在遗传修饰的非人生物中制备酮类胡萝卜素的方法

专利名称：在遗传修饰的非人生物中制备酮类胡萝卜素的方法
技术领域：
本发明涉及培养遗传修饰的生物来制备酮类胡萝卜素的方法，所述遗传修饰生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性及修饰的β环化酶活性；还涉及经过遗传修饰的生物和它们作为用以生产酮类胡萝卜素提取物的食品和饲料的用途。
背景技术：
类胡萝卜素是在细菌、藻类、真菌及植物中从头合成的。酮类胡萝卜素，即含有至少一个酮基的类胡萝卜素，例如虾青素(Astaxanthin)、角黄素(Canthaxanthin)、海胆酮(echinenone)、3-羟基海胆酮(3-Hydroxyechinenon)、3’-羟基海胆酮(3’-Hydroxyechinenone)、金盏花玉红质(adonirubin)和金盏花黄质(adonixanthin)等天然抗氧化剂和色素，是某些藻类和微生物产生的次级代谢产物。
鉴于其着色特性，酮类胡萝卜素(尤其是虾青素)被用作动物饲料的色素添加剂，特别是用于鳟鱼、鲑鱼和虾的养殖中。
目前虾青素的制备主要是通过化学合成的方法进行的。现在，通过培养藻类(如雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))或发酵基因工程最优化的微生物并加以分离的生物技术方法，可以获取少量天然酮类胡萝卜素(例如天然虾青素)。
因此，经济的用于制备天然酮类胡萝卜素的生物技术方法至关重要。
业已从多种生物中分离出编码酮酶的核酸以及相应蛋白质序列，并注释为如编码橙黄农杆菌(Agrobacterium aurantiacum)来源酮酶的核酸(EP735 137，登陆号D58420)，来源于产碱菌属种PC-1(Alcaligenes sp.PC-1)(EP 735137，登陆号D58422)，雨生红球藻Flotow em.Wille和雨生红球藻，NIES-144(EP 725137，WO 98/18910；Lotan等，FEBS Letters 1995，364，125-128，登陆号X86782及D45881)，Paracoccus marcusii(登陆号Y15112)，聚球藻属(Synechocystis sp.)PC6803株(登陆号NP_442491)，慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)(登陆号AF218415)以及念珠藻属(Nostocsp.)PCC 7120(Kaneko等，DNA Res.2001，8(5)，205-213；登陆号AP003592，BAB74888)的核酸。
EP735 137描述了将橙黄农杆菌或产碱菌属PC-1来源的酮酶基因(crtW)插入微生物，从而在微生物(如 E.coli)中制备叶黄素(xanthophylls)的方法。
从EP 725137、WO 98/18910、Kajiwara等(Plant Mol.Biol.1995，29，343-352)及Hirschberg等(FEBS Letters 1995，364，125-128)可知将雨生红球藻来源的酮酶基因(crtW，crtO或bkt)插入E.coli，以制备虾青素的方法。
Hirschberg等(FEBS Letters 1997，404，129-134)描述了将雨生红球藻来源的酮酶基因(crtO)插入聚球藻(Synechococcus)中制备虾青素。Sandmann等(Photochemistry and Photobiology 2001，73(5)，551-55)描述了类似的方法，但其导致了角黄素的产生，且仅能产出微量的虾青素。
WO 98/18910及Hirschberg等(Nature Biotechnology 2000，18(8)，888-892)描述了将雨生红球藻来源的酮酶基因(crtO)插入烟草中，在烟草花的蜜腺中合成酮类胡萝卜素。
WO 01/20011描述了在油料种子植物(如油菜籽、向日葵、大豆以及大麻)的种子中，使用种子特异性的启动子以及雨生红球藻来源的酮酶，通过DNA构建体生产酮类胡萝卜素，尤其是虾青素。
现有技术中描述的制备酮类胡萝卜素的所有方法，尤其是所述的用于制备虾青素的方法具有以下不足之处。一方面，产率仍然不如人意；另一方面，转基因生物产生了大量的羟基化副产物(例如玉米黄质和金盏花黄质)。

发明内容
因此，本发明的目标在于提供通过培养遗传修饰的非人生物制备酮类胡萝卜素的方法；或进一步提供经过遗传修饰的能产生酮类胡萝卜素的非人生物，其减轻或不再具有上述现有技术的不足，或者能以更高产率生产所需的酮类胡萝卜素。
据此，已经发现了通过培养遗传修饰的生物来制备酮类胡萝卜素的方法，所述遗传修饰生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性及修饰的β环化酶活性，而其修饰的β环化酶活性是由于该β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列，或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
“与野生型相比修饰的酮酶活性”，在起始生物或野生型不具酮酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比造成的酮酶活性”。
“与野生型相比修饰的酮酶活性”，在起始生物或野生型具有酮酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比增加的酮酶活性”。
“与野生型相比修饰的β环化酶活性”，在起始生物或野生型不具β环化酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比造成的β环化酶活性”。
“与野生型相比修饰的β环化酶活性”，在起始生物或野生型具有β环化酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比增加的β环化酶活性”。
本发明的非人生物(如微生物或植物)优选起始生物时能够天然产生类胡萝卜素(如β-胡萝卜素或玉米黄质)，或能够通过遗传修饰(例如代谢途径的再调节或互补)生产类胡萝卜素(如β-胡萝卜素或玉米黄质)。
作为起始或野生型生物，一些生物已经能够产生酮类胡萝卜素，例如虾青素或角黄素。这些生物，如雨生红球藻、Paracoccus marcusii、Xanthophyllomyces dendrorhous、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、绿球藻(Chlorococcum)、Phaffia rhodozyma、pheasant′s-eye、Neochloris wimmeri、原管藻(Protosiphon botryoides)、Scotiellopsis oocystiformis、Scenedesmusvacuolatus、Chlorela zofingiensis、Ankistrodesmus braunii、血红裸藻(Euglena sanguinea)和Bacillus atrophaeus，作为起始或野生型生物，已经具有酮酶活性和β环化酶活性。
术语“野生型”，根据本发明应理解为相应的起始生物。
根据上下文，术语“生物”可以理解为非人起始生物(野生型)，或本发明中经过遗传修饰的非人生物，或二者兼之。
优选地，特别是在不能明确指定植物或野生型的情况下，“野生型”在每种情况下是指用于判定下列活性变化的参照生物即酮酶活性的增加或造成、下文描述的羟化酶活性的增加或造成、下文描述的β环化酶活性的增加或造成、下文描述的HMG-CoA还原酶活性的增加、下文描述的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性的增加、下文描述的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性的增加、下文描述的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性的增加、下文描述的异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性的增加、下文描述的牻牛儿基二磷酸酯合酶活性的增加、下文描述的法呢基二磷酸酯合酶活性的增加、下文描述的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性的增加、下文描述的八氢番茄红素合酶活性的增加、下文描述的八氢番茄红素去饱和酶活性的增加、下文描述的ζ-胡萝卜素去饱和酶活性的增加、下文描述的crtISO活性的增加、下文描述的FtsZ活性的增加、下文描述的MinD活性的增加、下文描述的ε-环化酶活性的增加和下文描述的内源β-羟化酶活性的降低，以及酮类胡萝卜素含量的增加。
对于野生型已具有酮酶活性的微生物而言，该参照生物优选雨生红球藻。
对于野生型不具有酮酶活性的微生物而言，该参照生物优选布拉霉(Blakeslea)。
对于野生型即已具有酮酶活性的植物而言，该参照生物优选夏侧金盏花(Adonis aestivalis)、火焰金盏花(Adonis flammeus)或Adonis annuus，特别优选夏侧金盏花。
对于野生型其花瓣中不具有酮酶活性的植物而言，该参照生物优选万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、普林万寿菊(Tagetes Pringlei)、Tagetes palmeri、小万寿菊(Tagetes minuta)或钟形万寿菊(Tagetes campanulata)，特别优选万寿菊。
酮酶活性应理解为酮酶的酶活性。
酮酶是指一种蛋白质，其具有在任选取代的类胡萝卜素β-芷香酮环上引入酮基的酶活性。
特别地，酮酶指具有将β-胡萝卜素转变成角黄素的酶活性的蛋白质。
据此，酮酶活性是指一定时间内由酮酶蛋白质反应的β-胡萝卜素的量或生成的角黄素的量。
本发明方法的实施方案之一使用的起始生物为作为野生型或起始生物已经具有一定酮酶活性的非人生物(如如雨生红球藻、Paracoccusmarcusii、Xanthophyllomyces dendrorhous、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、绿球藻(Chlorococcum)、Phaffia rhodozyma、pheasant′s-eye、Neochloris wimmeri、原管藻(Protosiphon botryoides)、Scotiellopsisoocystiformis、Scenedesmus vacuolatus、Chlorela zofingiensis、Ankistrodesmus braunii、血红裸藻(Euglena sanguinea)或Bacillusatrophaeus。在该实施方案中，遗传修饰导致了与野生型或起始生物相比酮酶活性的增加。
当相比于野生型酮酶活性增加时，与野生型相比，在一定时间内由酮酶蛋白质酮酶反应的β-胡萝卜素的量或生成的角黄素的量也因之增加。
优选地，该酮酶活性的增加至少为野生型酮酶活性的5％，进一步优选为至少20％，进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％，更优选为至少300％，更为优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物以及野生型或参照生物的酮酶活性对植物或微生物材料中酮酶活性的测定，是基于Frazer等(J.Biol.Chem.272(10)6128-6135，1997)的方法。通过使用β-胡萝卜素和角黄素底物，在脂质(大豆卵磷脂)和去污剂(胆酸钠)存在的情况下测定植物或微生物提取物的酮酶活性。酮酶分析的底物/产物比例通过HPLC手段检测。
有多种可以增加酮酶活性的途径，如通过在翻译和蛋白质水平关闭抑制性调节机制，或通过提高编码酮酶核酸相对于野生型的基因表达(例如通过活化剂诱导酮酶基因或通过向生物插入编码酮酶核酸)。
根据本发明，该实施方案中“提高编码酮酶核酸的基因表达”也指对该生物自身的内源酮酶表达的调控。这一点可以通过如修饰酮酶编码基因的启动子DNA序列来实现。这一修饰可以通过DNA序列的缺失或插入来实现，从而改变或优选增加至少一个内源酮酶基因的表达率。
如上所述，可以通过应用外源刺激来改变至少一种内源酮酶的表达。这一点可以通过特定的生理条件(即通过应用外源物质)来实现。
此外，还可以通过使用野生型生物中不具有的或经修饰的调节蛋白质，与酮酶基因的启动子相互作用，以增加至少一个内源酮酶基因的表达。
此类调节物可以是如WO 96/06166所描述的由DNA结合结构域和转录激活结构域所组成的嵌合蛋白质。
在优选实施方案中，通过提高编码酮酶核酸的基因表达，较野生型增加酮酶活性。
在另一优选实施方案中，通过向生物插入编码酮酶核酸来增加编码酮酶核酸的基因表达。
该实施方案中，与野生型相比，本发明的转基因生物中至少还存在一另一个酮酶基因。该实施方案中，本发明的遗传修饰的生物优选具有至少一个编码酮酶的外源(即异源)核酸，或具有至少两个编码酮酶的内源核酸。
根据本发明，在本方法的另一优选实施方案中，使用的起始生物为野生型并不具有酮酶活性的非人生物(如布拉霉、Marigold、万寿菊、香叶万寿菊、小万寿菊、普林万寿菊、Tagetes palmeri及钟形万寿菊)。
在该优选实施方案中，遗传修饰造成了这些生物中的酮酶活性。该优选实施方案中，与未经遗传修饰的野生型相比，本发明的遗传修饰的生物具有酮酶活性，因而优选能够转基因表达酮酶。
在该优选实施方案中，与前述增加编码酮酶核酸的基因表达类似，优选通过向起始生物插入编码酮酶核酸，造成编码酮酶核酸的基因表达。
为此，在两个实施方案中，原则上可以使用各种酮酶基因，即编码酮酶的各种核酸。
本说明书中提到的所有核酸可以为如RNA、DNA或cDNA序列。
对于真核生物来源的含有内含子的基因组酮酶序列，在宿主生物不能或不能通过改造来表达相应酮酶时，优选使用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
可以用于本发明方法中的编码酮酶的核酸及相应酮酶的实例为如以下来源的序列雨生红球藻，特别是雨生红球藻Flotow em.Wille(登陆号X86782；核酸SEQ ID NO3，蛋白质SEQ ID NO4)，雨生红球藻，NIES-144(登陆号D45881；核酸SEQ ID NO35，蛋白质SEQ ID NO36)，橙黄农杆菌(登陆号D58420；核酸SEQ ID NO37，蛋白质SEQ IDNO38)，产碱菌属种(登陆号D58422；核酸SEQ ID NO39，蛋白质SEQ IDNO40)，Paracoccus marcusii(登陆号Y15112；核酸SEQ ID NO41，蛋白质SEQ ID NO42)。
聚球藻属PC6803株(登陆号NP442491；核酸SEQ ID NO43，蛋白质SEQ ID NO44)。
慢生根瘤菌属(登陆号AF218415；核酸SEQ ID NO45，蛋白质SEQ ID NO46)。
念珠藻PCC7120株(登陆号AP003592，BAB74888；核酸SEQ IDNO47，蛋白质SEQ ID NO48)。
雨生红球藻(登陆号AF534876，AAN03484；核酸SEQ ID NO49，蛋白质SEQID NO50)
副球藻菌MBIC1143(登陆号D58420，P54972；核酸SEQ ID NO51，蛋白质SEQ IDNO52)橙黄短波单胞菌(Brevundimonas aurantiaca)(登陆号AY166610，AAN86030；核酸SEQ ID NO53，蛋白质SEQID NO54)泡沫节球藻(Nodularia spumigena)NSOR10(登陆号AY210783，AAO64399；核酸SEQ ID NO55，蛋白质SEQ ID NO56)点形念珠藻(Nostoc punctiforme)ATCC 29133(登陆号NZ_AABC01000195，ZP_00111258；核酸SEQ ID NO57，蛋白质SEQ ID NO58)点形念珠藻(Nostoc punctiforme)ATCC 29133(登陆号NZ_AABC01000196；核酸SEQ ID NO59，蛋白质SEQID NO60)耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)RI(登陆号E75561，AE001872；核酸SEQ ID NO61，蛋白质SEQ IDNO62)，聚球藻属种WH 8102，核酸Acc.No.NZ_AABD01000001，碱基对1,354,725-1,355,528(SEQID NO75)，蛋白质Acc.No.ZP_00115639(SEQ ID NO76)(注释为推定的蛋白质)，或自上述序列衍生的序列，例如通过对如序列SEQ ID NO58或SEQ ID NO57的变异/突变产生序列为SEQ ID NO64或66的酮酶以及相应的编码核酸序列SEQ ID NO63或SEQ ID NO65，通过对如序列SEQ ID NO60或SEQ ID NO59的变异/突变产生序列为SEQ ID NO68或70的酮酶以及相应的编码核酸序列SEQ ID NO67或SEQ ID NO69，或通过对如序列SEQ ID NO76或SEQ ID NO75的变异/突变产生序列为SEQ ID NO72或74的酮酶以及相应的编码核酸序列SEQ ID NO71或SEQ ID NO73。
容易发现可用于本发明方法的其它酮酶和酮酶基因的天然实例，例如通过比较数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性(所述数据库含有前述序列，特别是具有SEQ ID NO4和/或48和/或58和/60的序列)，可以从多种已知基因组序列的生物中发现其它酮酶和酮酶基因。
通过众所周知的杂交技术，从前述核酸序列起始，特别是从多种基因组序列未知生物的SEQ ID NO3和/或47和/或57和/59的序列起始，可以容易地发现其它酮酶和酮酶基因的天然实例。
该杂交可以在温和(低严紧性)或优选在严紧(高严紧性)的条件下进行。
该类杂交条件可以应用于该说明书中的所有核酸，在如Sambrook，J.，Fritsch，E.F，Maniatis，T.，《Molecular Cloning(A Laboratory Manual)》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，9.31-9.57或CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中有所描述。
例如，洗涤步骤的条件可以从低严紧性(在50℃使用2X SSC)和高严紧性(在50℃，优选在65℃使用0.2X SSC)所限定的条件范围中选择(20X SSC0.3M柠檬酸钠，3M氯化钠，pH7.0)。
此外，还可以将洗涤步骤中的温度从温和条件的室温(22℃)升至严紧条件的65℃。
可以同时改变盐浓度和温度两参数，也可以保持其中之一恒定，只改变另一个。在杂交过程中也可以使用变性剂(如甲酰胺或SDS)。若为50％甲酰胺，优选在42℃下进行杂交。
以下给出了一些杂交条件和洗涤步骤的代表性条件
(1)杂交条件，例如(i)65℃、4X SSC，或(ii)45℃、6X SSC，或(iii)68℃、6X SSC、100mg/ml变性鱼精DNA，或(iv)68℃、6X SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性且片段化的鲑精DNA，或(v)42℃、6X SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性且片段化的鲑精DNA、50％甲酰胺，或(vi)42℃、50％甲酰胺、4X SSC，或(vii)42℃、50％(vol/vol)甲酰胺、0.1％牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)、750mM NaCl、75mM柠檬酸钠，或(viii)50℃、2X或4X SSC(温和条件)，或(ix)42℃、30至40％甲酰胺、2X或4X SSC(温和条件)。
(2)在以下条件进行10分钟的洗涤步骤，例如，(i)50℃、0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，或(ii)65℃、0.1X SSC，或(iii)68℃、0.1X SSC、0.5％SDS，或(iv)42℃、0.1X SSC、0.5％SDS、50％甲酰胺，或(v)42℃、0.2X SSC、0.1％SDS，或(vi)65℃、2X SSC(温和条件)。
在本发明方法的一个优选实施方案中，插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO4氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO4序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％，特别优选至少99％，且所述蛋白质具有酮酶的酶促性质。
同时，该酮酶序列可以为天然序列，该序列可以如前述通过与其它生物来源的序列同一性比较获得；或酮酶序列可以是对SEQ ID NO4序列通过合成变异(如氨基酸的替换、插入或缺失)修饰而成的合成序列。
本发明方法的另一个优选实施方案应用编码蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO48氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO48序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％，特别优选至少99％，且所述蛋白质具有酮酶的酶促性质。
