调节植物的发育转换过程的制作方法

文档序号:195393阅读:400来源:国知局
专利名称:调节植物的发育转换过程的制作方法
技术领域
本发明是关于一种调节植物生长或发育的方法。
除了短期环境因素如每天的昼夜节律以及水和养份的即时可获得性之外,长期环境因素如低温期间、湿度(缺乏)或白昼时间短,在许多植物的生命周期中也具有重要的作用。短期环境因素如环境光照对逐日的形态发生具有即时性作用(例如,在光照下生长的幼苗以短胚轴和张开的绿色子叶为特征,而在黑暗中生长的幼苗发黄,带有伸长的胚轴和关闭的子叶),而长期环境因素常常决定或者影响植物在其发育过程中从一个阶段向另一个阶段的转换,特别是影响在其发育过程中处于发育间歇的植物。
例如,在冬季气候温和地区的低温期间可影响植物转换过程的许多方面。典型的转换事件是茎伸长(抽苔),并开始开花和形成果实(结果),另一事件是被看作休眠种子突破性事件的发芽。
某些植物种类为了诱导开花需要一个发育间歇,包括延长的低温期间以及/或者弱光照或短白昼,并且,在所谓的春化处理法中,对于许多植物传统的人工处理法(如强制催育)正广泛地被使用,以便促成早熟抽苔、开花和/或结果,或者为了获得具有市场吸引力的植物或植物的某些部分(幼苗,花或开花的植株,果实),在否则将不可能天然地获得这样一种产品的季节促使植株,种子,幼苗或鳞茎早熟发芽。
对于某些植物种类开花和茎伸长可在相同时间被诱导。另一些种类为了诱发我们将进一步称为抽苔过程的茎延伸,需要一个低温期间。对于这些种类,花诱导和形成过程在所需要的低温期间之前,这样,这两个过程被暂时分开了。还有受长期环境因素(例如低温或干旱)影响的另外几个过程是种子的静止期,休眠和发芽。这些长期环境因素或过程往往使植物的发育与其生长地的季节和/或气候条件同步,反映出在其中生长的特定植物或种类对各种条件的进化适应。
郁金香是一个实例性品种,通过研究其抽苔过程被用作研究长期环境因素诱导的这些植物生长改变各个方面的模型[4]。另一个常常涉及低温场合的过程是种子休眠。低温诱导的茎伸长可以被看作休眠突破的一种形式,而树芽的分层现象,春化作用和休眠突破也是由低温驱动的类似过程。在拟南芥(Arabidopsis)休眠种子的萌发过程中,除了需要冷却以便克服休眠之外,郁金香抽苔和此休眠种子萌发之间的另一些类似之处在于如下事实所有的器官都在保护性结构内形成,使其在脱离休眠之后能快速生长,贮备物质被储存在像器官的特化叶片中(例如,Arabidopsis以淀粉的形式储存在子叶中,而郁金香也是以淀粉的形式储存于鳞茎鳞片中),并且在休眠期间含水很少[5]。
本发明提供了一种调节植物发育转换的方法,例如从而在发育间歇期提供了一个突破点,该方法基本上不依赖于如上面所论述的长期环境因素,因此提供了一种调节植物从一个发育阶段向另一个发育阶段转换的方法。特别是,提供了一种调节植物发育转换的方法,其中所述的转换包括萌芽,抽苔,开始开花或结果。在此我们实现分离了植物RING指的低温诱导表达产物,它是来自郁金香的亚类RING-H2蛋白,此蛋白与同发育调节剂相互作用的其它植物(如拟南芥)蛋白有同源性。此含意是该植物RING指或RING-H2蛋白的表达,如在此所显示的低温诱导的TGRING1表达,以将植物的ABI3同源物蛋白质水解为目标,从而终止发育间歇期,例如结束休眠或静止的状态,使此植物能够从一个发育阶段向另一个发育阶段突破(例如超越)并向其随后的发育阶段生长。虽然事实是,RING或RING-H2蛋白以前就已经被认为包含在遍在蛋白化(ubiquitination)或蛋白水解作用中,但是最初还没有证明这些蛋白质包含在植物发育变迁中。这点对于例如与如下事件有关的发育变迁是特别确实的发芽,分层化,抽苔,开始开花或结果,低温诱导的茎伸长,休眠突破,鳞茎诱发,开花定时。例如,Stoop-Myer等[17]显示COP1的N-末端片段保留有它的部分功能性。他们指出,这种片段至少具有二个功能性结构域,RING结构域和卷曲螺旋结构域。但是,重要的是他们并没有将此保留的功能性归因于RING结构域,他们也没有对此结构域单独提议一种功能。McNellis等[18]也显示COP1的N-末端片段保留有它的部分功能性。同样他们也指出,这样片段至少具有二个功能性结构域,RING结构域和卷曲螺旋结构域。同样他们也没有将此保留的功能性归因于RING结构域。McNellis等[19]通过COP1的超量表达显示出它在光形态发生中的作用。