专利名称：小麦高效遗传转化技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种获得小麦高效遗传转化的方法。
背景技术：
在转基因小麦的研究中，基因枪法是目前获得小麦转基因植株的主要方法。
目前被公认并被广泛采用的基因枪转化受体是未成熟胚及其衍生物。但是，应用此转化系统获得的基因转化效率偏低， 仅可以达到0.1％-2.5％。而且其转化效率还要受到基因型的影响，尤其是，将近20％的基因型很难得到再生植株。因此，一些综合农艺形状好的品种由于再生性差无法获得转基因植株，而少数再生性强的品种又不是生产实践所需要的或在生产实践中的应用很有限。
发明内容
本发明的目的是克服现有的转化系统转化效率低的缺点，建立一种可以得到较多的转基因植株，获得较高的基因转化频率的转化方法。
本发明的方案是通过选择适宜外植体、调整培养基成份和配套改进措施，将外源目的基因导入小麦，以获得较高的基因转化频率。
本发明选用了3个品种的植物材料进行了研究。研究了小麦不同外植体对离体培养的反应及小麦不同外植体基因枪转化效率。发现以适宜时期(护颖分化期到雌雄蕊原基分化期)的幼穗作为外植体，在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，在幼穗愈伤组织生长旺盛期进行基因枪转化，可以获得较高的基因转化频率。
本方法在分化筛选后增加一个芽苗的诱导及伸长阶段，可以更好地达到本发明的目的。
具体方法步骤如下1.将幼穗作为外植体接种于诱导培养基上；2.愈伤组织生长旺盛期，用基因枪轰击幼穗愈伤组织；3.将上述愈伤组织转至筛选培养基上进行Basta抗性筛选；4.将经筛选的愈伤组织转至芽苗伸长培养基上；5.移栽幼苗长至15cm高时用Basta进行再次筛选。
6.转化株叶片进行PCR检测。
本发明对三个基因型的适时幼穗和相应的未成熟胚进行了离体对照培养。结果显示以适时幼穗作为外植体进行离体培养的绿苗分化率高于其相应的未成熟胚。表明以幼穗作为外植体进行基因转化能获得较高的绿苗分化率。
在进行小麦不同外植体基因枪转化效率的研究中发现，以幼穗愈伤组织作为基因枪转化受体时，基因转化效率较高，可达到2.53％～8.16％；而以未成熟胚愈伤组织作为基因枪转化受体的对比实验中，或未获能得阳性植株，或转化效率只有0.91％。表明本发明以幼穗作为外植体接种进而进行基因枪转化可以获得较高的基因转化频率。
本发明研究的以幼穗作为转化受体的转化系统克服了以往的转化系统的转化效率低的缺点，可以得到较多的转基因植株，获得较高的基因转化频率，转化效率最高可达到8.16％，是一种高效的小麦基因转化体系。
具体实施例方式实施例一.材料与方法1.植物材料准备选择综合农艺性状较好的藁城8901、H6756和H311为试验材料，取田间护颖至雌雄蕊原基形成期的幼穗，用0.1％HgCl2消毒，无菌水冲洗。
2.培养基愈伤组织的诱导和继代培养基为MS+2mg/l 2.4-D高渗培养基为MS+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇诱导筛选培养基MS+0.2mg/L 2，4-D+5mg/L Basta分化筛选培养基MS+5mg/L Basta芽苗伸长培养基MS+0.2mg/1NAA+1.5mg/1BA生根培养基1/2MS+0.2mg/L IAA3.培养条件愈伤组织诱导为25℃暗培养，愈伤组织分化培养为26℃14h/10h光照培养。
4.微粒子弹的制备称取60mg金粉于1.5ml离心管中，加入1ml70％乙醇，用旋涡混合器混合，离心去上清液，用无菌水重复洗3次，加入1ml 50％的无菌甘油，并用旋涡混匀。取50μl上述制备的金粉至一无菌离心管中，顺序加入5μl质粒DNA、50μl2.5MCaCl2和50μl0.1M亚精胺，将混合物旋涡、离心、去上清夜。用70％乙醇和100％乙醇各沉淀1次，最后用48μl100％乙醇重新悬浮、分散颗粒。
5.PCR检测条件反应体系为10μL，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50s，41℃复性40s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min，4℃保存。
二.试验步骤1.取藁城8901、H6756和H311三个品种护颖至雌雄蕊原基形成期的幼穗，作为外植体；接种前用0.1％HgCl2消毒8-10分钟，无菌水冲洗2-3次，于超净台中剥离出幼穗接种于诱导培养基上。
2.接种一周左右在愈伤组织生长旺盛期将幼穗愈伤组织摆放于高渗培养基的培养皿中央，6小时后用Bio-Rad公司生产的PDS-1000/He型基因枪轰击。轰击压力为1100psi，真空度为27-28pa，转化材料与微弹之间的距离为7cm。