同时，该酮酶序列可以为天然序列，该序列可以如前述通过与其它生物来源的序列同一性比较获得；或酮酶序列可以是对SEQ ID NO48序列通过合成变异(如氨基酸的替换、插入或缺失)修饰而成的合成序列。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO58氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO58序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％，特别优选至少99％，且所述蛋白质具有酮酶的酶促性质。
同时，该酮酶序列可以为天然序列，该序列可以如前述通过与其它生物来源的序列同一性比较获得；或酮酶序列可以是对SEQ ID NO58序列通过合成变异(如氨基酸的替换、插入或缺失)修饰而成的合成序列。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO60氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO60序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％，特别优选至少99％，且所述蛋白质具有酮酶的酶促性质。
同时，该酮酶序列可以为天然序列，该序列可以如前述通过与其它生物来源的序列同一性比较获得；或酮酶序列可以是对SEQ ID NO60序列通过合成变异(如氨基酸的替换、插入或缺失)修饰而成的合成序列。
对于本说明书中的所有蛋白质，术语“替换”是指一个或多个氨基酸被一个或多个氨基酸所替换。优选进行“保守性取代”，其中替换的氨基酸与原始氨基酸具有相似的性质，如Glu被Asp、Gln被Asn、Val被Ile、Leu被Ile、Ser被Thr所替换。
“缺失”是指一个氨基酸直接被键所取代。优选的缺失位置为多肽的末端，以及单独蛋白质结构域间的连接处。
“插入”是指将氨基酸插入多肽链中，其中原直接连接被一个或多个氨基酸所取代。
“两种蛋白质间的同一性”是指各蛋白质全长中的氨基酸同一性，尤其是使用Informax(USA)提供的vector NTI 7.1版软件和clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignmentson a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2)151-1)，设定下述参数，通过比较计算出的同一性多重比对参数空位开放罚分(gap opening penalty)10空位扩展罚分(gap extension penalty) 10空位分离罚分范围 8空位分离罚分(gap separation penalty) 关闭校正延迟的同一性％ 40(％identity for alignment delay)残基特异性空位(Residae specific gap) 关闭亲水残基空位(Hydrophilic rdsidae gap)关闭转换权重(transition weighing)0成对比对参数FAST运算法则 使用K-tuple尺寸 1空位罚分 3
窗口尺寸 5最佳对角线数目(Number of best diagonals) 5因此，在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO4或48或58或60具有至少70％同一性的蛋白质，是指其序列与SEQ ID NO4或48或58或60的序列相比较(特别是根据上述程序对数)具有至少70％上述设置参数的同一性。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法，获取合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO3序列的核酸插入植物中。
在另一个特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO48序列的核酸插入植物中。
在另一个特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO58序列的核酸插入植物中。
在另一个特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO60序列的核酸插入植物中。
还可以通过公知的方法，从核苷酸结构单元开始进行化学合成来制备上述所有酮酶基因，例如利用单个重叠互补的双螺旋核酸结构单元的片段缩合来制备。通过如已知的亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley PressNew York，896-897页)可以化学合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填补空位、连接反应和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloningA laboratory manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述。
如上所述，本发明的方法中使用的非人生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性以及修饰的β环化酶活性，该修饰的β环化酶活性源于该β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
根据本发明，该方法的实施方案之一使用的起始生物为作为野生型或起始生物已经具有一定β环化酶活性的非人生物。在该实施方案中，遗传修饰引入了高于野生型或起始生物的β环化酶活性。该增加的β环化酶活性源于该β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
β环化酶活性是指β环化酶的酶活性。
β环化酶是指一种蛋白质，其具有将末端的番茄红素线性残基转化为β-芷香酮环的酶活性。
具体而言，β环化酶指具有将γ-胡萝卜素转化成β-胡萝卜素的酶活性的蛋白质。
因此，β环化酶活性是指在一定时间内由β环化酶蛋白质转化的γ-胡萝卜素的量，或生成的β-胡萝卜素的量。
当β环化酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由β环化酶蛋白质转化的番茄红素或γ-胡萝卜素的量或由番茄红素生成的γ-胡萝卜素的量或由γ-胡萝卜素生成的β-胡萝卜素的量也因之增加。
优选增加的β环化酶活性至少为野生型β环化酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的β环化酶活性根据Fraser和Sandmann的方法(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)在体外测定β环化酶活性。将作为缓冲液的磷酸钾(pH 7.6)、作为底物的番茄红素、及红辣椒(paprika)基质蛋白质、NADP+、NADPH和ATP加入特定量的生物提取物中。
特别优选在Bouvier、d′Harlingue和Camara(Molecular Analysis ofcarotenoid cyclase inhibition；Arch.Biochem.Biophys.346(1)(1997)53-64)的下述条件测定β环化酶活性在250μl的体积中进行体外测定。反应物含有50mM磷酸钾(pH 7.6)、不同量的生物提取物、20nM番茄红素、250μg红辣椒有色体基质蛋白质、0.2mM NADP+、0.2mM NADPH和1mM ATP。将NADP/NADPH和ATP溶解于含有1mg Tween 80的10ml乙醇后加入孵育介质。30℃下反应60分钟后，加入氯仿/甲醇(2∶1)终止反应。反应产物经氯仿抽提后通过HPLC分析。
Fraser和Sandmann描述了另一种使用放射性底物的测定(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)。
可以通过多种途径增加β环化酶的活性，如通过关闭在表达及蛋白质水平的抑制性调节机制或增加编码β环化酶的核酸相对于野生型的基因表达，所述β环化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列、或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
同样，有多种途径可以相对于野生型增加编码β环化酶核酸的基因表达，例如通过活化剂诱导β环化酶基因，或向生物插入一个或多个β环化酶基因拷贝，即向生物插入至少一个编码β环化酶的核酸，所述β环化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
根据本发明，增加编码β环化酶核酸的基因表达也指对该生物自身的内源β环化酶表达的调控，所述β环化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
可以通过如修饰β环化酶编码基因的启动子DNA序列来实现这一调控。所述修饰可以通过如DNA序列的缺失或插入来完成，从而提高基因的表达率。
如上所述，可以通过应用外源刺激来改变内源β环化酶的表达。这一点可以通过特定的生理条件(即通过应用外源物质)来实现。
此外，还可以通过使用未转化生物中不具有的调节蛋白质，与该基因的启动子相互作用，以修饰或增加内源β环化酶基因的表达。
此类调节物可以是如WO 96/06166所描述的由DNA结合结构域和转录激活结构域所组成的嵌合蛋白质。
在优选实施方案中，通过向生物插入至少一个编码β环化酶的核酸来增加编码β环化酶核酸的基因表达，所述β环化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
该实施方案中，与野生型相比，本发明的转基因生物中至少还存在另一个β环化酶基因。该实施方案中，本发明的遗传修饰的生物优选具有至少一个编码β环化酶的外源(即异源)核酸，或具有至少两个编码β环化酶的内源核酸。
在本发明方法的另一优选实施方案中，使用的起始生物为野生型并不具有β环化酶活性的非人生物。在该次优选的实施方案中，遗传修饰造成了生物中的β环化酶活性。该实施方案中，与未遗传修饰的野生型相比，本发明的遗传修饰的生物具有β环化酶活性，因而优选能够转基因表达β环化酶。
在该优选实施方案中，与前述增加编码β环化酶核酸的基因表达类似，优选通过向起始生物插入编码β环化酶的核酸造成编码β环化酶核酸的基因表达。
为此，在两个实施方案中，原则上可以使用各种β环化酶基因，即编码β环化酶的各种核酸，所述β环化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列，或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
对于真核生物来源的含有内含子的基因组β环化酶序列，在宿主生物不能或不能通过改造来表达相应β环化酶时，优选使用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
特别优选的β环化酶为番茄来源的色素细胞特异性β环化酶(AAG21133)(核酸SEQ ID NO1；蛋白质SEQ ID NO2)。
根据本发明，可以使用的β环化酶基因是编码如下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者与SEQ ID NO2序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有β环化酶的酶促性质。
容易发现可用于本发明方法的β环化酶和β环化酶基因的其他实例，例如如上所述比较数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列与SEQ ID NO2的同一性，可以从多种已知基因组序列的生物中发现其它β环化酶和β环化酶基因。
利用杂交和PCR技术，从多种基因组序列未知生物的SEQ ID NO1序列起始，通过已知的方法可以容易地发现其它β环化酶和β环化酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加β环化酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有SEQ ID NO2序列的β环化酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法，获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子，是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO1序列的核酸插入生物中。
还可以通过公知的方法，从核苷酸结构单元开始进行化学合成来制备上述所有β环化酶基因，例如利用单个重叠互补的双螺旋核酸结构单元的片段缩合来制备。通过如已知的亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897页)可以化学合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填补空位、连接反应和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloningA laboratory manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述。
在优选实施方案中培养非人生物，所述生物与其野生型相比，除了具有修饰的酮酶活性和修饰的β环化酶活性，还具有改良的羟化酶活性。
“与野生型相比改良的羟化酶活性”，在起始生物或野生型不具羟化酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比造成的羟化酶活性”。
“与野生型相比改良的羟化酶活性”，在起始生物或野生型具有羟化酶活性的情况下，应优选理解为“与野生型相比增加的羟化酶活性”。
因此，在优选实施方案中培养非人生物，所述生物与其野生型相比，除了具有修饰的酮酶活性和修饰的β环化酶活性，还具有造成的或增加的羟化酶活性。
羟化酶活性是指羟化酶的酶活性。
羟化酶是指一种蛋白质，其具有在任选取代的类胡萝卜素β-芷香酮环上引入羟基的酶活性。
具体而言，羟化酶指具有将β-胡萝卜素转化成玉米黄质或将角黄素转化成虾青素的酶活性的蛋白质。
据此，羟化酶活性是指在一定时间内由羟化酶蛋白质转化的β-胡萝卜素或角黄素的量，或生成的玉米黄质或虾青素的量。
当羟化酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质羟化酶转化的β-胡萝卜素或角黄素的量或生成的玉米黄质或虾青素的量也因之增加。
优选地，该羟化酶活性的增加至少为野生型羟化酶活性的5％，进一步优选为至少20％，进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％，更优选为至少300％，甚至更优选至少为500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物以及野生型或参照生物的羟化酶活性根据Bouvier等的方法(Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)在体外测定羟化酶活性。将铁氧化还原蛋白、铁氧化还原蛋白-NADP氧化还原酶、过氧化氢酶、NADPH和β-胡萝卜素及单-和双半乳糖苷甘油加入特定量的生物提取物中。
特别优选在Bouvier、Keller、d′Harlingue和Camara(Xanthophyllbiosynthesismolecular and functional characterization of carotenoidhydroxylases from pepper fruits(Capsicum annuum L.)；Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)的下述条件测定羟化酶活性在0.250ml的体积中进行体外测定。反应物含有50mM磷酸钾(pH7.6)、0.025mg菠菜铁氧化还原蛋白、0.5单位铁氧化还原蛋白-NADP+氧化还原酶、0.25mM NADPH、0.010mg β-胡萝卜素(在0.1mg Tween 80中乳化)、0.05mM的单/双半乳糖苷甘油混合物(1∶1)、1单位过氧化氢酶、0.2mg胎牛血清白蛋白和不同体积的生物提取物。将反应混合物在30℃孵育2小时。反应产物经有机溶剂(如丙酮或氯仿/甲醇(2∶1))抽提后通过HPLC测定。
可以通过多种途径实现羟化酶活性的增加或造成，如通过关闭在表达及蛋白质水平的抑制性调节机制或相对于野生型增加或造成羟化酶编码核酸的基因表达。
同样，有多种途径可以实现羟化酶编码核酸的基因表达相对于野生型的增加或造成，例如通过活化剂诱导羟化酶基因，或向生物插入一个或多个羟化酶基因拷贝，即向生物插入至少一个编码羟化酶的核酸。
根据本发明，增加羟化酶编码核酸的基因表达也指对该生物自身的内源羟化酶表达的调控。
可以通过如修饰羟化酶编码基因的启动子DNA序列来实现这一调控。所述修饰可以通过如DNA序列的缺失或插入来完成，从而提高基因的表达率。
如上所述，可以通过应用外源刺激来改变内源β环化酶的表达。这一点可以通过特定的生理条件(即通过应用外源物质)来实现。
此外，还可以通过使用未转化生物中不具有的调节蛋白质，与该基因的启动子相互作用，以造成或增加内源羟化酶基因的表达。
此类调节物可以是如WO 96/06166所描述的由一个DNA结合结构域和一个转录激活结构域所组成的嵌合蛋白质。
在优选的实施方案中，通过向生物插入至少一个羟化酶编码核酸来增加或造成羟化酶编码核酸的基因表达。
为此，原则上可以使用各种羟化酶基因，即编码羟化酶的各种核酸。
对于真核生物来源的含有内含子的基因组羟化酶序列，在宿主生物不能或不能通过改造来表达相应羟化酶时，优选使用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
羟化酶基因的实例如雨生红球藻来源的羟化酶编码核酸(登陆号AX038729，WO 0061764)；(核酸SEQ ID NO77，蛋白质SEQ ID NO78)。
以及以下登陆号的羟化酶|emb|CAB55626.1、CAA70427.1、CAA70888.1、CAB55625.1、AF499108_1、AF315289_1、AF296158_1、AAC49443.1、NP_94300.1、NP_200070.1、AAG10430.1、CAC06712.1、AAM88619.1、CAC95130.1、AAL80006.1、AF162276_1、AAO53295.1、AAN85601.1、CRTZ_ERWHE、CRTZ_PANAN、BAB79605.1、CRTZ_ALCSP、CRTZ_AGRAU、CAB56060.1、ZP_00094836.1、AAC44852.1、BAC77670.1、NP_745389.1、NP_344225.1、NP_849490.1、ZP_00087019.1、NP_503072.1、NP_852012.1、NP_115929.1、ZP_00013255.1。
此外，特别优选的羟化酶为番茄来源的羟化酶(登陆Y14810)(核酸SEQ ID NO5；蛋白质SEQ ID NO6)。
该优选实施方案中，与野生型相比，本发明的优选转基因生物中至少还存在另一个羟化酶基因。
该优选实施方案中，遗传修饰的生物具有如至少一个编码羟化酶的外源(即异源)核酸，或具有至少两个编码羟化酶的内源核酸。
优选地，上述优选实施方案中可以使用的羟化酶基因是编码如下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO6氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者与SEQ ID NO6序列在氨基酸水平上的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有羟化酶的酶促性质。
容易发现羟化酶和羟化酶基因的其他实例，例如如上所述比较数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列与SEQ ID NO6的同一性，可以从多种已知基因组序列的生物中发现其它羟化酶和羟化酶基因。
利用杂交和PCR技术，从多种基因组序列未知生物的SEQ ID NO5序列起始，通过已知的方法可以容易地发现其它羟化酶和羟化化酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加羟化酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO6的羟化酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法，获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO5序列的核酸插入生物中。
还可以通过公知的方法，从核苷酸结构单元开始进行化学合成来制备上述所有羟化酶基因，例如利用单个重叠互补的双螺旋核酸结构单元的片段缩合来制备。通过如已知的亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley PressNew York，896-897页)可以化学合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填补空位、连接反应和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloningA laboratory manual)》，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述。