他们指出,COP1至少具有三个功能性结构域,RING结构域,卷曲螺旋结构域和WD-40重复结构域。但是,重要的是他们没有将COP1的功能性归因于RING结构域,他们也没有对此结构域单独提议一种功能,Kurup等[16]在他们的论文中表明,AIP2与拟南芥的发育调节剂ABI3有相互作用。他们没有认识到AIP2和其它RING-H2蛋白在发育转换中的作用,相反他们对AIP2提出了作为转录激活剂的作用。Freemont[20]首先发表的论文提出,RING和RING-H2结构域在遍在蛋白化和蛋白水解确定目标中具有普遍性作用。他的论文主要集中于具有一个例外PRT1的动物系统发现的RING蛋白[21]。拟南芥的PRT1蛋白显然包含在一种特别的途径,“N-末端规则”遍在蛋白化途径中。但是,不论在这篇论文中还是在Potuschak等[21]的论文中,都没有关于为了在植物中获得一个发育变迁而将RING指或RING-H2蛋白用于控制发育调节剂的蛋白水平的任何论述。虽然事实是,RING或RING-H2蛋白以前就已经被认为包含在遍在蛋白化或蛋白水解作用中,但是最初还没有证明这些蛋白质包含在植物发育变迁中。这点对于例如与如下事件有关的发育变迁是特别确实的发芽分层,抽苔,开始开花或结果,低温诱导的茎伸长,休眠突破,鳞茎诱发,开花定时。Tamminen[22]例证说明ABI3的异位表达可导致耐冷冻性改变。本发明提供通过使其作为蛋白水解或遍在蛋白化的靶标来控制ABI3或其它发育调节剂的蛋白水平,从而将RING或RING-H2蛋白用于植物的发育转换。Torii等的论文[23]显示,拟南芥的CIP8蛋白与拟南芥的光形态发生调节剂COP1可相互作用。这种相互作用可归咎于COP1的RING结构域和CIP8的RING-H2结构域。但是,该论文没有指出或者提议在遍在蛋白化或蛋白水解作用中RING或RING-H2结构域的作用。它仅仅提出了作为蛋白质-蛋白质相互作用结构域的作用。
具有理想的RING指或RING-H2基元序列的典型植物蛋白质可在图1A和B中找到,通过在其中显示的简单定位也可找到其它蛋白质。在优选的实施方案中,本发明提供了一种调节植物发育转换的方法,包括调节该植物或它的某些部分中RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段的表达,特别是在其中该转换包括发芽,分层化,抽苔,开始开花或结果时。如在此所公开的这样一种RING指或RING-H2蛋白,可导致对靶标蛋白(例如发育调节蛋白)的遍在蛋白化和/或蛋白水解作用,从而例如导致蛋白体介导的降解和除去所包含的该靶标蛋白(例如调节蛋白),此靶标蛋白与从一个发育阶段向另一个发育阶段转换有关。在此使用的靶标蛋白是一种能够调节植物发育转换的蛋白质。在此所述的特定调节蛋白包括例如COP1,Hy5,FLC,FRIGIDA和LD。在此优选的是调控一种在拟南芥中通常被称为脱落酸-不敏感3(ABI3)的调节蛋白或其相似物。
本发明提供了一种方法,其中所述的RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段,至少在功能上与在图1A和1B中所显示的植物RING指或RING-H2蛋白等同或同源。RING指蛋白的功能性片段含有例如RING指(C3HC4)基元序列Cx(2)Cx(9,89)Cx(1,3)Hx(2,8)Cx(2)Cx(4,48)Cx(2)C而RING-H2蛋白的功能性片段含有例如RING-H2(C3H2C3)基元序列Cx(2)Cx(9,39)Cx(1,3)Hx(2,3)Hx(2)Cx(4,48)Cx(2)C或者与它们功能等同的基元序列。上面使用的编码是按照IUPAC规则C代表半胱氨酸,H代表组氨酸,而X编码任何一种氨基酸。括弧内的数字显示重复的数目,这样例如x(9.39)表示9-39个氨基酸残基的长度,在此每个残基可以是任何氨基酸。在TGRING1中,此基元序列包含氨基酸248-288。
