专利名称：用转基因技术提高林木抗旱性的方法
技术领域：
本发明涉及利用转基因技术提高林木抗旱性的方法。
背景技术：
干旱、低温和盐碱是影响植物分布、生长和作物产量的一个主要因素。应用植物基因工程方法培育抗旱、抗冻与耐盐碱植物新品种已成为现代植物育种的一个重要内容。对植物在干旱、低温与高盐等胁迫环境下的应答反应机制的阐明是其中一个重要部分。近年来，在拟南芥、西红柿、烟草、水稻、玉米和大豆等多种植物中发现了一类新的转录因子，这些转录因子因含有保守的AP2/EREBP DNA结合域而被称为AP2/EREBP转录因子。AP2/EREBP转录因子调控(激活或抑制)植物体内干旱、低温与高盐胁迫应答基因的表达，在植物胁迫应答与耐受逆境中发挥着重要的作用。
转录因子，也称为反式作用因子或DNA结合蛋白，是能够与基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白。植物许多诱导型基因定时、定量表达，都是由特定的转录因子与特定的顺式作用元件的相互作用所调控。刘强等1998年用酵母单杂交技术从拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)中分离得到五个DRE元件结合蛋白(DRE binding protein)基因，分别命名为DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB2A和DREB2B。这五个基因可以分为两类DREB1和DREB2，它们都含有AP2/EREBP结构域，但DREB1的表达受低温诱导，DREB2受干旱和高温的诱导(Qiang Liu，Mie Kasuga，Yoh Sakuma，Hiroshi Abe，etal.The Plant Cell，1998，101391-1406)。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用转基因技术提高林木抗旱性的方法，将DREB2A基因用于抗旱性林木新品种的培育。包括1.将DREB2A与植物表达载体构建pBin438嵌合体将目的基因DREB2A用双酶切从克隆载体pBlueScriptII SK(+)上切下，纯化后连接到pBin438载体上，得到DREB2A/pBin438嵌合体。
2.林木抗逆性的分子改良工作将DREB2A/pBin438嵌合体转化农杆菌LBA4404，通过平板培养选择含有嵌合体基因的农杆菌菌株。通过叶圆盘法将目的植物组培苗叶片与上述农杆菌工程菌共培养，经诱导愈伤和分化筛选得到转基因植株。
3.对所得抗旱转基因植株，用TTC法进行植株抗旱性测定，进而筛选抗旱植物新品种。
其中，本发明所用之DREB2A基因来源于拟南芥，其全长cDNA序列已在GenBank注册，注册号为AB007790。所用克隆载体为pBlueScriptII SK(+)，DREB2A在EcoRI位点插入。本发明人通过转化大肠杆菌菌株DH5；来扩增DREB2A/SK嵌合体基因。通过质粒提取提到该嵌合体，质粒提取法按照已知的碱裂解法进行。通过SalI和BamHI双酶切将DREB2A基因从pBlueScriptIISK(+)上切下，以琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收1.4kb左右大小的片段，得到DREB2A目的基因。
植物表达载体pBin438用大肠杆菌JM109菌株进行扩繁，按前述方法提取质粒。同样用SalI与BamHI进行双酶切。通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收13kb左右大小的片段。将上述回收之DREB2A与回收之pBin438按4∶1以上比例进行混合，用T4 DNA连接酶进行连接反应。连接产物转化大肠杆菌，通过平板培养筛选单菌落得到DREB2A/pBin438嵌合体基因。进一步扩繁后提取DREB2A/pBin438嵌合体，转化得到农杆菌工程菌。
将农杆菌工程菌与毛白杨、刺槐等植物组培苗的幼嫩叶片进行共培养，有关过程按已知的叶圆盘法进行。通过抗生素抗性筛选得到转基因植株。并对转基因植株进行PCR、Southern及Northern分析，证明外源基因已经整合到抗旱转基因植株中。
氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Tripheyl Tetrazolium Chloride，TTC)被广泛用作酶实验的氢受体，植物根所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。按照王华芳等的方法对转基因植株进行干旱处理(王华芳、尹伟伦、张建华等，林业科学，2000，362-8)，修改赵士杰等的方法对转基因植株进行耐旱性生理测定(赵士杰、刘华山、董新纯，植物生理学实验指导，北京农业科学技术出版社，199854-56)。确定所得转基因植株抗旱性已经得到改良。进而通过组织培养技术进一步快速扩繁所得转基因新品种。
具体实施例方式
实施例一植物表达载体的构建
1.目的基因的制备将拟南芥DREB2A基因与pBlueScriptII SK(+)质粒的融合基因转化大肠杆菌菌株DH5；，用含氨苄青霉素50mg/L的LB培养基37℃200rpm过夜培养。用碱裂解法提取质粒DNA。用BamHI与SalI双酶切DREB2A/pBlueScriptII SK(+)嵌合体，反应按SalI体系进行，加入同样浓度的BamHI酶，37℃消化30分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收约1.4kb大小的片段，即得到处理好的DREB2A基因。
2.载体DNA的制备所用植物表达载体pBin438为卡那霉素抗生素筛选、具有双增强子的35S强启动子。将pBin438转化JM109大肠杆菌菌株，用含卡那霉素50mg/L的LB培养基37℃200rpm过夜培养。用碱裂解法提取质粒DNA。用BamHI与SalI双酶切此质粒，反应按SalI体系进行，加入同样浓度的BamHI酶，37℃消化3小时。用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收约13kb大小的片段，即得到处理好的表达载体pBin438。