特别优选地，本发明的方法使用起始生物时具有β环化酶活性而无酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性有所增加，且具有造成的酮酶活性，其中β环化酶活性增加是由于β环化酶所致，该β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时缺乏β环化酶活性及酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物具有造成的β环化酶活性及酮酶活性，其中β环化酶活性的造成是由于β环化酶所致，该β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时具有β环化酶活性及酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性及酮酶活性均有所增加，其中β环化酶活性的增加是由于β环化酶所致，所述β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时具有β环化酶活性但不具有酮酶活性及羟化酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性有所增加，具有造成的酮酶活性及羟化酶活性，其中β环化酶活性的增加是由于β环化酶所致，所述β环化酶含有SEQ IDNO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时具有β环化酶及羟化酶活性但不具有酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性及羟化酶活性有所增加，具有造成酮酶活性。其中β环化酶活性的增加是由于β环化酶所致，所述β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时缺乏β环化酶活性、羟化酶活性及酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物具有造成的β环化酶活性、羟化酶活性及酮酶活性。其中β环化酶活性的造成是由于β环化酶所致，所述β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
特别优选地，本发明的方法还使用起始生物时具有β环化酶活性、羟化酶活性及酮酶活性的遗传修饰的非人生物，与野生型相比，遗传修饰的生物的β环化酶活性、羟化酶活性及酮酶活性均有所增加。其中β环化酶活性的增加是由于β环化酶所致所述β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
在另一个优选实施方案中，培养遗传修饰的非人生物，所述生物与野生型相比还具有至少一种选自以下的活性增加HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性以及MinD活性。
HMG-CoA还原酶活性是指HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)的酶活性。
HMG-CoA还原酶是指一种蛋白质，其具有可将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羟戊酸的酶活性。
据此，HMG-CoA还原酶活性是指一定时间内由HMG-CoA还原酶蛋白质反应的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的量或生成的甲羟戊酸的量。
当HMG-CoA还原酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质HMG-CoA还原酶转化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的量或生成的甲羟戊酸的量也因之增加。
优选增加的HMG-CoA还原酶活性至少为野生型HMG-CoA还原酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的HMG-CoA还原酶活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
根据已发表的描述(如Schaller，Grausem，Benveniste，Chye，Tan，Song和Chua，Plant Physiol.109(1995)，761-770；Chappell，Wolf，Proulx，Cuellar和Saunders，Plant Physiol.109(1995)1337-1343)，能够测定HMG-CoA还原酶活性。可以在冷缓冲液(100mM磷酸钾(pH 7.0)、4mMMgCl2、5mM DTT)中对生物组织进行匀浆和抽提。将匀浆液在4℃、10 000g离心15分钟。随后将上清液以100 000g离心45-60分钟。测定上清液和微粒体级分的沉淀(重悬于100mM磷酸钾(pH 7.0)和50mMDTT之后)中HMG-CoA还原酶活性。将溶液和悬浮液(悬浮液中蛋白质含量相当于约1-10μg)的等分试样于30℃在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0，含3mM NADPH和20μM(14C)HMG-CoA(58μCi/μM)，理想体积为26μl)中孵育15-60分钟。加入5μl甲羟戊酸内酯(1mg/ml)和6NHCl终止反应。随后将混合物在室温下孵育15分钟。加入125μl饱和磷酸钾溶液(pH 6.0)及300μl乙酸乙酯，以定量反应中形成的(14C)甲羟戊酸。将混合物充分混合并离心。通过闪烁测量测定放射性。
(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶(也称作lytB或IspH)活性，是指(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的酶活性。
(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶是指一种蛋白质，其具有可将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯转化为异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的酶活性。
据此，(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯活性是指一定时间内由(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶蛋白质反应的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯的量或生成的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基二磷酸酯的量。
当(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶转化的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯的量或生成的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基二磷酸酯的量也因之增加。
优选增加的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性至少为野生型(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
通过免疫检测方法可以测定(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的活性。Rohdich及其同事(Rohdich，Hecht，G_rtner，Adam，Krieger，Amslinger，Arigoni，Bacher和EisenreichStudies on the nonmevalonateterpene biosynthetic pathwaymetabolic role of IspH(LytB)protein，Natl.Acad.Natl.Sci.USA 99(2002)，1158-1163)已经描述了特异性抗体的制备。关于催化活性的测定，Altincicek及其同事(Altincicek，Duin，Reichenberg，Hedderich，Kollas，Hintz，Wagne，Wiesner，Beck和JomaaLytB proteincatalyzes the terminal step of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphatepathway of isoprenoid biosynthesis；FEBS Letters 532(2002)437-440)描述了一种监测(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原为异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的体外系统。
1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性是指1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的酶活性。
1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶是指一种蛋白质，其具有将羟乙基ThPP和3-磷酸甘油醛转化为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的酶活性。
据此，1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性是指在一定时间内由1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶蛋白质转化的羟乙基ThPP和/或3-磷酸甘油醛的量或形成的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量。
当1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶转化的羟乙基ThPP和/或3-磷酸甘油醛的量，或形成的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量也因之增加。
优选增加的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性至少为野生型1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性
在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
用于测定D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶活性(DXS)的反应混合物(50-200μl)中含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)、3mM MgCl2、3mM MnCl2、3mM ATP、1mM硫胺素二磷酸酯、0.1％Tween-60、1mM氟化钾、30μM(2-14C)丙酮酸(0.5μCi)、0.6mM DL-3-磷酸甘油醛。37℃下将生物提取物在反应溶液中孵育1-2小时。随后加热至80℃持续3分钟以终止反应。在13 000转/分钟下离心5分钟后，蒸发上清液，将残留物重悬于50μl甲醇，铺于TLC板进行薄层层析(硅胶60，Merck，Darmstadt)，并在正丙醇/乙酸乙酯/水(6∶1∶3；v/v/v)中进行分离。在此过程中，放射性标记的D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸(或D-1-脱氧木酮糖)与(2-14C)-丙酮酸得以分离。利用闪烁计数器进行定量。该法描述于Harker和Bramley(FEBS Letters 448(1999)115-119)。另外，测定DXS合酶活性的荧光测定法已由Querol及其同事描述(Analytical Biochemistry 296(2001)101-105)。
1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶(也称为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)活性是指1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的酶活性。
1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶是指一种蛋白质，其具有将1-脱氧-D-木糖-5-磷酸转化为2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸的酶活性。
据此，1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性是指在一定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶转化的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量，或形成的2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸的量。
当1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶转化的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量或形成的2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸的量也因之增加。
优选增加的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性至少为野生型1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
在下述缓冲液中测定D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)的活性，所述缓冲液含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM MnCl2、0.3mMNADPH和0.3mM 1-脱氧-D-木酮糖-4-磷酸，其中1-脱氧-D-木酮糖-4-磷酸能够经酶合成(如Kuzuyama，Takahashi，Watanabe和SetoTetrahedonletters 39(1998)4509-4512)。加入生物提取物开始反应。反应体积一般可为0.2至0.5ml；37℃孵育30-60分钟。此间，用分光光度计在340nm处监控NADPH的氧化。
异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性是指异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的酶活性。
异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶是指一种蛋白质，其具有将异戊烯基二磷酸酯转化为二甲基烯丙基磷酸酯的酶活性。
据此，异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性是指在一定时间内由异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶转化的异戊烯基二磷酸酯的量或形成的二甲基烯丙基磷酸酯的量。
当异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶转化的异戊烯基二磷酸酯的量或形成的二甲基烯丙基磷酸酯的量也因之增加。
优选增加的异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性至少为野生型异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
根据Fraser及其同事公开的方法(Fraser，R_mer，Shipton，Mills，Kiano，Misawa，Drake，Schuch和BramleyEvaluation of transgenictomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specificmanner；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)，1092-1097，基于Fraser，Pinto，Holloway和Bramley，Plant Journal 24(2000)，551-558)，可以测定异戊烯基二磷酸酯异构酶(IPP异构酶)的活性。为进行酶测定，在含有1mM DTT、4mM MgCl2、6mM MnCl2、3mM ATP、0.1％Tween-60、1mM氟化钾的0.4M Tris-HCl(pH 8.0)中(体积为大约150-500μl)，以0.5μCi(1-14C)IPP(异戊烯基焦磷酸酯)(56mCi/mmol，Amersham plc)为底物进行孵育。将提取物与缓冲液混合(例如以1∶1的比例)并在28℃孵育至少5小时。随后加入约200μl甲醇，并通过加入浓盐酸(终浓度为25％)在37℃进行约1小时酸水解。然后使用石油醚(与10％二乙醚混合)进行两次抽提(每次500μl)。利用闪烁计数器测定上层等分试样中的放射性。通过5分钟的短期孵育能够测定特异酶活性，因为短的反应时间抑制反应副产物生成(见Lützow和BeyerThe isopentenyl phosphate Δ-isomeraseand its relation to the phytoene synthase complex in daffodil chromoplasts；Biochim.Biophys.Acta 959(1988)，118-126)。
牻牛儿基二磷酸酯合酶活性是指牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶活性。
牻牛儿基二磷酸酯合酶是指一种蛋白质，其具有将异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基磷酸酯转化为牻牛儿基二磷酸酯的酶活性。
据此，牻牛儿基二磷酸酯合酶活性是指在一定时间内由牻牛儿基二磷酸酯合酶蛋白质转化的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基磷酸酯的量或形成的牻牛儿基二磷酸酯的量。
当牻牛儿基二磷酸酯合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质牻牛儿基二磷酸酯合酶转化的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基二磷酸酯的量也因之增加。
优选增加的牻牛儿基二磷酸酯合酶活性至少为野生型牻牛儿基二磷酸酯合酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物以及野生型或参照生物的牻牛儿基二磷酸酯合酶的活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
向50mM Tris-HCl(pH 7.6)、10mM MgCl2、5mM MnCl2、2mMDTT、1mMATP、0.2％Tween-20、5μM(14C)IPP和50μM DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸酯)中加入生物提取物，能够测定牻牛儿基二磷酸酯合酶(GPP合酶)的活性(根据Bouvier，Suire，d’Harlingue，Backhaus和CamaraMolecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentationof monoterpene synthesis in plant cells，Plant Journal 24(2000)241-252)。在如37℃下孵育2小时后，将反应产物去磷酸化(根据Koyama、Fuji和OguraEnzymatic hydrolysis of polyprenyl pyrophosphates，MethodsEnzymol.110(1985)，153-155)，利用薄层层析法和放射性掺入测定法进行分析(Dogbo，Bardat，Quennemet和CamaraMetabolism of plastidterpenoidsIn vitro inhibition of phytoene synthesis by phenethylpyrophosphate derivates，FEBS Letters 219(1987)211-215)。
法呢基二磷酸酯合酶活性是指法呢基二磷酸酯合酶的酶活性。
法呢基二磷酸酯合酶是指一种蛋白质，其具有依次将2分子异戊烯基二磷酸酯与二甲基烯丙基二磷酸酯反应，所生成的牻牛儿基二磷酸酯再转化为法呢基二磷酸酯的酶活性。
据此，法呢基二磷酸酯合酶活性是指在一定时间内由蛋白质法呢基二磷酸酯合酶转化的二甲基烯丙基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的法呢基二磷酸酯的量。