本发明还提供了一种编码植物RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段的被分离出的和/或重组的核酸,它所编码的蛋白质含有的氨基酸序列与图3中的序列相比较,优选地至少有50-60%同源,比较优选的是70%同源,更加优选的是95%同源,并且保留了相似的功能[即与图3中的序列“基本等同”]。在此使用的“基本等同”意指功能等同,例如,可根据残基的极性、电荷、可溶性、疏水性和/或其两亲性特性的相似性,审慎地进行氨基酸取代,只要保留此多肽的生物活性。同源性是普遍地跨越在此显示的相关序列的全长度。正如一般所理解,氨基酸水平的同源性通常是根据氨基酸的相似性或同一性。相似性考虑到“保守性变异”,也就是以一种疏水性残基如异亮氨酸,缬氨酸亮氨酸或甲硫氨酸取代另一种疏水性残基,或者以一种极性残基取代另一种极性残基,例如,以精氨酸取代赖氨酸,谷氨酸取代天冬氨酸,或者以谷氨酰胺取代天冬酰胺。可根据残基的极性、电荷、可溶性、疏水性和/或其两亲性特性的相似性,审慎地进行氨基酸取代,只要保留此多肽的生物活性。在优选的实施方案中,在此提出的所有同源性百分率指的是序列同一性百分率,例如,相对于特定的参照序列,氨基酸序列同一性百分数(%)可以是与此参照序列中氨基酸残基完全相同的候选序列中氨基酸残基的百分率,此百分率是在如果必要时将此序列排列成直线并引入空隙,以便达到序列同一性最大百分数之后得到的,并且不考虑作为序列同一性一部分的任何保守性取代。通过本领域已知的基因程序可以确定氨基酸的相似性或同一性。
本发明提供了一种方法,其中的RING指或RING-H2蛋白作为遍在蛋白-蛋白质连接酶(E3)或者这种酶的亚单位发挥作用。以遍在蛋白(Ub)的链修饰构成了借此蛋白质被定为蛋白体降解作用(Proteasomal degradation)靶标的主要机制。蛋白质遍在蛋白化要通过一个复杂的过程完成,涉及到遍在蛋白激活酶(E1s),遍在蛋白结合酶(E2s),以及在某些情况下还需要具有特异性的遍在蛋白连接酶(E3)。E1酶首先起作用,并将Ub传递到准备好对准底物蛋白质(靶标蛋白质)的E2酶。可能作为核酸或蛋白质结合功能区的RING指或RING-H2蛋白也可能作为遍在蛋白连接酶(E3)或这种酶的亚单位起作用。遍在蛋白连接酶E3被粗略地定义为一种蛋白质或蛋白复合体,它负责底物识别,并促进多遍在蛋白连接于此底物而标记它,提供被26S蛋白体降解。E3酶可使多遍在蛋白链集合在各种调节蛋白上并因此使它们成为被26S蛋白体蛋白水解的目标。
本发明提供了一种方法,根据本发明其中所述的RING指或RING-H2蛋白至少可同靶标蛋白和/或遍在蛋白结合酶(E2)相互作用,使之能够将遍在蛋白残基从该遍在蛋白结合酶转移到此靶标蛋白。在修饰靶标蛋白质之前E3可同E2相互作用,与遍在蛋白形成硫酯键。某些E3不是作为形成硫酯中间体的遍在蛋白载体,而是作为E2和靶标蛋白质之间的桥梁,为遍在蛋白的转移提供有利的环境。RING指或RING-H2蛋白可提供与E2相互作用的位点,便于从E2直接转移Ub至靶标赖氨酸。这种反应可导致在遍在蛋白的C-末端与蛋白质底物中赖氨酸残基的ε氨基之间形成同工肽键(isopeptid bond)。在所附着的遍在蛋白残基内,赖氨酸残基可以起受体位点的作用,导致集合多遍在蛋白链,它们可作为26S蛋白体的识别信号。
RING指或RING-H2蛋白在遍在蛋白化反应中除了为E2提供结合位点之外可能还有其它作用。RING指或RING-H2蛋白还可以代替起E2变构激活剂的作用,本发明进一步提供了一种方法,根据本发明其中所述的RING指或RING-H2蛋白起遍在蛋白结合酶(E2)变构激活剂的作用。显然,该RING指或RING-H2蛋白在不同于遍在蛋白的途径中或者在类似遍在蛋白的途径中起作用,调节植物的发育转换。
特别是本发明提供了从鳞茎得到的这样一种核酸。在此所使用的鳞茎是一种具有一个或几个芽的被修饰的地下鳞茎。此芽被包裹在修饰的多肉质叶片或鳞片中,当芽开始生长时,这种叶片或鳞片对它们提供能量,例如洋葱和郁金香具有鳞茎。本发明还提供了一种包含根据本发明核酸的载体和包含根据本发明核酸或载体的宿主细胞。这样一种载体的实例是植物转化载体pBIN19。它经常被用于将DNA片段例如编码TGRING1蛋白或其功能性片段的DNA片段传递给植物基因组。可以按照在分子生物学、生物技术学和基因工程领域使用的常规技术实施制备转化体的程序或方法。