3.嵌合基因的构建将上述处理的pBin438和DREB2A基因按1∶4以上比例进行混合，用T4 DNA连接酶，16℃过夜反应。连接产物转化大肠杆菌菌株DH5，用含卡那霉素50mg/L的LB固体培养基进行平板培养，待菌斑长至2mm直径大小时，挑取进行含卡那霉素50mg/L的LB培养基37℃200rpm过夜培养。
按碱裂解法提取DREB2A/pBin438嵌合基因，分别通过SalI-XhoI、SalI-SmaI和HindIII三组酶切签定所构建DREB2A/pBin435嵌合基因方向正确，二者连接无误。
实施例二DREB2A基因在毛白杨、刺槐等植物中的转化1.农杆菌工程菌的制备上述DREB2A/pBin438嵌合基因按Horsch方法转化农杆菌菌株LBA4404(Horsch RB，Fry JE，Hoffman NL.，Science 1985，2271229-1231)，转化菌液用含50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的YEP固体培养基涂平板，待菌斑长至2mm直径大小时，挑取进行含卡那霉素50mg/L和50mg/L链霉素的YEP培养基28℃200rpm培养48小时。
2.植物叶盘法转化含DREB2A/pBin438嵌合基因的农杆菌接种于5ml含卡那霉素50mg/L和链霉素50mg/L的YEP培养基中，28℃200rpm培养过夜；用1/2MS稀释30倍用于共培养。将无菌苗叶片边缘和中脉用手术刀切去，沿与中脉垂直方向将叶片切成5-8mm宽的叶条，叶片切割后立即放入农杆菌菌液中浸泡30-40分钟。用镊子取出共培养的叶片，放到灭菌的滤纸上吸去过多的菌液，叶条移入含有共培养培养基的平皿中，28℃暗培养48小时。
3.转化植株的筛选将共培养叶片转移到含300mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的愈伤组织培养基上，使转化叶片充分接触培养基，有利于营养和激素的吸收，以及卡那霉素损伤未转化的细胞。两周后，将叶片转移到含同样抗生素的分化诱导培养基上，诱导分化芽的产生。每2-3天观察一次，小心切下小芽转移到含100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的生跟培养基上，诱导生跟；每3-7天观察一次，将生跟的植株转移到含相同培养基的较大的容器中培养。
4.转化植株的田间移植小心取出植株，清洗其跟部的琼脂，将植株转移到含10ml 1/10 MS无机盐溶液的容器中，稍打开盖子几小时。之后将植株移栽到湿润的土壤里；并用玻璃器皿或塑料袋罩上，直到新的根系形成后再移开。
实施例三TTC法测定植物抗旱性1.植物抗旱性处理苗木种植在土壤体积分别为3.4×10-3m3和11.5×10-3m3的大小明显不同的两种塑料盆里，同时浇水一次，浇透使土壤含水量达到饱和，以后不再浇水使土壤自然干旱。小盆土壤较大盆的慢因此形成急性干旱和缓慢干旱处理。为跟踪土壤干旱过程中的土壤含水量以及在植株干旱的生理状态基本相同的条件下恢复浇水，土壤干旱处理到植株出现明显干旱症状如叶片发白下垂时，再恢复浇水。
2.TTC法对植物根系抗旱性的定性测定将植物根仔细洗净，从茎基切除其地上部分，然后放入三角瓶；将1％TTC溶液，0.4mol/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1∶5∶4比例混合，制成反应液。将根浸于反应液中，暗处37℃放置1小时。观察，新根尖端几毫米以及侧根都明显变成红色，则表明该处有脱氢霉存在，根尚具有呼吸作用，植物具活力。
权利要求
1.一种提高林木抗旱能力的方法，包括a.将DREB2A与植物表达载体构建嵌合体；b.用上述嵌合体，用转基因方法进行林木抗逆性的分子改良工作；c.对上述抗旱转基因植株，进行植株抗旱性测定，进而筛选抗旱植物新品种。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DREB2A基因为来源于拟南芥。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，本发明所用的植物表达载体是pBin438。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的林木是毛白杨、刺槐、美洲黑杨、国槐、月季、菊花。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗逆性是指抗旱、耐旱性、抗冻性、耐受低温性和抗盐、耐盐性。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，本发明用TTC法对植株抗旱性进行测定。
全文摘要
本发明提供了一种利用转基因技术提高林木抗旱性的方法，包括将来源于拟南芥的DREB2A基因向植物表达载体pBin438的构建，用得到的嵌合体通过叶圆盘法转化目的植物组培苗叶片，经诱导愈伤和分化筛选得到转基因植株。用本方法建立的转基因技术平台进行杨树、槐树等植物的转基因工作，通过抗生素抗性筛选得到转基因植株。并对转基因植株进行PCR、Southern及Northern分析，证明外源基因已经整合到抗旱转基因植株中。通过TTC法从生理水平上测定植物根系耐旱性活力。进而通过组织培养技术与田间中试进一步选育优良抗性转基因林木新品种。
文档编号A01H5/00GK1544626SQ20031011534
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月20日 优先权日2003年11月20日
发明者曾会明, 王华芳, 尹伟伦, 陈受宜, 刘强, 夏新莉 申请人:北京林业大学