当法呢基二磷酸酯合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质法呢基二磷酸酯合酶转化的二甲基烯丙基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的法呢基二磷酸酯的量也因之增加。
优选增加的法呢基二磷酸酯合酶活性至少为野生型法呢基二磷酸酯合酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的法呢基二磷酸酯合酶的活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
根据Joly和Edwards的方法能够测定法尼基焦磷酸酯合酶(FPP合酶)的活性(Journal of Biological Chemistry 268(1993)，26983-26989)。即，在含有10mM HEPES(pH 7.2)、1mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、20μM牻牛儿基焦磷酸酯和40μM(1-14C)异戊烯基焦磷酸酯(4Ci/mmol)的缓冲液中测定酶活性。将反应混合物在37℃孵育；加入2.5N HCl(在含有19μg/ml法呢醇的70％乙醇中)终止反应。随后通过酸水解在37℃水解反应产物30分钟。加入10％NaOH中和混合物，并通过与己烷振荡进行抽提。利用闪烁计数器测量己烷相的等分试样以确定掺入的放射性。
或者，将生物提取物与放射性标记的IPP孵育之后，在苯/甲醇(9∶1)中通过薄层层析(Silica-Gel SE60，Merck)分离反应产物。洗脱放射性标记的产物并测定其放射活性(根据Gaffe，Bru，Causse，Vidal，Stamitti-Bert，Carde和GallusciLEFPS1，a tomato farnesyl pyrophosphate gene highlyexpressed during early fruit development；Plant Physiology 123(2000)1351-1362)。
牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性是指牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶活性。
牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶是指一种蛋白质，其具有将法呢基二磷酸酯和异戊烯基二磷酸酯转化为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的酶活性。
据此，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性是指在一定时间内由蛋白质牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶转化的法呢基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量。
当牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶转化的法呢基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量也因之增加。
优选增加的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性至少为野生型活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
可以根据Dogbo和Camara所述的方法测定牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯合酶(GGPP合酶)的活性(Biochim.Biophys.Acta 920(1987)，140-148Purification of isopentenyl pyrophosphate isomerase and geranylgeranylpyrophosphate synthase from Capsicum chromoplasts by affinitychromatography)。为此，将总体积约为200μl的生物提取物加入缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.6)、2mM MgCl2、1mM MnCl2、2mM二硫苏糖醇、(1-14C)IPP(0.1μCi、10μM)、15μM DMAPP、GPP或FPP)中。在30℃孵育1-2小时(或更长)。加入0.5ml乙醇和0.1ml 6N HCl终止反应。37℃孵育10分钟之后，用6N NaOH中和反应混合物，与1ml水混合并用4ml乙醚振荡进行抽提。利用闪烁计数测定乙醚相等分试样(如0.2ml)中的放射活性。或者在酸水解之后，可通过在乙醚中振荡抽提放射性标记的异戊二烯醇，并利用HPLC(25cm Spherisorb ODS-1柱，5μm；用甲醇/水(90∶10；v/v)以1ml/分钟的流速洗脱)分离，并通过放射活性监测进行定量(Wiedemann，Misawa和SandmannPurification and enzymaticcharacterization of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase fromErwinia uredovora after expression in Escherichia coli；ArchivesBiochemistry and Biophysics 306(1993)，152-157)。
八氢番茄红素合酶活性是指八氢番茄红素合酶的酶活性。
具体而言，八氢番茄红素合酶是指一种具有将牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯转化为八氢番茄红素的酶活性的蛋白质。
据此，八氢番茄红素合酶活性是指在一定时间内由蛋白质八氢番茄红素合酶转化的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量，或形成的八氢番茄红素的量。
当八氢番茄红素合酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质八氢番茄红素合酶转化的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量，或形成的八氢番茄红素的量也因之增加。
优选增加的八氢番茄红素合酶活性至少为野生型八氢番茄红素合酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的八氢番茄红素合酶的活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7-4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
根据Fraser及其同事所发表的方法能够测定八氢番茄红素合酶(PSY)活性(Fraser，Romer，Shipton，Mills，Kiano，Misawa，Drake，Schuch和BramleyEvaluation of transgenic tomato plants expressing an additionalphytoene synthase in a fruit-specific manner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)，1092-1097，基于Fraser，Pinto，Holloway和Bramley，Plant Journal24(2000)551-558)。为测定酶，在含有1mM DTT、4mM MgCl2、6mMMnCl2、3mM ATP、0.1％Tween-60、1mM氟化钾的0.4M Tris-HCl(pH 8.0)中，以(3H)牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯(15mCi/mM，AmericanRadiolabeled Chemicals，St.Louis)为底物进行孵育。将生物提取物与缓冲液混合，例如将295μl缓冲液与提取物混合使总体积为500μl。该混合物在28℃孵育至少5小时。随后用氯仿两次(每次500μl)振荡抽提八氢番茄红素。通过薄层层析法，在甲醇/水(95∶5；v/v)的二氧化硅板上分离反应中形成的放射性标记的八氢番茄红素。富碘环境下(通过加热几块碘晶体)可以在二氧化硅板上鉴定八氢番茄红素。以八氢番茄红素标准品作为参照。通过闪烁计数器测定法检测放射性标记产物的量。或者，也可以利用装有放射性探测器的HPLC定量八氢番茄红素(Fraser、Albrecht和SandmannDevelopment of high performance liquid chromatographic systems for theseparation of radiolabeled carotenes and precursors formed in specificenzymatic reactions；J.Chromatogr.645(1993)265-272)。
八氢番茄红素去饱和酶活性是指八氢番茄红素去饱和酶的酶活性。
八氢番茄红素去饱和酶是指一种蛋白质，其具有将八氢番茄红素转化为六氢番茄红素和/或将六氢番茄红素转化为ζ-胡萝卜素(zeta-胡萝卜素)的酶活性。
据此，八氢番茄红素去饱和酶活性是指在一定时间内由蛋白质八氢番茄红素去饱和酶转化的八氢番茄红素或六氢番茄红素的量，或形成的六氢番茄红素或ζ-胡萝卜素的量。
当八氢番茄红素去饱和酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质八氢番茄红素去饱和酶转化的八氢番茄红素或六氢番茄红素的量，或形成的六氢番茄红素或ζ-胡萝卜素的量也因之增加。
优选增加的八氢番茄红素去饱和酶活性至少为野生型八氢番茄红素去饱和酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的八氢番茄红素去饱和酶活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
将放射性标记的(14C)-八氢番茄红素插入不饱和胡萝卜素中能够测定八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的活性(根据R_mer，Fraser，Kiano，Shipton，Misawa，Schuch和Bramley Elevation of the provitamin A content oftransgenic tomato plants；Nature Biotechnology 18(2000)666-669)。可如Fraser所述合成放射性标记的八氢番茄红素(Fraser，De la Rivas，Mackenzie，BramleyPhycomyces blakesleanus CarB mutantstheir use inassays of phytoene desaturase；Phytochemistry 30(1991)，3971-3976)。可在含有10mM MgCl2和1mM二硫苏糖醇的100mM MES缓冲液(pH 6.0)(总体积为1ml)中孵育靶组织的质体膜。加入溶于丙酮中的(14C)八氢番茄红素(每例中每次孵育约100000裂变/分钟)，其中丙酮浓度不超过5％(v/v)。将混合物在28℃下暗处振荡孵育约6-7小时。随后，用约5ml石油醚(与10％乙醚混合)抽提色素三次并通过HPLC法分离并定量。
或者，可根据Fraser等(Fraser，Misawa，Linden，Yamano，Kobayashi和SandmannExpression in Escherichia coli，purification，and reactivationof the recombinant Erwinia uredovora phytoene desaturase，Journal ofBiological Chemistry 267(1992)，19891-19895)的方法，测定八氢番茄红素去饱和酶的活性。
ζ-胡萝卜素去饱和酶活性是指ζ-胡萝卜素去饱和酶的酶活性。
ζ-胡萝卜素去饱和酶是指一种蛋白质，其具有将ζ-胡萝卜素转化为四氢番茄红素和/或将四氢番茄红素转化为番茄红素的酶活性。
据此，ζ-胡萝卜素去饱和酶活性是指在一定时间内由蛋白质ζ-胡萝卜素去饱和酶转化的ζ-胡萝卜素或四氢番茄红素的量或形成的四氢番茄红素或番茄红素的量。
当ζ-胡萝卜素去饱和酶活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由蛋白质ζ-胡萝卜素去饱和酶转化的ζ-胡萝卜素或四氢番茄红素的量，或形成的四氢番茄红素或番茄红素的量也因之增加。
优选增加的ζ-胡萝卜素去饱和酶活性至少为野生型ζ-胡萝卜素去饱和酶活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
优选在以下条件下测定本发明中经过遗传修饰的生物，以及野生型或参照生物的ζ-胡萝卜素去饱和酶活性在研钵中加入液氮，通过强烈研磨匀浆冷冻生物材料，并用比率从1∶1至1∶20的提取缓冲液进行抽提。具体的比率取决于可获得的生物材料中的酶活性，以便能在线性测量的范围内进行酶活性的测定和量化。通常提取缓冲液中含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mMε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。加入2mM DTT和0.5mM PMSF后立即进行提取。
可在0.2M磷酸钾(pH 7.8，缓冲液体积大约1ml)中进行测定ζ-胡萝卜素去饱和酶(ZDS去饱和酶)的分析。其分析方法已由Breitenbach及其同事发表(Breitenbach，Kuntz，Takaichi和SandmannCatalytic propertiesof an expressed and purified higher plant type ζ-carotene desaturase fromCapsicum annuum；European Journal of Biochemistry.265(1)376-383，1999)。每种分析混合物含有3mg悬浮于0.4M磷酸钾缓冲液(pH 7.8)中的磷脂酰胆碱、5μgζ-胡萝卜素或四氢番茄红素、0.02％丁基羟基甲苯、10μl癸基质体醌(1mM甲醇贮存液)及生物提取物。生物提取物的体积需根据存在的ZDS去饱和酶活性进行调节，以便能在线性测量范围内进行定量。孵育一般在暗处、约28℃下，剧烈振荡(200转/分钟)进行约17小时。加入4ml丙酮在50℃时振荡10分钟抽提类胡萝卜素。将类胡萝卜素从该混合物转移至石油醚相(含有10％乙醚)。在氮气中蒸发乙醚/石油醚相，将类胡萝卜素重新溶为20μl并通过HPLC法进行分离和定量。
crtISO活性是指crtISO蛋白的酶活性。
crtISO蛋白是指一种蛋白质，其具有将7，9，7’，9’-四顺式番茄红素转化为全反式番茄红素的酶活性。
据此，crtISO活性是指在一定时间内由蛋白质crtISO转化的7，9，7’，9’-四顺式番茄红素的量或形成的全反式番茄红素的量。
当crtISO活性相对于野生型增加时，与野生型相比，在一定时间内由crtISO蛋白转化的7，9，7’，9’-四顺式番茄红素的量或形成的全反式番茄红素的量也因之增加。
优选增加的crtISO活性至少为野生型crtISO活性的5％，进一步优选为至少20％、进一步优选为至少50％、进一步优选为至少100％、更优选为至少300％、甚至更优选为至少500％，特别是至少600％。
FtsZ活性是指FtsZ蛋白的生理学活性。
FtsZ蛋白是指一种蛋白质，其具有促进细胞分裂和质体分裂的活性，且与微管蛋白质同源。
MinD活性是指MinD蛋白的生理学活性。
MinD蛋白是指一种在细胞分裂中具有多功能作用的蛋白质。它是一种膜相关ATP酶并且在细胞内可表现为从一极到另一极的振动运动。
另外，非甲羟戊酸途径的酶活性的增加能够导致目的酮类胡萝卜素终产物的进一步增加。其实例包括，4-二磷酸胞苷(diphosphocytidyl)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶和2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸酯合酶。通过修饰相应基因的基因表达，可以提高所述酶的活性。以标准方式通过抗体和相应印迹技术能够检测相应蛋白质的浓度改变。
可以通过多种途径，增加HMG-CoA还原酶活性和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶活性和/或法呢基二磷酸酯合酶活性和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性和/或八氢番茄红素合酶活性和/或八氢番茄红素去饱和酶活性和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶活性和/或crtISO活性和/或FtsZ活性和/或MinD活性，例如通过在表达和蛋白质水平关闭抑制性调节机制，或通过提高编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或编码crtISO蛋白的核酸和/或编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸相对于野生型的基因表达。
也可通过多种途径提高编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或编码crtISO蛋白的核酸和/或编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸相对于野生型的基因表达，例如通过活化剂诱导HMG-CoA还原酶基因和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或八氢番茄红素合酶基因和/或八氢番茄红素去饱和酶基因和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因和/或crtISO基因和/或Fts基因和/或MinD基因，或者通过插入一个或多个拷贝的HMG-CoA还原酶基因和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或八氢番茄红素合酶基因和/或八氢番茄红素去饱和酶基因和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因和/或crtISO基因和/或Fts基因和/或MinD基因，即向植物中插入至少一个编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或至少一个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或至少一个编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码crtISO蛋白的核酸和/或至少一个编码FtsZ蛋白的核酸和/或至少一个编码MinD蛋白的核酸。
根据本发明，编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或编码crtISO蛋白的核酸和/或编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸的基因表达的增加，也指对该生物自身的内源HMG-CoA还原酶和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶和/或法呢基二磷酸酯合酶和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和/或八氢番茄红素合酶和/或八氢番茄红素去饱和酶和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶和/或crtISO蛋白和/或FtsZ蛋白和/或MinD蛋白表达的调控。
这一点可以通过如修饰相应启动子DNA序列来实现。这一修饰可以通过DNA序列的缺失或插入来实现，从而增加该基因的表达率。
在优选实施方案中，编码HMG-CoA还原酶核酸的基因表达的增加和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶核酸的基因表达的增加和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶核酸的基因表达的增加和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶核酸的基因表达的增加和/或编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶核酸的基因表达的增加和/或编码牻牛儿基二磷酸酯合酶核酸的基因表达的增加和/或编码法呢基二磷酸酯合酶核酸的基因表达的增加和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶核酸的基因表达的增加和/或编码八氢番茄红素合酶核酸的基因表达的增加和/或编码八氢番茄红素去饱和酶核酸的基因表达的增加和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶核酸的基因表达的增加和/或编码crtISO蛋白核酸的基因表达的增加和/或编码FtsZ蛋白核酸的基因表达的增加和/或编码MinD蛋白核酸的基因表达的增加是通过向植物中插入至少一个编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或至少一个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或至少一个编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码crtISO蛋白的核酸和/或至少一个编码FtsZ蛋白的核酸和/或至少一个编码MinD蛋白的核酸而实现。