优选地这种宿主细胞包含一种能够产生含有根据本发明核酸的植物或者它的一部分的植物细胞。如在此使用的“植物细胞”,其中包括种子,悬浮培养物,胚芽,分生组织部分,硬组织,原生质体,叶,根,枝条,鳞茎,配子体,孢子体,花粉和小孢子。目标植物可选自任何单子叶或双子叶植物种类,例如观赏植物,蔬菜和耕种的农作物等。“双子叶”(以及意指相同植物类型的所有科学等同物)构成开花植物或被子植物纲二类(部)植物中的一类,这类植物其胚芽具有二片或几片分开的或并合的子叶。“单子叶”(以及意指相同植物类型的所有科学等同物)构成开花植物或被子植物纲二类(部)植物中的一类,这种植物胚芽具有一片子叶。“被子植物纲”或开花植物,是以花作为特化的植物生殖器官和以心皮覆盖子房为特征的种子植物。还包括裸子植物纲。裸子植物纲是以孢子叶球作为特化的植物生殖器官和以承载雄性或雌性生殖器的裸露的孢子叶为特征的种子植物,例如木本植物。
“观赏”植物是主要在于培养它们的习性,独特的外形,(花,叶簇或其它部分的)颜色或者其它特征的植物,这种植物为人类提供适合室内剪花或盆景植物或者在室外作人造风景,例如鳞茎状植物种类郁金香,小苍兰(Freesia),水仙,和信风子等。“蔬菜”是为了人类消耗它们部分叶、块茎、茎、果实和花而特意选择或培育的植物,并且这种植物可能需要更加仔细的培育方式。“耕种的农作物”通常是特意地培育或选择为了人类客观性的需要(包括直接或间接的消耗范围,喂食或工业应用例如纤维),例如大豆、向日葵、玉米、花生、玉蜀黍、小麦、棉花、红花和油菜籽。
特别是,本发明提供在调节植物的方法中使用根据本发明的核酸或载体。该方法优选地包括调节植物的发育转换。优选地是通过为该植物提供编码RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段的核酸来达到所述调节的目的。例如可考虑将本发明用于代替对植物的强制催育,例如以加速转换、获得较早开花的鳞茎供销售为目的,然而在可能需要的情况下,可以同样适合地运用于延迟植物的转换。
在特定的实施方案中,本发明提供了一种方法,例如可用于在试管内繁殖鳞茎如郁金香鳞茎,包括编码RING指或RING-H2蛋白的核酸的瞬时表达。可以用所描述的本发明影响或调节(加速或延迟)的其它转换过程包括例如发芽,分层,抽苔,开始开花,结果,开花定时,低温诱导的茎伸长,休眠突破或鳞茎诱发,在这些方面也可以使该核酸瞬时地表达。本发明还附带地提供了一种具有编码RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段的核酸的植物(如果需要只是暂时地)。
本发明还提供了一种方法,用于确定植物处在的或者正逐渐发展达到的发育转换阶段,此方法包括测定该植物或它的某些部分中RING指或RING-H2基因产物(mRNA或蛋白质,或者它们的功能性片段)的表达,以及/或者包括测定对靶标蛋白的遍在蛋白化和/或蛋白水解作用,此靶标蛋白与该RING指或RING-H2基因产物(mRNA或蛋白质,或者其功能性片段)相互作用,或者与其结合。这种方法在选择一种处于其发育过程某一转换阶段的植物的方法中是有用的,此选择方法包括测定该植物或它的某些部分中RING指或RING-H2基因产物或者其功能性片段的表达,例如,为了确定该植物是否处于或接近某一明显的发育阶段如发芽,分层化,抽苔,开始开花或结果。
本发明进一步提供了一种方法,用于选择处于其发育过程某一转换阶段的植物,此方法包括测定RING指或RING-H2基因产物或者其功能性片段的表达,以及/或者包括测定对靶标蛋白的遍在蛋白化和/或蛋白水解作用,此靶标蛋白与该RING指或RING-H2基因产物(mRNA或蛋白质,或者其功能性片段)相互作用,或者与其结合。现在很容易选择并且也可在此提供具有所希望特征的植物。
本发明还提供了一种方法,用于获得具有与发育转换过程相关的所希望品质特点的植物或它的后代,此方法包括测定该植物或它的某些部分中RING指或RING-H2基因产物或者其功能性片段的表达,以及/或者包括测定对与该RING指或RING-H2基因产物(mRNA或蛋白质,或者它们的功能性片段)相互作用,或者与其结合的靶标蛋白的遍在蛋白化和/或蛋白水解作用。
例如,现在已可能更容易地选择或培育具有所希望发育转换式样的植物。例如为了获得具有降低了开花对冷需要的郁金香或其它植物,或者获得其种子发芽被延迟或加速的植物,现在已可能对不同的杂交后代检验其调节所述品质(冷需要或种子发芽的时间)的RING指或RING-H2 mRNA或蛋白质,或者其功能性片段的表达水平。
在详细说明中将对本发明作进一步阐述,但是并不将本发明局限于此。
详细说明植物材料和RNA分离在夏季(7月)收获郁金香鳞茎,在20℃贮存直至G期后(9月)至少二周。在黑暗通风的室内实施所有的贮藏处理。然后将鳞茎转移至5℃,作低温处理,或者转移至17℃。