3.轰击后18h，将愈伤组织转至诱导培养基上恢复培养10天。
4.恢复培养后的愈伤组织转至诱导筛选培养基上进行Basta抗性筛选，20天后转至分化筛选培养基上筛选。
5.分化筛选后转至芽苗伸长培养基上，该培养基能有效促使大量弱小芽苗生长，从而大幅提高绿苗分化率。
6.再生绿苗转至生根培养基上(1/2MS+0.2mg/L IAA)壮苗。最后将含有健壮根系的绿苗经0～4℃春化处理，炼苗移栽。
7.移栽幼苗长至15cm高时，用棉签沾取100mg/L的Basta溶液涂抹转化株的叶片，10天后观察叶片坏死情况。
8.剪取具有除草剂抗性的转化株的叶片，采用CTAB法提取总DNA，进行PCR检测。
三.实验结果1.小麦不同外植体对离体培养的反应本试验对三个基因型的适时幼穗和相应的未成熟胚进行了离体培养，结果见表1。
表1.不同品种及外植体离体培养结果品种名称 外植体接种数 出愈数 出愈率(％) 转分化愈伤 绿苗数绿苗分化率(％)H6756 适时幼穗 95 95 100 58 32 55.17未成熟胚 100 100 100 63 711.11H311 适时幼穗 80 80 100 70 32 45.71未成熟胚 100 98 98 60 58.33
藁城8901适时幼穗100 99 99 80 60 75未成熟胚100 100 100 80 55 68.75以上结果可看出，H6756和H311，以幼穗作为外植体离体培养绿苗分化率分别为55.17％和45.71％，其相应的未成熟胚的绿苗分化率只有11.11％和8.33％；藁城8901幼穗绿苗分化率为75％，高于未成熟胚绿苗分化率68.75％。
结论适时幼穗作为外植体进行离体培养的绿苗分化率高于其相应的未成熟胚，以幼穗作为外植体进行基因转化能获得较高的绿苗分化率。
2.小麦不同外植体基因枪转化效率用基因枪分别轰击H6756、H311和藁城8901三个品种(品系)幼穗诱导的胚性愈伤组织及未成熟胚诱导的胚性愈伤组织。
三组对比实验中，基因转化效率分别为5.36％和0、2.53％和0、8.16％和0.91％。具体结果见表2。
表2 不同外植体基因转化结果品种名称外植体 轰击外植Basta抗性 Basta抗性株PCR阳性株数PCR阳性株率体总数 株数率(％)(％)H6756 适时幼穗932 205 22.00 50 5.36未成熟胚431 0 0 0 0H311适时幼穗475 70 14.74 12 2.53未成熟胚199 0 0 0 0藁城8901适时幼穗49 13 26.53 4 8.16未成熟胚881 440 49.94 8 0.91从以上结果可以看出，以幼穗愈伤组织作为基因枪转化受体时，基因转化效率较高，最高可达到8.16％，最低为2.53％，而以未成熟胚愈伤组织作为基因枪转化受体时，转化效率最高只有0.91％，特别是H6756和H311均未获得阳性植株。
结论以幼穗作为外植体接种进而进行基因枪转化可以获得较高的基因转化频率。
权利要求
1.一种小麦高效遗传转化方法，其特征是将护颖分化期到雌雄蕊原基分化期的小麦幼穗作为外植体，在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，在幼穗愈伤组织生长旺盛期进行基因枪转化。
2.权利要求1所述的方法，在幼穗愈伤组织分化筛选后增加一个芽苗的诱导及伸长阶段。
3.权利要求2所述的方法，具体方法步骤是1)将幼穗作为外植体接种于诱导培养基上；2)愈伤组织生长旺盛期，用基因枪轰击幼穗愈伤组织；3)将上述愈伤组织转至筛选培养基上进行Basta抗性筛选；4)将经筛选的愈伤组织转至芽苗伸长培养基上；5)移栽幼苗长至15cm高时用Basta进行再次筛选。6)转化株叶片进行PCR检测。
全文摘要
本发明涉及一种获得小麦高效遗传转化的方法。本发明通过选择适宜外植体、调整培养基成分和配套改进措施，将外源目的基因导入小麦。本发明以适宜时期(护颖分化期到雌雄蕊原基分化期)的幼穗作为外植体，在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，在幼穗愈伤组织生长旺盛期进行基因枪转化。本发明研究的以幼穗作为转化受体的转化系统克服了以往的转化系统的转化效率低的缺点，可以得到较多的转基因植株，获得较高的基因转化频率，转化效率最高可达到8.16％，是一种高效的小麦基因转化体系。
文档编号A01H1/04GK1618278SQ20031011534
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月20日 优先权日2003年11月20日
发明者刘录祥, 赵林姝, 梁欣欣, 郑企成, 王晶, 赵世荣, 郭会君, 陈文华 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所