3天对花朵去雄，喷水后套袋。
d.次日起以备用花粉对去雄花朵授粉，连续授粉三天，授粉后立即对其套袋，以形成浆果。
e.授粉后40～53天，先将浆果用清水反复冲洗，后在超净工作台上用70％酒精漂洗20～30秒钟，再放入0.1％升汞消毒液中浸泡6～8分钟，然后用无菌水反复冲洗。
f.将消毒后的浆果在无菌条件下剥取胚珠，在培养室内接种于由胚发育培养液制成的培养基上促使胚充分发育。
f.1培养室温度25～28℃。
f.2光照16小时。
f.3光照强度2000～3000勒克司。
g.培养55～60天后在培养室内无菌剥取幼胚，接种于由胚萌发培养液制成的培养基上促使其萌发。
g.1培养室温度25～28℃。
g.2光照12小时。
g.3光照强度1000～1500勒克司。
h.萌发的幼胚于10～15天后在培养室内接种于由成苗培养液制成的培养基上，培养成胚挽救幼苗。
h.1培养室温度25～28℃。
h.2光照12小时。
h.3光照强度2000～3000勒克司。
j.将具有4～5片叶的成苗光照锻炼6～7天。
k.无菌条件下将幼苗移到珍珠岩中炼苗。
k.1湿度80％～95％。
k.2浇灌稀释800～1000倍的25％多菌灵。
l.15天后将种苗移到温室内的营养土中炼苗3～4个月。
m.下年春季定植于大田。
n.对胚挽救幼苗进行基因组脱氧核糖核酸的提取。
o.利用检测葡萄无核基因和抗病基因的随机扩增多态性脱氧核糖核酸标记，在幼苗期对胚挽救幼苗进行分子标记辅助选择抗病性状和无核性状，以淘汰非目标性状的杂交后代。
权利要求
1.一种抗病无核葡萄高效聚合育种方法，其特征是采用经济性状好的无核葡萄品种作母本，以中国野生葡萄中抗病性强的种、株或杂种作父本进行田间人工杂交，40～53天后，采用幼小杂交胚珠进行离体胚珠内胚挽救，以获得大量杂交后代胚挽救幼苗，对获得的大量抗病无核葡萄胚挽救幼苗后代，用检测葡萄无核基因和抗病基因的随机扩增多态性脱氧核糖核酸标记，进行分子标记辅助选择抗病性状和无核性状，以获得抗病无核葡萄新品种。
2.根据权利要求1所述的一种抗病无核葡萄高效聚合育种方法，其特征是采取以下具体实施方法2.a以中国野生葡萄抗病性强的种、株系或杂种作父本，在开花前1～2天采集其花粉，2.b将采集的花粉烘干研磨装于玻璃瓶中，将瓶置于干燥器内放入-20℃冰箱保存备用，2.c以欧洲优质无核葡萄品种为母本，在开花前2～3天对花朵去雄，喷水后套袋，2.d次日起以备用花粉对去雄花朵授粉，连续授粉三天，授粉后立即对其套袋，以形成浆果，2.e授粉后40～53天，先将浆果用清水反复冲洗，后在超净工作台上用70％酒精漂洗20～30秒钟，再放入0.1％升汞消毒液中浸泡6～8分钟，然后用无菌水反复冲洗，2.f将消毒后的浆果在无菌条件下剥取胚珠，在培养室内接种于由胚发育培养液制成的培养基上促使胚充分发育，2.f.1培养室温度25～28℃，2.f.2光照16小时，2.f.3光照强度2000～3000勒克司，2.g培养55～60天后在培养室内无菌剥取幼胚，接种于由胚萌发培养液制成的培养基上促使其萌发，2.g.1培养室温度25～28℃，2.g.2光照12小时，2.g.3光照强度1000～1500勒克司，2.h萌发的幼胚于10～15天后在培养室内接种于由成苗培养液制成的培养基上，培养成胚挽救幼苗，2.h.1培养室温度25～28℃，2.h.2光照12小时，2.h.3光照强度2000～3000勒克司，2.j将具有4～5片叶的成苗光照锻炼6～7天，2.k无菌条件下将幼苗移到珍珠岩中炼苗，2.k.1湿度80％～95％，2.k.2浇灌稀释800～1000倍的25％多菌灵，2.l15天后将种苗移到温室内的营养土中炼苗3～4个月，2.m下年春季定植于大田，2.n对胚挽救幼苗进行基因组脱氧核糖核酸的提取，2.o利用检测葡萄无核基因和抗病基因的随机扩增多态性脱氧核糖核酸标记，在幼苗期对胚挽救幼苗进行分子标记辅助选择抗病性状和无核性状，以淘汰非目标性状的杂交后代。
全文摘要
本发明公开了抗病无核葡萄高效聚合育种方法。葡萄是世界消费量最大的水果之一，而无核葡萄又占其总量的60％以上，但无核葡萄品种的培育按常规方法却需用7～9年时间，极大地阻碍了无核葡萄产量及品质的提高，本发明的目的就是要克服利用常规传统杂交育种技术培育抗病无核葡萄育种周期长、效率低的缺点，公开了一种融常规杂交技术、胚挽救技术、分子标记辅助育种技术于一体的高效聚合育种方法体系，使育种时间从7～9年缩短到3～4个月，通过该方法培育的无核葡萄抗病性强，无核比率大，畸果率低，果质品位高，开创了葡萄育种新领域。
文档编号A01H1/02GK1415189SQ0213933
公开日2003年5月7日 申请日期2002年8月5日 优先权日2002年8月5日
发明者王跃进, 潘学军, 王飞, 张剑侠, 万怡震, 骆伟强 申请人:西北农林科技大学