为了作差异显示分析,在转移至5℃或17℃之后4、8和12周取样。在另一年温度处理过程中作同样的取样,用于进行差示表达的RNA印迹(Northern blot)分析。为了在种植后对不同的器官进行RNA印迹分析,在9月份将鳞茎转移至17℃,直至12月末,然后转移至5℃持续12周。在23℃种植的生长(12小时光照/12小时黑暗)之后,在种植后的指定天数对器官采样。将所有的样品在液氮中冷冻,贮存于-80℃,或者被冰冻干燥。如[3]中所描述的,使用CTAB分离RNA。如[1]中描述的,使用甲醛/琼脂糖凝胶进行RNA印迹分析。在68℃,使用50%甲酰胺缓冲液以及α32P-CTP标记的RNA探针进行杂交。克隆程序如[2]中描述的实施差异显示PCR(DDRT-PCR)。切取差异带,使用如DDRT-PCR过程中相同的条件作再扩增,不同的是dNTP浓度为100μM。将此PCR产物克隆。对PCR产物的所有克隆过程都在pGEM-T载体(Promega,Madison USA)内进行。在测序之后,使用带有特异性引物片段的Marathon试剂盒(ClonTech,Palo Alto USA)进行二次嵌套式5’RACE(cDNA末端的快速扩增)反应。将此获得的片段克隆并测序。这时可使用来自5’-末端(5’-GTCGTCGGCTTCCCCTCCGCCAAG-3)和3’-末端(5’-TTTAACCACAATAGCTCATTGCAAGGCTTC-3’)的新引物,以及校对酶(KlenTag,ClonTech)对此全片段进行再扩增和克隆。对二个克隆的二条链测序,发现是相同的。还对所需要的EST克隆的二条链进行了测序。在自动测序仪(ALFexpress,AmershamPharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)上,使用厂商推荐的试剂盒进行测序。
序列分析运用DNA SIS(Hitachi软件,Olivet,France)和GeneRunner(Hastings软件公司,Hastings on Hudson,USA)软件包对序列进行分析。运用NCBI Blast服务器(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行数据库搜寻。运用标准定位在EBIClustalw服务器(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)实施多重定位排列(Multiple alignments),使用Boxshade3.2(ISREC.Epalinges s/Lausanne,Switzerland)对排列部位涂色。
结果克隆以及TGRING-H2序列和相似的EST序列运用差异显示分析(differential display),对在5℃干燥贮存的郁金香鳞茎底部节间中高水平表达的mRNA,对比在17℃贮存的进行筛查。发现218bp片段是有差异的,并将此片段克隆。因为DDRT-PCR片段常常是来源于非编码的3’-末端,所以进行了5’-RACE反应。对所获得的片段进行测序并设计新的5’-和3’-引物,以便使用校对酶再扩增此全长度cDNA。
所获得的1222bp的克隆包含一个具有预测的分子量36.7KD的327个氨基酸的开放读框。此cDNA或者是全长度,或者是接近于全长度,因为在所预测的起始密码子之前,框中有一个终止密码子。借助于RNA印迹分析也证实了此转录物的大小(未被显示)。所编码的酸性蛋白质(等电点5.02)具有作为最显著特征的C-末端RING-H2功能区,变异的RING-指功能区。预期将对细胞质定为靶标(www PSORT-服务器http//psort.nibb.ac.jp8800/)。此蛋白质将被进一步称为TGRING1。
数据库搜寻显示出二个被部分测序的EST-序列和一个已公布的具有超过RING-H2功能区的显著同源性的拟南芥(Arabidopsis)序列CIP8[COP-1相互作用蛋白8[13]]。EST-克隆,包括稻EST C10402和拟南芥EST TAI 386,是被要求的,并对它们作了全长度测序。最后,拟南芥EST-TAI 386序列已被作为AIP2公布,并将继续照此称呼,AIP2是一种ABI3相互作用蛋白[8]。稻EST另外将被称作OSRING1。
