专利名称：牡丹规范化快繁方法
技术领域：
本发明涉及植物学领域。更佳的是，本发明涉及一种规模化快速繁殖牡丹的方法。
背景技术：
牡丹(Paeonia suffruticosa)是我国的候选国花，素有国色天香和百花之王的美誉，起源于我国，已演变成四大种群。国内利用高新技术，在牡丹新品种的选育和温控化控调节花期方面也已取得了很大进展。但牡丹名特优品种因长期人工栽培，大部分结实能力降低，种子发育不良而只能进行无性繁殖，在用远缘杂交培育品种时也常遇到杂交不育或种子发育不良不能萌发等问题。这些因素对牡丹名特优品种的繁育及推广造成影响。因此，本领域迫切需要建立一种新的快速繁殖牡丹的方法。
发明内容
具体而言，针对上述问题，本发明提供了一种快速繁殖牡丹的方法，该方法包括以下步骤a)取植株腋芽茎尖和嫩叶叶柄置于基本培养基中培育至形成愈伤组织并分化出芽，其中所述基本培养基中添加了一种或多种选自6-苄基氨基嘌呤、激动素、吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸、赤霉酸、水解乳蛋白、活性炭、蔗糖的物质；b)从愈伤组织上切下丛生芽，将其转移到加有苄基氨基嘌呤、吲哚丁酸和赤霉酸的基本培养基上培养至单芽长至3-5cm高；c)切下步骤b)中的所述单芽，用滤纸桥法将其插入含吲哚丁酸的溶液中处理18-24小时，然后再转入加有吲哚丁酸、苄基氨基嘌呤、活性炭和蔗糖而大量元素浓度减半的MS固体培养基中，培养25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株；d)移栽步骤c)形成的小植株。
本文中所用的术语“腋芽、茎尖、嫩叶、叶柄”具有本领域技术人员通常所知晓的含义，因此其对于本领域技术人员而言是清楚。
术语“基本培养基”具有本领域技术人员通常所知道的含义，如MS培养基或添加了有机添加物B5的MS培养基(即MSB培养基)。
在一个较佳的实施方案中，将腋芽茎尖接种到含苄基氨基嘌呤0.5-1.5毫克/升，激动素0.1～0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培养基中使其形成愈伤组织并分化成芽。最适宜的培养基配方为含苄基氨基嘌呤1.0毫克/升、激动素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培养基。如果在仅加细胞分裂素而无赤霉酸的培养基上培养，则由长大的腋芽基部叶柄内侧处直接形成丛生的芽簇，最多的可分化出具20多个芽的芽丛。这种芽叶子生长较快，但茎的抽出速度却较缓慢。
在另一实施方案中，将嫩叶叶柄置于含水解乳蛋白300-800毫克/升、苄基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升和萘乙酸0.1～0.5毫克/升的MSB培养基上，进行诱导愈伤组织培养。在形成愈伤组织后，将愈伤组织转移到有苄基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升、吲哚乙酸0.2-0.5毫克/升的新鲜的MSB基本培养基上进行分化芽培养。最佳的是，诱导愈伤组织培养基为含水解乳蛋白500毫克/升、苄基氨基嘌呤2.0毫克/升、萘乙酸0.3毫克/升的MSB培养基。最适宜的芽分化培养基为含苄基氨基嘌呤2.0毫克/升、吲哚乙酸0.3毫克/升的MSB培养基。
在另一较佳的实施方案中，在上述步骤(b)之后、步骤(c)之前还包括一个步骤将从愈伤组织上切下的丛生芽置于培养基中培育至再次形成愈伤组织和丛生芽，并可重复该步骤以获得大量丛生芽苗。所述培养基的配方宜为含苄基氨基嘌呤0.5-2.0毫克/升、激动素0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培养基，更佳的为含苄基氨基嘌呤1.0毫克/升、激动素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培养基。
为了便于切取单芽进行根的诱导长成牡丹小植株，可把小芽丛及时转移到附加苄基氨基嘌呤0.1-0.5毫克/升、吲哚丁酸0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培养基(更佳为附加苄基氨基嘌呤0.2毫克/升、吲哚丁酸0.2毫克/升、赤霉酸0.2毫克/升的MSB培养基)上，再培养30-40天，使丛芽的芽长到3-4cm高。
在步骤c)中，可将切下步骤b)中的单芽先插入含吲哚丁酸30-80ppm(较佳为50ppm)的溶液中处理18-24小时，然后再转入加有吲哚丁酸1.0-3.0毫克/升(较佳为2.0毫克/升)、苄基氨基嘌呤0.05-0.15毫克/升(较佳为0.1毫克/升)、0.4-0.6％活性炭和2-4％蔗糖而大量元素浓度减半的MS固体培养基中，培养25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株。在较佳的实施方案中，所述培养基中还可添加PVP等抗氧化剂以基本解决牡丹试管苗的褐变。通过使用较低的激素浓度、增加光强度和及时进行丛生芽分割，可有效地解决了牡丹试管苗的早衰、枯死及玻璃苗的技术难题。