为此，原则上可以使用任何HMG-CoA还原酶基因或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因或牻牛儿基二磷酸酯合酶基因或法呢基二磷酸酯合酶基因或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因或八氢番茄红素合酶基因或八氢番茄红素去饱和酶基因或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因或crtISO基因或FtsZ基因或MinD基因。
对于真核生物来源的含有内含子的基因组HMG-CoA还原酶序列或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶序列或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶序列或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶序列或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶序列或牻牛儿基二磷酸酯合酶序列或法呢基二磷酸酯合酶序列或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶序列或八氢番茄红素合酶序列或八氢番茄红素去饱和酶序列或ζ-胡萝卜素去饱和酶序列或crtISO序列或FtsZ序列或MinD序列，在宿主生物不能或不能通过改造来表达相应酮酶时，优选使用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
该优选的实施方案中，与野生型相比，本发明优选的转基因生物中至少还存在另一个HMG-CoA还原酶基因和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因和/或异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因和/或牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或八氢番茄红素合酶基因和/或八氢番茄红素去饱和酶基因和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因和/或crtISO基因和/或FtsZ基因和/或MinD基因。
在该优选实施方案中，遗传修饰的植物具有，例如至少一个编码HMG-CoA还原酶的外源核酸或至少两个编码HMG-CoA还原酶的内源核酸，和/或至少一个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的外源核酸或至少两个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的内源核酸，和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的外源核酸或至少两个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的内源核酸，和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的外源核酸或至少两个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的内源核酸，和/或至少一个编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的外源核酸或至少一个编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的内源核酸，和/或至少一个编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少两个编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的内源核酸，和/或至少一个编码法呢基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少两个编码法呢基二磷酸酯合酶的内源核酸，和/或至少一个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少两个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的内源核酸，和/或至少一个编码八氢番茄红素合酶的外源核酸或至少一个编码八氢番茄红素合酶的内源核酸，和/或至少一个编码八氢番茄红素去饱和酶的外源核酸或至少两个编码八氢番茄红素去饱和酶的内源核酸，和/或至少一个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的外源核酸或至少两个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的内源核酸，和/或至少一个编码crtISO蛋白的外源核酸或至少两个编码crtISO蛋白的内源核酸，和/或至少一个编码FtsZ蛋白的外源核酸或至少两个编码FtsZ蛋白的内源核酸，和/或至少一个编码MinD蛋白的外源核酸或至少两个编码MinD蛋白的内源核酸。
HMG-CoA还原酶基因的实例为拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的编码HMG-CoA还原酶的核酸，登录号NM_106299(核酸SEQ ID NO7，蛋白质SEQ ID NO8)，还包括其他生物来源的登录号如下的其他HMG-CoA还原酶基因P54961、P54870、P54868、P54869、O02734、P22791、P54873、P54871、P23228、P13704、P54872、Q01581、P17425、P54874、P54839、P14891、P34135、O64966、P29057、P48019、P48020、P12683、P43256、Q9XEL8、P34136、O64967、P29058、P48022、Q41437、P12684、Q00583、Q9XHL5、Q41438、Q9YAS4、O76819、O28538、Q9Y7D2、P54960、O51628、P48021、Q03163、P00347、P14773、Q12577、Q59468、P04035、O24594、P09610、Q58116、O26662、Q01237、Q01559、Q12649、O74164、O59469、P51639、Q10283、O08424、P20715、P13703、P13702、Q96UG4、Q8SQZ9、O15888、Q9TUM4、P93514、Q39628、P93081、P93080、Q944T9、Q40148、Q84MM0、Q84LS3、Q9Z9N4、Q9KLM0。
(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因的实例为拟南芥来源的编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸(lytB/ISPH)，登录号AY168881，(核酸SEQ ID NO9，蛋白质SEQ ID NO102)，还包括其他生物来源的登录号如下的其他(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因T04781、AF270978_1、NP_485028.1、NP_442089.1、NP_681832.1、ZP_00110421.1、ZP_00071594.1、ZP_00114706.1、ISPH_SYNY3、ZP_00114087.1、ZP_00104269.1、AF398145_1、AF398146_1、AAD55762.1、AF514843_1、NP_622970.1、NP_348471.1、NP_562001.1、NP_223698.1、NP_781941.1、ZP_00080042.1、NP_859669.1、NP_214191.1、ZP_00086191.1、ISPH_VIBCH、NP_230334.1、NP_742768.1、NP_302306.1、ISPH_MYCLE、NP_602581.1、ZP_00026966.1、NP_520563.1、NP_253247.1、NP_282047.1、ZP_00038210.1、ZP_00064913.1、CAA61555.1、ZP_00125365.1、ISPH_ACICA、EAA24703.1、ZP_00013067.1、ZP_00029164.1、NP_790656.1、NP_217899.1、NP_641592.1、NP_636532.1、NP_719076.1、NP_660497.1、NP_422155.1、NP_715446.1、ZP_00090692.1、NP_759496.1、ISPH_BURPS、ZP_00129657.1、NP_215626.1、NP_335584.1、ZP_00135016.1、NP_789585.1、NP_787770.1、NP_769647.1、ZP_00043336.1、NP_242248.1、ZP_00008555.1、NP_246603.1、ZP_00030951.1、NP_670994.1、NP_404120.1、NP_540376.1、NP_733653.1、NP_697503.1、NP_840730.1、NP_274828.1、NP_796916.1、ZP_00123390.1、NP_824386.1、NP_737689.1、ZP_00021222.1、NP_757521.1、NP_390395.1、ZP_00133322.1、CAD76178.1、NP_600249.1、NP_454660.1、NP_712601.1、NP_385018.1、NP_751989.1。
1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的实例为食用番茄(Lycopersicon esculentum)来源的编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸，登录号#AF143812(核酸SEQ ID NO103，蛋白质SEQ IDNO12)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因AF143812_1、DXS_CAPAN、CAD22530.1、AF182286_1、NP_193291.1、T52289、AAC49368.1、AAP14353.1、D71420、DXS_ORYSA、AF443590_1、BAB02345.1、CAA09804.2、NP_850620.1、CAD22155.2、AAM65798.1、NP_566686.1、CAD22531.1、AAC33513.1、CAC08458.1、AAG10432.1、T08140、AAP14354.1、AF428463_1、ZP_00010537.1、NP_769291.1、AAK59424.1、NP_107784.1、NP_697464.1、NP_540415.1、NP_196699.1、NP_384986.1、ZP_00096461.1、ZP_00013656.1、NP_353769.1、BAA83576.1、ZP_00005919.1、ZP_00006273.1、NP_420871.1、AAM48660.1、DXS_RHOCA、ZP_00045608.1、ZP_00031686.1、NP_841218.1、ZP_00022174.1、ZP_00086851.1、NP_742690.1、NP_520342.1、ZP_00082120.1、NP_790545.1、ZP_00125266.1、CAC17468.1、NP_252733.1、ZP_00092466.1、NP_439591.1、NP_414954.1、NP_752465.1、NP_622918.1、NP_286162.1、NP_836085.1、NP_706308.1、ZP_00081148.1、NP_797065.1、NP_213598.1、NP_245469.1、ZP_00075029.1、NP_455016.1、NP_230536.1、NP_459417.1、NP_274863.1、NP_283402.1、NP_759318.1、NP_406652.1、DXS_SYNLE、DXS_SYNP7、NP_440409.1、ZP_00067331.1、ZP_00122853.1、NP_717142.1、ZP_00104889.1、NP_243645.1、NP_681412.1、DXS_SYNEL、NP_637787.1、DXS_CHLTE、ZP_00129863.1、NP_661241.1、DXS_XANCP、NP_470738.1、NP_484643.1、ZP_00108360.1、NP_833890.1、NP_846629.1、NP_658213.1、NP_642879.1、ZP_00039479.1、ZP_00060584.1、ZP_00041364.1、ZP_00117779.1、NP_299528.1。
1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因的实例为拟南芥来源的编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸，登录号#AF148852，(核酸SEQ ID NO13，蛋白质SEQ ID NO14)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因AF148852、AY084775、AY054682、AY050802、AY045634、AY081453、AY091405、AY098952、AJ242588、AB009053、AY202991、NP_201085.1、T52570、AF331705_1、BAB16915.1、AF367205_1、AF250235_1、CAC03581.1、CAD22156.1、AF182287_1、DXR_MENPI、ZP_00071219.1、NP_488391.1、ZP_00111307.1、DXR_SYNLE、AAP56260.1、NP_681831.1、NP_442113.1、ZP_00115071.1、ZP_00105106.1、ZP_00113484.1、NP_833540.1、NP_657789.1、NP_661031.1、DXR_BACHD、NP_833080.1、NP_845693.1、NP_562610.1、NP_623020.1、NP_810915.1、NP_243287.1、ZP_00118743.1、NP_464842.1、NP_470690.1、ZP_00082201.1、NP_781898.1、ZP_00123667.1、NP_348420.1、NP_604221.1、ZP_00053349.1、ZP_00064941.1、NP_246927.1、NP_389537.1、ZP_00102576.1、NP_519531.1、AF124757_19、DXR_ZYMMO、NP_713472.1、NP_459225.1、NP_454827.1、ZP_00045738.1、NP_743754.1、DXR_PSEPK、ZP_00130352.1、NP_702530.1、NP_841744.1、NP_438967.1、AF514841_1、NP_706118.1、ZP_00125845.1、NP_404661.1、NP_285867.1、NP_240064.1、NP_414715.1、ZP_00094058.1、NP_791365.1、ZP_00012448.1、ZP_00015132.1、ZP_00091545.1、NP_629822.1、NPP_798691.1、NP_231885.1、NP_252340.1、ZP_00022353.1、NP_355549.1、NP_420724.1、ZP_00085169.1、EAA17616.1、NP_273242.1、NP_219574.1、NP_387094.1、NP_296721.1、ZP_00004209.1、NP_823739.1、NP_282934.1、BAA77848.1、NP_660577.1、NP_760741.1、NP_641750.1、NP_636741.1、NP_829309.1、NP_298338.1、NP_444964.1、NP_717246.1、NP_224545.1、ZP_00038451.1、DXR_KITGR、NP_778563.1。
异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因的实例为巴勒斯提纳侧金盏花(Adonis palaestina)克隆ApIPI28来源的编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸(ipiAa1)，登录号#AF188060，由Cunningham、F.X.Jr.和Gantt，E.发表Identification of multi-gene familiesencoding isopentenyl diphosphate isomerase in plants by heterologouscomplementation in Escherichia coli，Plant Cell Physiol.41(1)、119-123(2000)(核酸SEQ ID NO15，蛋白质SEQ ID NO16)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因Q38929、O48964、Q39472、Q13907、O35586、P58044、O42641、O35760、Q10132、P15496、Q9YB30、Q8YNH4、Q42553、O27997、P50740、O51627、O48965、Q8KFR5、Q39471、Q39664、Q9RVE2、Q01335、Q9HHE4、Q9BXS1、Q9KWF6、Q9CIF5、Q88WB6、Q92BX2、Q8Y7A5、Q8TT35 Q9KK75、Q8NN99、Q8XD58、Q8FE75、Q46822、Q9HP40、P72002、P26173、Q9Z5D3、Q8Z3X9、Q8ZM82、Q9X7Q6、O13504、Q9HFW8、Q8NJL9、Q9UUQ1、Q9NH02、Q9M6K9、Q9M6K5、Q9FXR6、O81691、Q9S7C4、Q8S3L8、Q9M592、Q9M6K3、Q9M6K7、Q9FV48、Q9LLB6、Q9AVJ1、Q9AVG8、Q9M6K6、Q9AVJ5、Q9M6K2、Q9AYS5、Q9M6K8、Q9AVG7、Q8S3L7、Q8W250、Q94IE 1、Q9AVI8、Q9AYS6、Q9SAY0、Q9M6K4、Q8GVZ0、Q84RZ8、Q8KZ12、Q8KZ66、Q8FND7、Q88QC9、Q8BFZ6、BAC26382、CAD94476。
牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的实例为拟南芥来源的编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸，登录号#Y17376，Bouvier，F.、Suire，C.、d’Harlingue，A.、Backhaus，R.A.和Camara，B.Molecular cloning of geranyl phosphate synthase and compartmentation ofmonoterpene synthesis in plant cells，Plant J.24(2)，241-252(2000)(核酸SEQ ID NO17，蛋白质SEQ ID NO18)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他牻牛儿基二磷酸酯合酶基因Q9FT89、Q8LKJ2、Q9FSW8、Q8LKJ3、Q9SBR3、Q9SBR4、Q9FET8、Q8LKJ1、Q84LG1、Q9JK86。
法呢基二磷酸酯合酶基因的实例为拟南芥来源的编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸(FPS1)，登录号#U80605，发表于Cunillera，N.、Arro，M.、Delourme，D.、Karst，E、Boronat，A.和Ferrer，A.Arabidopsis thaliana contains two differentially expressedfarnesyl phosphate synthase genes，J.Biol Chem.271(13)，7774-7780(1996)(核酸SEQ ID NO19，蛋白质SEQ ID NO112)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他法呢基二磷酸酯合酶基因P53799、P37268、Q02769、Q09152、P49351、O24241、Q43315、P49352、O24242、P49350、P08836、P14324、P49349、P08524、O66952、Q08291、P54383、Q45220、P57537、Q8K9A0、P22939、P45204、O66126、P55539、Q9SWH9、Q9AVI7、Q9FRX2、Q9AYS7、Q94IE8、Q9FXR9、Q9ZWF6、Q9FXR8、Q9AR37、O50009，Q94IE9，Q8RVK7、Q8RVQ7、O04882、Q93RA8、Q93RB0、Q93RB4、Q93RB5，Q93RB3、Q93RB1、Q93RB2、Q920E5。
牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的实例为白芥(Sinapis alba)来源的编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸，登录号#X98795，发表于Bonk，M.、Hoffmann，B.、Von Lintig，J.、Schledz，M.、Al-Babili，S.、Hobeika，E.、Kleinig，H.和Beyer，P.Chloroplastimport of four carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveals differentialfates prior to membrane binding and oligomeric assembly，Eur.J.Biochem.247(3)，942-950(1997)(核酸SEQ ID NO21，蛋白质SEQ ID NO114)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因P22873、P34802，P56966、P80042、Q42698、Q92236、O95749、Q9WTN0、Q50727、P24322、P39464、Q9FXR3、Q9AYN2、Q9FXR2、Q9AVG6、Q9FRW4、Q9SXZ5、Q9AVJ7、Q9AYN1、Q9AVJ4、Q9FXR7、Q8LSC5、Q9AVJ6、Q8LSC4、Q9AVJ3、Q9SSU0、Q9SXZ6、Q9SST9、Q9AVJ0、Q9AVI9、Q9FRW3、Q9FXR5、Q94IF0、Q9FRX1、Q9K567、Q93RA9、Q93QX8、CAD95619、EAA31459。
八氢番茄红素合酶基因的实例为噬夏孢欧文菌(Erwinia uredovora)来源的编码八氢番茄红素合酶的核酸，登录号#D90087，发表于Misawa，N.、Nakagawa，M.、Kobayashi，K.、Yamano，S.、Izawa，Y.、Nakamura，K.和Harashima，K.Elucidation of theErwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysisof gene products expressed in Escherichia coli；J.Bacteriol.172(12)，6704-6712(1990)(核酸SEQ ID NO23，蛋白质SEQ ID NO24)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他八氢番茄红素合酶基因CAB39693、BAC69364、AAF10440、CAA45350、BAA20384、AAM72615、BAC09112、CAA48922、P_001091、CAB84588、AAF41518、CAA48155、AAD38051、AAF33237、AAG10427、AAA34187、BAB73532、CAC19567、AAM62787、CAA55391、AAB65697、AAM45379、CAC27383、AAA32836、AAK07735、BAA84763、P_000205、AAB60314、P_001163、P_000718、AAB71428、AAA34153、AAK07734、CAA42969、CAD76176、CAA68575、P_000130、P_001142、CAA47625、CAA85775、BAC14416、CAA79957、BAC76563、P_000242、P_000551、AAL02001、AAK15621、CAB94795、AAA91951、P_000448。
八氢番茄红素去饱和酶基因的实例为
噬夏孢欧文菌来源的编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸，登录号#D90087；发表于Misawa，N.、Nakagawa，M.、Kobayashi，K.、Yamano，S.、Izawa，Y.、Nakamura，K.和Harashima，K.Elucidation of the Erwiniauredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of geneproducts expressed in Escherichia coli；J.Bacteriol. 172(12)，6704-6712(1990)(核酸SEQ ID NO25，蛋白质SEQ ID NO26)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他八氢番茄红素去饱和酶基因AAL15300、A39597、CAA42573、AAK51545、BAB08179、CAA48195、BAB82461、AAK92625、CAA55392、AAG10426、AAD02489、AAO24235、AAC12846、AAA99519、AAL38046、CAA60479、CAA75094、ZP_001041、ZP_001163、CAA39004、CAA44452、ZP_001142、ZP_000718、BAB82462、AAM45380、CAB56040、ZP_001091、BAC09113、AAP79175、AAL80005、AAM72642、AAM72043、ZP_000745、ZP_001141、BAC07889、CAD55814、ZP_001041、CAD27442、CAE00192、ZP_001163、ZP_000197、BAA18400、AAG10425、ZP_001119、AAF13698、2121278A、AAB35386、AAD02462、BAB68552、CAC85667、AAK51557、CAA12062、AAG51402、AAM63349、AAF85796、BAB74081、AAA91161、CAB56041、AAC48983、AAG14399、CAB65434、BAB73487、ZP_001117、ZP_000448、CAB39695、CAD76175、BAC69363、BAA17934、ZP_000171、AAF65586、ZP_000748、BAC07074、ZP_001133、CAA64853、BAB74484、ZP_001156、AAF23289、AAG28703、AAP09348、AAM71569、BAB69140、ZP_000130、AAF41516、AAG18866、CAD95940、NP_656310、AAG10645、ZP_000276、ZP_000192、ZP_000186、AAM94364、EAA31371、ZP_000612、BAC75676、AAF65582。
ζ-胡萝卜素去饱和酶基因的实例为黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)来源的编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸，登录号#AJ224683，发表于Al-Babili，S.、Oelschlegel，J.和Beyer，P.A cDNA encoding for beta carotene desaturase(Aceession No.AJ224683)from Narcissus pseudonarcissus L..(PGR98-103)，Plant Physiol.117，719-719(1998)(核酸SEQ ID NO119，蛋白质SEQ ID NO28)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他ζ-胡萝卜素去饱和酶基因Q9R6X4、Q38893、Q9SMJ3、Q9SE20、Q9ZTP4、O49901、P74306、Q9FV46、Q9RCT2、ZDS_NARPS、BAB68552.1、CAC85667.1、AF372617_1、ZDS_TARER、CAD55814.1、CAD27442.1、2121278A、ZDS_CAPAN、ZDS_LYCES、NP_187138.1、AAM63349.1、ZDS_ARATH、AAA91161.1、ZDS_MAIZE、AAG14399.1、NP_441720.1、NP_486422.1、ZP_00111920.1、CAB56041.1、ZP_00074512.1、ZP_00116357.1、NP_681127.1、ZP_00114185.1、ZP_00104126.1、CAB65434.1、NP_662300.1。
crtISO基因的实例为食用番茄来源的编码crtISO的核酸；登录号#AF416727，发表于Isaacson，T.、Ronen，G.、Zamir，D.和Hirschberg，J.Cloning of tangerinefrom tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production ofbeta-carotene and xanthophylls in plants；Plant Cell 14(2)，333-342(2002)(核酸SEQ ID NO29，蛋白质SEQ ID NO122)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他crtISO基因AAM53952FtsZ基因的实例为万寿菊来源的编码FtsZ的核酸，登录号#AF251346，发表于Moehs，C.P.、Tian，L.、Osteryoung，K.W.和Dellapenna，D.Analysis of carotenoidbiosynthetic gene expression during marigold petal development；PlantMol.Biol.45(3)，281-293(2001)(核酸SEQ ID NO31，蛋白质SEQ IDNO32)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他FtsZ基因CAB89286.1、AF205858_1、NP_200339.1、CAB89287.1、CAB41987.1、AAA82068.1、T06774，AF383876_1、BAC57986.1、CAD22047.1、BAB91150.1、ZP_00072546.1、NP_440816.1、T51092、NP_683172.1、BAA85116.1、NP_487898.1、JC4289、BAA82871.1、NP_781763.1、BAC57987.1、ZP_00111461.1、T51088、NP_190843.1、ZP_00060035.1、NP_846285.1、AAL07180.1、NP_243424.1、NP_833626.1、AAN04561.1、AAN04557.1、CAD22048.1、T51089、NP_692394.1、NP_623237.1、NP_565839.1、T51090、CAA07676.1、NP_113397.1、T51087、CAC44257.1、E84778、ZP_00105267.1、BAA82091.1、ZP_00112790.1、BAA96782.1、NP_348319.1、NP_471472.1、ZP_00115870.1、NP_465556.1、NP_389412.1、BAA82090.1、NP_562681.1、AAM22891.1、NP_371710.1、NP_764416.1、CAB95028.1、FTSZ_STRGR、AF120117_1、NP_827300.1、JE0282、NP_626341.1、AAC45639.1、NP_785689.1、NP_336679.1、NP_738660.1、ZP_00057764.1、AAC32265.1、NP_814733.1、FTSZ_MYCKA、NP_216666.1、CAA75616.1、NP_301700.1、NP_601357.1、ZP_00046269.1、CAA70158.1、ZP_00037834.1、NP_268026.1、FTSZ_ENTHR、NP_787643.1、NP_346105.1、AAC32264.1、JC5548、AAC95440.1、NP_710793.1、NP_687509.1、NP_269594.1、AAC32266.1、NP_720988.1、NP_657875.1、ZP_00094865.1、ZP_00080499.1、ZP_00043589.1、JC7087、NP_660559.1、AAC46069.1、AF179611_14、AAC44223.1、NP_404201.1。
MinD基因的实例为万寿菊来源的编码MinD的核酸，登录号#AF251019，发表于Moehs，C.P.、Tian，L.、Osteryoung，K.W.和Dellapenna，D.Analysis of carotenoidbiosynthetic gene expression during marigold petal development；PlantMol.Biol.45(3)，281-293(2001)(核酸SEQ ID NO33，蛋白质SEQ IDNO34)，还包括其他生物体来源的登录号如下的其他MinD基因NP_197790.1、BAA90628.1、NP_038435.1、NP_045875.1、AAN33031.1、NP_050910.1、CAB53105.1、NP_050687.1、NP_682807.1、NP_487496.1、ZP_00111708.1、ZP_00071109.1、NP_442592.1、NP_603083.1、NP_782631.1、ZP_00097367.1、ZP_00104319.1、NP_294476.1、NP_622555.1、NP_563054.1、NP_347881.1、ZP_00113908.1、NP_834154.1、NP_658480.1、ZP_00059858.1、NP_470915.1、NP_243893.1、NP_465069.1、ZP_00116155.1、NP_390677.1、NP_692970.1、NP_298610.1、NP_207129.1、ZP_00038874.1、NP_778791.1、NP_223033.1、NP_641561.1、NP_636499.1、ZP_00088714.1、NP_213595.1、NP_743889.1、NP_231594.1、ZP_00085067.1、NP_797252.1、ZP_00136593.1、NP_251934.1、NP_405629.1、NP_759144.1、ZP_00102939.1、NP_793645.1、NP_699517.1、NP_460771.1、NP_860754.1、NP_456322.1、NP_718163.1、NP_229666.1、NP_357356.1、NP_541904.1、NP_287414.1、NP_660660.1、ZP_00128273.1、NP_103411.1、NP_785789.1、NP_715361.1、AF149810_1、NP_841854.1、NP_437893.1、ZP_00022726.1、EAA24844.1、ZP_00029547.1、NP_521484.1、NP_240148.1、NP_770852.1、AF345908_2、NP_777923.1、ZP_00048879.1、NP_579340.1、NP_143455.1、NP_126254.1、NP_142573.1、NP_613505.1、NP_127112.1、NP_712786.1、NP_578214.1、NP_069530.1、NP_247526.1、AAA85593.1、NP_212403.1、NP_782258.1、ZP_00058694.1、NP_247137.1、NP_219149.1、NP_276946.1、NP_614522.1、ZP_00019288.1、CAD78330.1。
上述优选的实施方案中优选使用的HMG-CoA还原酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO8氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO8序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有HMG-CoA还原酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现HMG-CoA还原酶和HMG-CoA还原酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO8的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO7序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它HMG-CoA还原酶和HMG-CoA还原酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加HMG-CoA还原酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO8的HMG-CoA还原酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO7序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO10氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO10序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％，更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶和(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO10的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO9序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶和(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO10的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO9序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO12氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ IDNO12序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO12的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO11序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ IDNO12的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO11序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO14氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO14序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO14的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO13序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO14的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO13序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的异戊烯基-D-异构酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO16氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO16序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有异戊烯基-D-异构酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现异戊烯基-D-异构酶和异戊烯基-D-异构酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ IDNO16的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO15序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它异戊烯基-D-异构酶和异戊烯基-D-异构酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加异戊烯基-D-异构酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO16的异戊烯基-D-异构酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子，是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO15序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的牻牛儿基二磷酸酯合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO18氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO18序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％；且所述蛋白质具有牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQID NO18的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO17序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加牻牛儿基二磷酸酯合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO18的牻牛儿基二磷酸酯合酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO17序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的法呢基二磷酸酯合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO20氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO20序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有法呢基二磷酸酯合酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现法呢基二磷酸酯合酶和法呢基二磷酸酯合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ IDNO20的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO19序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它法呢基二磷酸酯合酶和法呢基二磷酸酯合酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加法呢基二磷酸酯合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO20的法呢基二磷酸酯合酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO19序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO22氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQID NO22序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO22的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO21序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQID NO22的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO21序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的八氢番茄红素合酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO24氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO24序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有八氢番茄红素合酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素合酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO24的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO23序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素合酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加八氢番茄红素合酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO24的八氢番茄红素合酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子，是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO23序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的八氢番茄红素去饱和酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO26氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO26序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有八氢番茄红素去饱和酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现八氢番茄红素去饱和酶和八氢番茄红素去饱和酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQID NO26的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO25序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它八氢番茄红素去饱和酶和八氢番茄红素去饱和酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加八氢番茄红素去饱和酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO26的八氢番茄红素去饱和酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO25序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的ζ-胡萝卜素去饱和酶基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO28氨基酸序列，或含有对该序列进行氢基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO28序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有ζ-胡萝卜素去饱和酶的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现ζ-胡萝卜素去饱和酶和ζ-胡萝卜素去饱和酶基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ IDNO28的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO119序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它ζ-胡萝卜素去饱和酶和ζ-胡萝卜素去饱和酶基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加ζ-胡萝卜素去饱和酶的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO28的ζ-胡萝卜素去饱和酶氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO119序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的CrtISO基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO30氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO30序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有CrtIso的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现CrtISO和CrtISO基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO30的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO29序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它CrtISO和CrtISO基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加CrtISO的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO30的CrtISO氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO29序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的FtsZ基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO32氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO32序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有FtsZ的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现FtsZn和FtsZ基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ ID NO32的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO31序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它FtsZn和FtsZ基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加FtsZ的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO32的FtsZ氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法，获取合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO31序列的核酸插入生物中。
上述优选实施方案中优选使用的MinD基因为编码以下蛋白质的核酸，所述蛋白质中含有SEQ ID NO34氨基酸序列，或含有对该序列进行氨基酸替换、插入或缺失后产生的序列，后者与SEQ ID NO34序列在氨基酸水平上的同一性为至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，且所述蛋白质具有MinD的酶促性质。
可以从多种已知基因组序列的生物中容易地发现MinDn和MinD基因的其他实例，例如如上所述比较含有SEQ IDNO34的数据库中的氨基酸序列或其相应的反向翻译核酸序列的同源性。
如上所述，利用杂交和PCR技术，以SEQ ID NO33序列起始，通过已知的方法可以从多种基因组序列未知的生物中容易地发现其它MinDn和MinD基因的实例。
在另一个特别优选的实施方案中，为增加MinD的活性，向生物中插入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有序列SEQ ID NO34的MinD氨基酸序列。
可以通过如根据遗传密码反向翻译多肽序列的方法获得合适的核酸序列。
优选为此使用的密码子是根据生物特异性的密码子使用情况选择其中频繁使用者。借助计算机分析相关生物的其他已知基因，可以容易地确定密码子的使用。
在特别优选的实施方案中，将含有SEQ ID NO33序列的核酸插入生物中。
还可以通过公知的方法，从核苷酸结构单元开始进行化学合成来制备上述所有HMG-CoA还原酶基因、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶基因、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因、异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶基因、牻牛儿基二磷酸酯合酶基因、法呢基二磷酸酯合酶基因、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因、八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素去饱和酶基因、ζ-胡萝卜素去饱和酶基因、crtISO基因、FtsZ基因或MinD基因，例如利用单个重叠互补的双螺旋核酸结构单元的片段缩合来制备。通过如已知的亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897页)，可以化学合成寡核苷酸。添加合成的寡核苷酸、使用DNA聚合酶的Klenow片段填补空位、连接反应和一般的克隆方法如Sambrook等(1989)，《Molecular cloningA laboratorymanual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press所述。
编码酮酶的核酸、编码β-羟化酶的核酸、编码β环化酶的核酸(含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性)，以及编码HMG-CoA还原酶的核酸、编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸、编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸、编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸、编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码八氢番茄红素合酶的核酸、编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸、编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸、编码crtISO蛋白的核酸、编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸在以下也称为“作用基因”。
可以通过下述途径产生遗传修饰的非人生物，如插入含有一个作用基因的单个核酸构建体(表达盒)、或插入包含上至2个或3个作用基因或多于3个作用基因的多重构建体。
本发明的生物优选指野生型或起始生物时可天然产生或能够通过遗传互补和/或代谢途径的再调节生产类胡萝卜素(特别是β-胡萝卜素和/或玉米黄质和/或新叶黄素和/或紫黄质(violaxanthin)和/或叶黄素)的生物。
其他优选的生物在野生型或起始生物时已经具有羟化酶的活性，因此其野生型或起始生物即能产生玉米黄质。
优选生物为植物或微生物，例如，细菌、酵母、藻类或真菌。
使用的细菌可以是由于插入产类胡萝卜素生物的类胡萝卜素生物合成基因而能合成叶黄素的细菌(例如含有例如欧文氏菌(Erwinia)来源的crt基因的埃希氏杆菌属(Escherichia)细菌)，以及自身即能够合成叶黄素的细菌(如欧文氏菌属、农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱菌属、副球菌属、念珠藻属的细菌或集胞藻属的蓝细菌(Cyanobacteria))。
优选的细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、噬夏孢欧文氏菌、橙黄农杆菌、产碱菌属种PC-1、黄杆菌属种R1534菌株、集胞藻属蓝细菌PCC6803、Paracoccus marcusii或Paracoccus carotinifaciens。
优选的酵母为假丝酵母(Candida)、酵母(Saccharomyces)、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia)或法夫酵母(Phaffia)。特别优选的酵母为Xanthophyllomyces dendrorhous或Phaffia rhodozyma。
优选的真菌为曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、阿舒嚢霉(Ashbya)、脉孢菌(Neurospora)、布拉霉(特别是Blakeslea trispora)、须霉(Phycomyces)、镰孢霉(Fusarium)或如Indian Chem.Engr.B部分卷37，No.1，2(1995)15页，表6中描述的其它真菌。
优选的藻类有绿藻，如红球藻属(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、团藻属(Volvox)或杜氏藻属(Dunaliella)的藻类。特别优选的藻类有雨生红球藻或杜氏藻属巴德成藻(Dunaliellabardawil)。
其它可用于实施本发明方法的微生物及其生产，公开于如此处引用作为参考的DE-A-199 16 140。
特别优选的植物选自苋科(Amaranthaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、紫菀科(Asteraceae)、凤仙花科(Balsaminaceae)、秋海棠科(Begoniaceae)、小檗科(Berberidaceae)、十字花科(Brassicaceae)、大麻科(Cannabaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、十字花科(Cruciferae)、大戟属(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Graminae)、Illiaceae、唇形科(Labiatae)、薄荷科(Lamiaceae)、豆科(Leguminosae)、百合科(Liliaceae)、亚麻科(Linaceae)、山梗菜属(Lobeliaceae)、锦葵科(Malvaceae)、木犀科(Oleaceae)、兰科(Orchidaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、白花丹科(Plumbaginaceae)、禾本科(Poaceae)、花荵科(Polemoniaceae)、报春花科(Primulaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、旱金莲科(Tropaeolaceae)、伞状花科(Umbelliferae)、毛蕊花科(Verbanaceae)、葡萄科(Vitaceae)及紫罗兰科(Violaceae)。