多重定位排列显示,这二个EST序列是与郁金香序列在跨越蛋白质的全长度高度同源的序列。OSRING1显示出在300个氨基酸的范围内有58%同源性和72%相似性,而AIP2在301个氨基酸的范围内分别是51%和64%。CIP8与TGRING1的同源性在C-末端部分最高,但延伸超过了RING-H2结构域(图1A)。进一步的数据库搜寻显示出,虽然来自各种真核生物门的许多序列包含有RING-H2结构域,但是某些序列包含带有由25-40个氨基酸组成的保守基元序列的RING-H2结构域,此基元序列正好在靠近此RING-H2结构域的N-末端。在来源于植物,动物和病毒的序列中发现了这些延伸的RING-H2结构域(图1b)。
TGRING1的表达与对照处理相比较,在低温处理期间底部节间TGRING1的表达水平较高(图2A)。在处理的较初期比处理的较后阶段表达水平较高。鳞茎种植之后,测定了不同组织中TGRING1的表达。在节间刚开始快速伸长的时刻测定在节间的表达,在花开始显色的时候测定花中的表达。根和叶末显示出快速生长阶段,所以可在任选的时刻测定其表达(图2B)。在花组织中检测到最高的表达,而在叶中最低。
我们曾表明,在郁金香低温诱导茎伸长的基本机制之一是,在几个月的低温处理过程中,底部节间对植物生长素的敏感度在逐渐改变。这点显示在,较长时间低温处理后,为诱导节间伸长和诱导初级植物生长素应答基因的基因表达需要增加植物生长素。通过应用差异显示分析,我们已分离出一个cDNA克隆,与对照处理相比较,在低温处理期间此cDNA克隆以较高的水平表达。它编码一个带有C-末端RING-H2结构域的蛋白质。
虽然这是在拟南芥和其它种类中许多蛋白质共有的特点,但是只有二个拟南芥的序列显示出遍及TGRING1全长度的同源性。其中之一的AIP2具有足够高的同源性,是真正的同源物。这点也适合于稻OSRING1,此序列像TGRING1一样具有稍微较高的同一性和相似性,因为它是来源于单子叶植物。拟南芥CIP8是一个较疏远的相关蛋白质。延伸的RING-H2结构域为这四种蛋白质共有,并超越植物领域被保留,表明这个结构域的特殊功能。
拟南芥的蛋白AIP2和CIP8是作为与发育调节剂相互作用的蛋白质被分离出。通过CIP8的RING-H2结构域和COP1的RING-指结构域的特异性相互作用,CIP8与COP1相互作用[13]。AIP2与ABI3的相互作用是由AIP2的C-末端-半介导的,此部分含有RING-H2结构域[8]。但是令人吃惊的是,它与不含有RING-指结构域的ABI3的B2和B3结构域相互作用。因此或者是不含有RING-H2结构域的AIP2 C-末端部分与ABI3相互作用,或者是RING-H2结构域可以同不具有明显序列同源性的不同结构域相互作用,尽管事实是RING-H2结构域在序列中是高度相似的(AIP2和CIP8的RING-H2结构域之间有43%同一性,71%相似性)。
可以将低温诱导的茎伸长看作是休眠突破的一种形式。树芽中的分层化,春化作用和休眠突破是由低温驱动的类似过程。现在令人感兴趣的是,TGRING1的拟南芥同源物AIP2是一个ABI3相互作用因子。拟南芥脱落酸-不敏感3(abi3)突变体最初被分离是由于在有抑制浓度脱落酸(ABA)存在时它能够促使发芽[7],并且它在胚成熟过程和休眠维持中具有作用[9]。最近发表的文献已显示ABI3在生长静止过程也具有作用。abi3-4突变体显示有快速的开花诱导作用,并且ABI3被表达在黑暗中生长的幼苗叶尖[8,11,12]。另一篇最近发表的文献提出RING指结构域在遍在蛋白-介导的蛋白水解作用对准目标中发挥功能。其中RING指蛋白作为遍在蛋白连接酶E3起作用[6]。
综合所有的这些事实,在此我们可证明,低温诱导的TGRING1表达在将郁金香的ABI3同源物定为蛋白水解目标的过程中发挥作用,并从而解除休眠状态,使植物能在有利条件下生长。分析在如分层化和春化作用过程中拟南芥中的AIP2,以及它对ABI3蛋白水平的影响,是进一步显示这种现象的方式,考虑到事实仍然是为了分析如郁金香种子休眠和低温诱导的开花等类似的现象,二种完全不同的途径将导致克隆具有上述RING-H2基元序列的同源性蛋白质。
冷分层化过程中AIP2的表达实验目的测定在低温诱导种子分层化过程中,克隆郁金香TGRING1的拟南芥同源物AIP2的表达带型(pattern)。