在步骤d)中，可用常规手段对步骤c)获得的完整小植株进行移栽。
本发明的方法应用植物细胞组织工作技术，建立了一种牡丹规模化快速繁殖方法，使之能进入工厂化生产的阶段，形成年产牡丹试管苗1万株能力的规模化生产程序。
附图简述
图1显示了从腋芽和嫩叶叶柄培育获得可用于移栽的完整小植株的一个较佳实施流程，图中BA表示6-苄基氨基嘌呤、KT表示激动素、IAA表示吲哚乙酸、NAA表示萘乙酸、IBA表示吲哚丁酸、GA3表示赤霉酸、LH表示水解乳蛋白。
具体实施方案下面将结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在本申请中，除非另有所述，所有试剂的单位均用毫克/升表示。
材料和方法试验材料牡丹(Paeonia suffruticosa)名贵品种为“青龙卧墨池”；“十八号(瑞红)”；“姚黄”；“魏紫”；“百花妒”，常观品种为“洛阳红”；“胡红”；“赵粉”；“胭脂红”；“乌龙捧盛”共十个品种，由河南先农公司提供。
1)腋芽的培养三月上中旬取上述10个品种的植株的腋芽，从腋芽上剥取4～6mm长的茎尖，用75％酒精浸泡30秒钟，然后在5％的次氯酸钠溶液中浸泡8～10分钟进行表面灭菌，再用无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干后，将外植体接种到含苄基氨基嘌呤0.5-1.5毫克/升，激动素0.1～0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培养基上进行培养，培养温度为25±1℃，每天照光10小时，光强为1500～2000勒克斯。接种后2-3周，外植体先膨大并肉质化，尔后在其基部周围逐渐愈伤组织化，经5～6周，基部形成一团略带紫红色的愈伤组织，并由愈伤组织分化出芽。
2)嫩叶叶柄的培养三月中下旬取上述10个品种的植株嫩叶叶柄作离体培养的材料。将嫩叶叶柄切断成长约6～7mm长的切段，用75％酒精浸泡30秒钟，然后在5％的次氯酸钠溶液中浸泡8～10分钟进行表面灭菌，再用无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干后，将外植体放在加有水解乳蛋白500、苄基氨基嘌呤2.0和萘乙酸0.1～0.5的MSB培养基上，进行诱导愈伤组织培养。培养温度为25±1℃，每天照光10小时，光强为1500～2000勒克斯。叶柄切段培养15-20天后，从切口处先开始形成愈伤组织。随后形成的愈伤组织生长迅速，大约1个半月后，整个外植体都长成愈伤组织块。将愈伤组织转移到附加苄基氨基嘌呤2.0、吲哚乙酸0.2-0.5的新鲜的MSB基本培养基上进行分化芽培养，再经6-8周培养，10个品种的叶柄切段愈伤组织，其分化芽的频率为40-90％左右，平均每块愈伤组织可形成8-20个芽的芽丛。
3)丛生芽的继代培养将愈伤组织块上的丛生芽分割，在新鲜的MSB+苄基氨基嘌呤1.0+激动素0.3+赤霉酸0.3的培养基上培养，经1.5-2个月左右的培养，又产生愈伤组织及丛生芽，经试验平均每隔二个月就可继代培养产生丛生芽一次，有效芽的增殖系数可达4-6。这样，通过一年的连续继代分化程序培养，就可得到4千-1万个试管芽苗。
4)丛生芽的伸长及根的诱导把小芽丛及时转移到附加苄基氨基嘌呤0.2、吲哚丁酸0.2、赤霉酸0.2的MSB培养基上，再培养30-40天，使丛芽的芽长到3-4cm高，便于切取单芽进行根的诱导长成牡丹小植株。切取芽丛中长到3-4cm高的单芽，先使单芽基部切口处阴干收疤1个小时左右，然后用滤纸桥法将其插入含50ppm吲哚丁酸的溶液中处理18-24小时(芽基部插入溶液中的深度为2-3mm)，然后用无菌滤纸吸干，再转入附加吲哚丁酸2.0、苄基氨基嘌呤0.1、0.5％活性炭、2％蔗糖，而大量元素浓度减半的MS固体培养基中，培养大约7-10天后在芽的基部切口处即开始形成锯齿状凸起，2-3星期左右由此长成白嫩粗壮的初生根。再经25-35天即可形成具良好的根系的牡丹小植株。在该试验条件下，牡丹试管苗诱导生根率可达90-95％。
5)由腋芽、嫩叶的叶柄培养年繁殖获得的牡丹试管苗发明人在2003-2004年期间对牡丹的10个品种繁殖的牡丹试管苗数如下表所示
6)牡丹试管小植株的移栽当牡丹试管小植株诱导出3-4条根，并长到2-3cm长时即可移栽。移栽前，将瓶塞打开加入少许无菌水淹没固体培养基，放入阳光充足、通风处炼苗3-4天。取出小植株后，用温水冲去琼脂，将试管小植株直接移栽到盛沙性的中性土壤或用1/2MS大量元素湿润的蛭石的盆中。移栽后，用透明薄膜加以覆盖，以免过度蒸腾并保持一定湿度。一周后逐步揭开透明薄膜，二周后去掉薄膜，牡丹小植株即可成活正常生长。结果表明，牡丹试管小植株的移栽成活率达到85-90％。