实验方案将干燥的Cape Verdian生态型拟南芥thaliana种子(Cvi,种植日期是6月21日,11月1日收获,11月11日开始实验,都在2001年)播种在湿滤纸上,放在或者20℃或者4℃的黑暗中持续1,3,5或7天。经过处理,将一部分种子在处理后转移至20℃光照中(16小时光照/8小时黑暗)以便测定发芽百分率,将其余的种子在液氮中冷冻,并贮存在-80℃用于RNA分离。在种子被放置在20℃光照中7天之后测定发芽百分率。如在对郁金香实验中所述的进行RNA提取和RNA印迹分析。
结果图4a和图4b显示在指明的处理天数之后AIP2的表达水平。AIP2探针与大约1200bp的单一电泳带杂交。在4℃温育1天之后,不论与干种子还是与在20℃温育的种子相比较,其表达水平都大大地提高了(相比较分别提高12倍和5倍)。与20℃处理相比较,低温处理过程中表达持续在较高的水平。
图4C显示在不同处理之后种子的发芽百分率。这些种子不是处于深度休眠状态,与保持在20℃的种子相比较低温处理也提高了其发芽百分率。在4℃3天或更多天之后发芽达100%。此结果表明,在冷分层化过程中拟南芥的AIP2 mRNA被强烈地上调了。这表明,AIP2蛋白不但保留在序列中而且在发挥功能,并且它甚至被功能性地保留在需要低温诱导的不同发育过程中,即郁金香中低温诱导的茎伸长和拟南芥中低温诱导的种子分层化。冷分层过程中表达提高与处理之后发芽百分率提高相关联。因为AIP2与ABI3相互作用,并且具有RING-H2功能区,所以很可能通过借助于遍在蛋白化的以ABI3蛋白为目标的蛋白水解而引发休眠突破,从而解除休眠状态。然后AIP2将起单体遍在蛋白连接酶E3的作用。同样地,郁金香TGRING1蛋白在低温诱导茎伸长的过程中可能具有同样的功能,此过程可以被看作休眠突破的一种形式。此实验表明,AIP2和同源性蛋白质对于休眠突破是明显标记。还表明,在同郁金香中低温诱导的茎伸长类似的另一过程即种子冷分层化中,RING结构域蛋白包含在休眠突破中。


图1A对来自拟南芥和稻的TGRING1和同源性蛋白作多重定位排列。当多于50%的残基相同时残基被涂黑,当多于50%的残基相似时被涂成灰色。完全保守性残基用星号指示,保守性取代用冒号指示,半保守性取代用小点指示。RING-H2功能区下面被划线,并在RING-H2功能区的N-末端延伸部分下面划虚线。
B.对从动物,植物和病毒来源的蛋白质延伸的RING-H2功能区作多重定位排列。涂色标志法同图1A。种类按如下指示Mm是MusMusculus(小鼠),Rr是Rattusrattus(大鼠),At是Arabidopsis(拟南芥)thaliana,Os是Oryzasattiva(稻),Hs是Homo Sapiens(人),Tg是Tulip(郁金香)gesneriana,以及Hh是人疱疹病毒。数据库查找号是PRAJA1 NP-032879,NDAP1 BAA06979,RHC2aAAC69860,os 329 BAA88184,hs 311 BAA91254和ICPO·P28284。
图2TGRING-1的表达带型A.与对照处理(17℃)相比较,低温处理期间郁金香节间底部中TGRING-1的表达。
B.种植后不同组织中TGRING-1的表达。在种植后0天节间底部中的表达水平被显示作为参照点。此表达水平与图2A中5℃处理12周时相同(图2A和图2B使用了不同的曝光时间)。其他的节间样品在它们开始快速生长的时刻采集;叶和根显示无指数生长期而在任意时刻采样,当开始显色时对花组织取样。每条电泳道用25μg总RNA。通过溴化乙锭染色校对相同的加样量(未被显示)图3TGRING1的核酸序列预测的327个氨基酸的开放读框由碱基104-1182序列编码,并被标示在此核酸序列上面。编码RING-H2结构域的碱基在下面划线标示。
图4a.在4℃或20℃处理期间吸涨的种子中AIP2的表达。使用了一种与此AIP2 mRNA序列碱基对665-1120互补的RNA探针(基因库检索号ATH251087)。此电泳带对应于大约1200个碱基对的大小,每条电泳道以8μg总RNA加样;嵌板底部显示出亚甲兰染色斑点以便表明加样品相等。ds标示干种子。
b.定量表示图4a中电泳带的强度。
c.在所标示的处理之后种子发芽的百分率。
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权利要求
1.一种用于调节植物发育转换的方法,包括调节该植物或其部分中RING指或RING-H2蛋白,或者其功能性片段的表达。
2.根据权利要求1的方法,其中的转换包括发芽,分层化,抽苔,开始开花或结果,低温诱导的茎伸长,休眠突破,鳞茎诱发,开花定时。
3.根据权利要求1或2的方法,包括导致靶标蛋白遍在蛋白化和/或蛋白水解,其中该靶标蛋白调节植物的发育转换。
4.根据权利要求3的方法,其中所述的靶标蛋白是发育调节蛋白。
5.根据权利要求4的方法,其中所述的调节蛋白包括脱落酸-不敏感3(ABI3)或其同源物。
6.根据权利要求1-5中任何之一的方法,其中所述的RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段含有C3HC4或C3H2C3基元序列或者与它功能等同的基元序列。
7.根据权利要求1-6中任何之一的方法,包括对所述植物提供编码RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段的核酸。
8.根据权利要求7的方法,其中该核酸是暂时被提供。
9.根据权利要求7或8的方法,其中该核酸与图3中显示的序列基本上等同。
10.根据权利要求1-9中任何之一的方法,其中所述的植物包括鳞茎。
11.根据权利要求1-10中任何之一的方法,包括加速所述的转换。
12.根据权利要求1-10中任何之一的方法,包括减慢所述的转换。
13.一种植物或植物细胞,它被提供了编码RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段的核酸。
14.一种用于确定植物处在的或者正逐渐发展达到的发育转换阶段的方法,包括测定该植物或其部分中RING指或RING-H2基因产物或其功能性片段的表达。
15.根据权利要求14的方法,包括测定对靶标蛋白的遍在蛋白化和/或蛋白水解作用,此靶标蛋白与所述的RING指或RING-H2基因产物或者其功能性片段相互作用,或者与其结合。
16.一种用于选择处于其发育过程某一转换阶段的植物的方法,包括测定RING指或RING-H2基因产物或者其功能性片段的表达。
17.根据权利要求16的方法,包括测定对靶标蛋白的遍在蛋白化和/或蛋白水解作用,此靶标蛋白与所述的RING指或RING-H2基因产物或者其功能性片段相互作用,或者与其结合。
18.根据权利要求11或12的方法,其中所述的转换包括发芽,分层化,抽苔,开始开花或结果,低温诱导的茎伸长,休眠突破,鳞茎诱发,开花定时。
19.一种可用根据权利要求16的方法选择的植物。
20.一种用于获得具有与发育转换过程相关的所希望品质特点的植物或其后代的方法,包括测定该植物或其部分中RING指或RING-H2基因产物或者其功能性片段的表达。
21.根据权利要求20的方法,包括测定对靶标蛋白的遍在蛋白化和/或蛋白水解作用,此靶标蛋白与所述的RING指或RING-H2基因产物或者其功能性片段相互作用,或者与其结合。
22.一种编码植物RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段的,被分离出的和/或重组的核酸,所述RING指或RING-H2蛋白或者其功能性片段含有与图3中所显示的序列至少有50%相同的氨基酸序列。
23.根据权利要求22的核酸,其中所述的植物包括鳞茎。
24.一种载体,含有根据权利要求22或23的核酸。
25.一种宿主细胞,含有根据权利要求22或23的核酸或者根据权利要求24的载体。
26.一种根据权利要求25的细胞,包括植物细胞。
27.一种植物或其部分,含有根据权利要求26的细胞。
28.根据权利要求22或2 3的核酸,或者根据权利要求24的载体在用于调节植物的方法中的用途。
29.根据权利要求28的用途,其中所述的方法包括调节该植物的发育转换。
全文摘要
本发明涉及一种调节植物生长或发育的方法。本发明提供了一种用于调节植物发育转换的方法,包括在该植物或它的某些部分调节RING-H2蛋白或其功能性片段的表达。
文档编号A01H5/00GK1498272SQ02806920
公开日2004年5月19日 申请日期2002年1月15日 优先权日2001年1月19日
发明者A·D·德贝尔, P·L·里特维尔德, A D 德贝尔, 里特维尔德 申请人:特殊研究股份有限公司
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