综上所述，通过三年多的培养试验，发明人已能从牡丹的10个品种(包括5个名贵品种和5个早、中、晚花期的常规品种)的腋芽、嫩叶的叶柄培养，分别获得丛生芽，经继代或伸长培养，切割单芽诱导生根，基本解决了牡丹试管苗生根难的问题。根据本实施例所确定的条件，试管苗生根率可达90-95％。分割丛生芽经继代培养和伸长培养，在2003-2004年度，发明人达到了年繁殖牡丹试管苗5500多株的水平。据统计其有效繁殖系数可达4-6，每隔2.5-3个月继代及伸长一次，如在开始阶段能提供200个以上的腋芽、嫩叶的叶柄外植体，则就能形成一套年产牡丹试管苗1万株能力的规模化生产程序及工艺。
权利要求
1.一种快速繁殖牡丹的方法，该方法包括以下步骤a)取植株腋芽茎尖或嫩叶叶柄置于基本培养基中培育至形成愈伤组织并分化出芽，其中所述基本培养基中添加了一种或多种选自6-苄基氨基嘌呤、激动素、吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸、赤霉酸、水解乳蛋白、活性炭、蔗糖的物质；b)从愈伤组织上切下丛生芽，将其转移到加有苄基氨基嘌呤、吲哚丁酸和赤霉酸的基本培养基上培养至单芽长至3-5cm高；c)切下步骤b)中的所述单芽，用滤纸桥法将其插入含吲哚丁酸的溶液中处理18-24小时，然后再转入加有吲哚丁酸、苄基氨基嘌呤、活性炭和蔗糖而大量元素浓度减半的MS固体培养基中，培养25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株；d)移栽步骤c)形成的小植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，将腋芽茎尖接种到含苄基氨基嘌呤0.5-1.5毫克/升，激动素0.1～0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培养基中使其形成愈伤组织并分化成芽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基的配方为含苄基氨基嘌呤1.0毫克/升、激动素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，将嫩叶叶柄置于含水解乳蛋白300-800毫克/升、苄基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升和萘乙酸0.1～0.5毫克/升的MSB培养基上，进行诱导愈伤组织培养；在形成愈伤组织后，将愈伤组织转移到有苄基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升、吲哚乙酸0.2-0.5毫克/升的新鲜的MSB基本培养基上进行分化芽培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，诱导愈伤组织培养基为含水解乳蛋白500毫克/升、苄基氨基嘌呤2.0毫克/升、萘乙酸0.3毫克/升的MSB培养基；芽分化培养基为含苄基氨基嘌呤2.0毫克/升、吲哚乙酸0.3毫克/升的MSB培养基。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)之后、步骤(c)之前还包括一个步骤将从愈伤组织上切下的丛生芽置于培养基中培育至再次形成愈伤组织和丛生芽，并可重复该步骤以获得大量丛生芽苗，其中所述培养基为含苄基氨基嘌呤0.5-2.0毫克/升、激动素0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养基为含苄基氨基嘌呤1.0毫克/升、激动素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，使小芽丛转移到附加苄基氨基嘌呤0.1-0.5毫克/升、吲哚丁酸0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培养基上再培养30-40天，使丛芽的芽长到3-4cm高。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，将切下步骤b)中的单芽先插入含吲哚丁酸30-80ppm的溶液中处理18-24小时，然后再转入加有吲哚丁酸1.0-3.0毫克/升、苄基氨基嘌呤0.05-0.15毫克/升、0.4-0.6％活性炭和2-4％蔗糖而大量元素浓度减半的MS固体培养基中，培养25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养基还含有抗氧化剂。
全文摘要
本发明公开了一种快速繁殖牡丹的方法，该方法包括a)取植株腋芽茎尖或嫩叶叶柄置于培养基中培育至形成愈伤组织并分化出芽，b)从愈伤组织上切下丛生芽，将其培养至单芽长至3－5cm高；c)将步骤b)的单芽插入含吲哚丁酸的溶液中，再转入加有吲哚丁酸、苄基氨基嘌呤、活性炭和蔗糖而大量元素浓度减半的MS固体培养基中培养，形成小植株；d)移栽步骤c)形成的小植株。本发明应用植物细胞组织工作技术，建立了一种牡丹规模化快速繁殖方法，形成了年产牡丹试管苗1万株能力的规模化生产程序。
文档编号A01H4/00GK1768576SQ20041006776
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者卫志明 申请人:中国科学院上海生命科学研究院