极其优选的植物选自万寿菊属(Marigold、万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、金合欢属(Acacia)、乌头属(Aconitum)、侧金盏花属(Adonis)、阿尼菊属(Arnica)、耧斗菜属(Aquilegia)、紫菀属(Aster)、黄芪属(Astragalus)、紫葳属(Bignonia)、金盏花属(Calendula)、驴蹄草属(Caltha)、风铃草属(Campanula)、美人蕉属(Canna)、矢车菊属(Centaurea)、桂竹香属(Cheiranthus)、茼蒿属(Chrysanthemum)、柑桔属(Citrus)、还阳参属(Crepis)、番红花属(Crocus)、南瓜属(Curcurbita)、金雀儿属(Cytisus)、Delonia属、翠雀属(Delphinium)、石竹属(Dianthus)、康乃馨属(Dimorphotheca)、多榔菊属(Doronicum)、花菱草属(Eschscholtzia)、连翘属(Forsythia)、Fremontia属、勋章菊属(Gazania)、钩吻属(Gelsemium)、染料木属(Genista)、龙胆属(Gentiana)、老鹳草属(Geranium)、非洲菊属(Gerbera)、路边青属(Geum)、银桦属(Grevillea)、堆心菊属(Helenium)、向日葵属(Helianthus)、细辛属(Hepatica)、独活属(Heracleum)、木槿属(Hisbiscus)、赛菊芋属(Heliopsis)、金丝桃属(Hypericum)、黄金菊属(Hypochoeris)、凤仙花属(Impatiens)、鸢尾属(Iris)、蓝花楹属(Jacaranda)、棣堂属(Kerria)、毒豆属(Laburnum)、山黧豆属(Lathyrus)、猫耳草属(Leontodon)、百合属(Lilium)、亚麻属(Linum)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、珍珠菜属(Lysimachia)、Maratia属、苜蓿属(Medicago)、沟酸浆属(Mimulus)、水仙属(Narcissus)、月见草属(Oenothera)、木犀属(Osmanthus)、碧冬茄属(Petunia)、石楠属(Photina)、酸浆属(Physalis)、牧根草属(Phyteuma)、委陵草属(Potentilla)、火棘属(Pyracantha)、毛茛属(Raunculus)、杜鹃花属(Rhododendron)、蔷薇属(Rosa)、金光菊属(Rudbeckia)、千里光属(Senecio)、蝇子草属(Silene)、松香草属(Silphium)、Sinapsis属、花楸属(Sorbus)、鹰爪豆属(Spartium)、黄钟花属(Tecoma)、蝴蝶草属(Torenia)、婆罗们参属(Tragopogon)、金莲花属(Trollius)、旱金莲属(Tropaeolum)、郁金香属(Tulipa)、款冬属(Tussilago)、荆豆属(Ulex)、堇菜属(Viola)或百日草属(Zinnia)植物，特别优选万寿菊属(Marigold)、万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetespatula)、番茄属(Lycopersicon)、蔷薇属(Rosa)、金盏花属(Calendula)、酸浆属(Physalis)、苜蓿属(Medicago)、向日葵属(Helianthus)、茼蒿属(Chrysanthemum)、紫菀属(Aster)、郁金香属(Tulipa)、水仙属(Narcissus)、碧冬茄属(Petunia)、老鹳草属(Geranium)、旱金莲属(Tropaeolum)或侧金盏花属(Adonis)植物之一。
在本发明制备酮类式胡萝卜素的方法中，优选在培养遗传修饰的生物之后收获生物、并进一步优选从生物中分离酮类胡萝卜素。
可以通过众所周知的适合特定生物的方式收获生物。在液体营养培养基中发酵培养的微生物(如细菌、酵母、藻类或真菌)或植物细胞，可以通过例如离心、滗析或过滤分离。通过已知的方式将植物生长于营养培养基中并适当时收获。
优选在有氧、至少约20℃的培养温度(例如20℃到40℃)、pH约6-9的条件下培养遗传修饰的微生物。对于遗传修饰的微生物，优选先在有氧、合成培养基(如TB或LB培养基)中、约20℃或更高温度的培养温度、pH约6至9的条件下培养，直到达到足够的细胞密度。为了能更好地控制氧化反应，优选使用可诱导的启动子。诱导酮酶表达后继续在有氧条件下培养如12小时到3天。
可以通过已知的方式从收获的生物质中分离酮类胡萝卜素，如通过抽提，并适当时经进一步的化学或物理纯化方法，例如沉淀法、结晶、热分离法(如精馏法)或物理分离法(如层析)。
可如下所述在本发明遗传修饰的植物中特异地产生酮类胡萝卜素，优选在多种植物组织中产生，如种子、叶、果实、花，特别是花瓣。
可以通过已知的方式从收集的花瓣中分离酮类胡萝卜素，例如通过干燥并随后抽提，以及适当时进一步利用化学或物理纯化方法，例如沉淀法、结晶、热分离法(如精馏法)或物理分离法(如层析)。例如，优选使用有机溶剂(如丙酮、己烷、乙醚或叔-甲基丁基醚)从花瓣中分离酮类胡萝卜素。
其他分离酮类胡萝卜素(特别是从花瓣中分离)的方法描述于如Egger和Kleinig(Phytochemistry(1967)6，437-440)以及Egger(Phytochemistry(1965)4，609-618)中。
优选的酮类胡萝卜素选自虾青素、角黄素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3’-羟基海胆酮、金盏花玉红质和金盏花黄质。
特别优选的酮类胡萝卜素为虾青素。
取决于使用生物的不同，获取的酮类胡萝卜素为游离的或脂肪酸酯或二葡萄糖苷形式。
利用本发明方法从植物花瓣中获得的酮类胡萝卜素为其与脂肪酸形成的单酯或二酯的形式。一些检测到的脂肪酸的实例为肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸和月桂酸(Kamata和Simpson(1987)Comp.Biochem.Physio.卷86B(3)，587-591)。
酮类胡萝卜素的生产可以在整个植物中进行，或在优选实施方案中，特定在含有有色体的植物组织中进行。优选的植物组织例如根、种子、叶、果实、花，特别是蜜腺和花瓣。
在本发明方法的一个特别优选的实施方案中，使用了在花中酮酶表达速率最高的遗传修饰植物。
优选使用花特异性的启动子控制酮酶基因表达来实现这一点。例如，为此可如下文详细描述的，向植物中与花特异性启动子功能性连接的核酸构建体中插入前述核酸。
在本发明方法的另一特别优选的实施方案中，使用了在果实中酮酶表达速率最高的遗传修饰植物。
优选使用果实特异性的启动子控制酮酶基因表达来实现这一点。例如，为此可如下文详细描述的，向植物中与果实特异性启动子功能性连接的核酸构建体中插入前述核酸。
在本发明方法的另一特别优选的实施方案中，使用了在种子中酮酶表达速率最高的遗传修饰植物。
优选使用种子特异性的启动子控制酮酶基因表达来实现这一点。例如，为此可如下文详细描述的，向植物中与种子特异性启动子功能性连接的核酸构建体中插入前述核酸。
通过功能性连接的质体转运肽可以实现对有色体的靶向定位。
以下通过实施例描述遗传修饰植物的产生，所述遗传修饰的植物具有增加的或造成的酮酶活性，以及增加的或造成的β环化酶活性(其修饰的β环化酶活性是由于该β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ IDNO2序列至少有70％的同一性)。
其他活性，如羟化酶活性、HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性和/或MinD活性，可以通过使用相应的作用基因，得到类似的增加。
在组合的遗传修饰中，转化可以逐个进行，或通过多重构建体完成。
优选使用含有上述的编码酮酶及编码β环化酶核酸的核酸构建体转化起始植物来产生转基因植物，所述核酸与一个或多个确保在植物中转录和翻译的调节信号功能性连接；所述核酸编码的β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
另外，也优选使用两个核酸构建体转化起始植物来产生转基因植物。一个核酸构建体含有至少一个上述编码酮酶的核酸，其与一个或多个确保在植物中转录和翻译的调节信号功能性连接。另一个核酸构建体含有至少一个上述编码β环化酶的核酸，其与一个或多个确保在植物中转录和翻译的调节信号功能性连接，所述核酸编码的β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
以下也将这些作用基因与一个或多个确保在植物中转录和翻译的调节信号功能性连接的核酸构建体称为表达盒。
优选调节信号含有一个或多个确保在植物中转录和翻译的启动子。
表达盒含有调节信号，即控制作用基因在宿主细胞中表达的调节性核酸序列。根据优选实施方案之一，表达盒包含上游启动子(即位于编码序列5’端)和下游多腺苷酸化信号(即位于编码序列3’端)，并在适当时还含有与至少一个上述基因有效连接的其它调节元件，其中作用基因的编码序列存在于所述调节元件中。“有效连接”是指启动子、编码序列、终止子和适当时的其它调节元件以各调节元件能够在编码序列的表达中发挥其预期功能的方式依次排列。
以下举例描述了优选的用于植物的核酸构建体、表达盒和载体，以及产生转基因植物的方法及转基因植物自身。
用于有效连接的优选序列(但并不仅限于此)为确保在质外体、液泡、质体、线粒体、内质网(ER)、细胞核、油质体或其它区室中亚细胞定位的靶向序列，以及翻译增强子(如烟草花叶病毒来源的5’前导序列)(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。
原则上能够控制外源基因在植物中表达的任何启动子都适合用作表达盒启动子。
“组成型”启动子是指在植物发育过程中的相对长时期(优选植物发育的全部时期)，确保在许多组织(优选所有组织)中表达的启动子。
具体而言，优选使用植物启动子或植物病毒来源的启动子。特别优选花椰菜嵌合病毒35S转录物的CaMV启动子(Franck等(1980)Cell 21285-294；Odell等(1985)Nature 313810-812；Shewmaker等(1985)Virology 140281-288；Gardner等(1986)Plant Mol Biol 6221-228)、19SCaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等(1989)EMBO J 82195-2202)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的丙糖磷酸转运蛋白(TPT)启动子(Acc.No.AB006698，碱基对53242至55281，起始于bp 55282的基因被注释为“磷酸/丙糖磷酸转运蛋白”)，或玄参(figwort)嵌合病毒来源的34S启动子(Acc.No.X16673，碱基对1到554)。
其他合适的组成型启动子为pds启动子(Pecker等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 894962-4966)或核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank Acc.No.X03677)、农杆菌胭脂碱合成酶启动子、TR双重启动子、农杆菌OCS(章鱼碱合成酶)启动子、泛素启动子(Holtorf S等(1995)Plant Mol Biol 29637-639)、泛素1启动子(Christensen等(1992)Plant Mol Biol 18675-689；Bruce等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869692-9696)、Smas启动子、桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亚基的启动子或小麦来源富含脯氨酸的蛋白质的启动子(WO 91/13991)、Pnit启动子(Y07648.L，Hillebrand等(1998)，Plant.Mol.Biol.36，89-99，Hillebrand等(1996)，Gene，170，197-200)，以及本领域技术人员已知的在植物中组成型表达的其它基因的启动子。
表达盒也可以含有化学诱导型启动子(综述文章Gatz等(1997)AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol 4889-108)，通过这种启动子可以在某一特定时间点控制作用基因在植物中的表达。该类启动子，例如PRP1启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、水杨酸诱导的启动子(WO95/19443)、苯磺酰胺诱导的启动子(EP 0 388 186)、四环素诱导的启动子(Gatz等(1992)Plant J 2397-404)、脱落酸诱导的启动子(EP 0 335 528)或乙醇或环己酮诱导的启动子(WO 93/21334)也同样可使用。
优选的启动子还有为生物或非生物应激所诱导的启动子，例如病原体诱导的PRP1基因启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22361-366)，热诱导的番茄hsp70或hsp80启动子(US 5,187,267)、冷诱导的马铃薯α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)、光诱导的PPDK启动子或损伤诱导的pinII启动子(EP375091)。
病原体诱导的启动子包括受病原体攻击诱导产生的基因的启动子，如PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等的基因的启动子(例如Redolfi等(1983)Neth J Plant Pathol 89245-254；Uknes等(1992)ThePlant Cell 4645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral 4111-116；Marineau等(1987)Plant Mol Biol 9335-342；Matton等(1987)MolecularPlant-Microbe Interactions 2325-342；Somssich等(1986)Proc Natl AcadSci USA 832427-2430；Somssich等(1988)Mol Gen Genetics 293-98；Chen等(1996)Plant J 10955-966；Zhang和Sing(1994)Proc Natl AcadSci USA 912507-2511；Warner等(1993)Plant J 3191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1961-968(1989))。
也包括损伤诱导的启动子，如pinII基因启动子(Ryan(1990)Ann RevPhytopath 28425-449；Duan等(1996)Nat Biotech 14494-498)、wun1和wun2基因启动子(US 5,428,148)、win1和win2基因启动子(Stanford等(1989)Mol Gen Genet 215200-208)、系统素(systemin)基因启动子(McGurl等(1992)Science 2251570-1573)、WIP1基因启动子(Rohmeier等(1993)Plant Mol Biol 22783-792；Ekelkamp等(1993)FEBS Letters 32373-76)、MPI基因启动子(Corderok等(1994)The Plant J 6(2)141-150)等。
其它合适的启动子有如果实成熟特异性启动子，例如番茄果实成熟特异性启动子(WO 94/21794、EP 409 625)。发育依赖的启动子部分地包括组织特异性启动子，因为个体组织的天然形成依赖于发育。
此外，特别优选那些确保在组织或植物部位中表达(例如生物合成酮类胡萝卜素或其前体)的启动子。优选启动子有花药、子房、花瓣、萼片、花、叶、茎、种子和根以及其组合特异性的启动子。
球茎、块茎、贮藏根或根特异性启动子，例如I类patatin启动子(B33)或马铃薯组织蛋白酶D抑制物启动子。
叶特异性启动子例如马铃薯胞质FBP酶启动子(WO 97/05900)、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU启动子(小亚基)或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等(1989)EMBO J 82445-2451)。
花特异性启动子例如八氢番茄红素合成酶启动子(WO 92/16635)或P-rr基因启动子(WO 98/22593)、拟南芥AP3启动子、CHRC启动子(黄瓜(Cucumis sativus)来源的有色体特异的类胡萝卜素相关蛋白质(CHRC)基因启动子，Acc.No.AF099501，碱基对1至1532)、EPSP合成酶启动子(碧冬茄(Petunia hybrida)来源的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因启动子Acc.No.M37029，碱基对1至1788)、PDS启动子(番茄(SolanumLycopersicum)来源的八氢番茄红素去饱和酶基因启动子Acc.No.U46919，碱基对1至2078)、DFR-A启动子(碧冬茄来源的二氢黄酮醇4-还原酶基因A启动子，Acc.No.X79723，碱基对32至1902)，或FBP1启动子(碧冬茄来源的花结合蛋白1基因启动子，Acc.No.L10115，碱基对52至1069)。
花药特异性启动子例如5126启动子(US 5,689,049、US 5,689,051)、glob-I启动子或g-玉米醇溶蛋白启动子。
种子特异性启动子，例如ACP05启动子(酰基载体蛋白基因，WO9218634)、拟南芥属AtS1和AtS3启动子(WO 9920775)、蚕豆(Vicia faba)LeB4启动子(WO 9729200和US 06403371)、欧洲油菜(Brassica napus)启动子(US 5608152；EP 255378；US 5420034)、蚕豆SBP启动子(DE 9903432)或玉米End1和End2启动子(WO 0011177)。
其它适合在植物中表达的启动子如Rogers等(1987)Meth in Enzymol153253-277；Schardl等(1987)Gene 611-11和Berger等(1989)Proc NatlAcad Sci USA 868402-8406中所述。
本发明方法中特别优选种子特异性、果实特异性、花特异性、特别是花瓣特异性的组成型启动子。
优选通过如T.Maniatis、E.F.Fritsch和J.Sambrook，《MolecularCloningA Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)及T.J.Silhavy、M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusiohs，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，《Current Protocols inMolecular Biology》，G reene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)描述的常规重组和克隆技术，将合适的启动子与至少一个上述作用基因融合并优选在启动子与核酸序列之间插入的编码质体特异性转运肽的核酸及多腺苷酸化信号，来生成表达盒。
优选插入的编码质体转运肽的核酸能确保在质体(特别是有色体)中的定位。
也可以使用其核酸序列编码作用基因产物融合蛋白的表达盒，其中融合蛋白质的一部分为控制多肽易位的转运肽。优选有色体特异的转运肽，其在作用基因转移进有色体之后，可被酶解从作用基因产物部分中除去。
特别优选的转运肽来自烟草(Nicotiana tabacum)质体转酮酶或其它转运肽(如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基(rbcS)的转运肽或铁氧还蛋白-NADP氧化还原酶的转运肽，以及异戊烯-焦磷酸异构酶2的转运肽)或其功能等价物。
特别优选三种烟草质体转酮酶质体转运肽盒的核酸序列，其以KpnI/BamHI片段的形式处于三个读码框中，其中ATG密码子位于NcoI切割位点pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGG-GATCC_BamHI
pTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG-GATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCT-CACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCG-TACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGC-GATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGG-GATCC_BamHI其它质体转运肽的实例有拟南芥质体异戊烯-焦磷酸异构酶2(IPP-2)的转运肽，以及豌豆来源的核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)的转运肽(Guerineau，F，Woolston，S，Brooks，L，Mullineaux，P(1988)An expressioncassette for targeting foreign proteins into the chloroplasts.Nucl.Acids Res.1611380)。
本发明核酸可以合成制备或从天然获得，或者可以包含合成及天然核酸组分的混合物，并可以由多种生物来源的多个异源基因部分组成。
如上所述，优选具有植物优选密码子的合成核苷酸序列。这些植物优选的密码子，可以从大多数目的植物物种表达蛋白质时出现频率最高的密码子中确定。
在制备表达盒时，可以利用多种DNA片段以便获得便于从正确方向阅读并带有正确阅读框的核苷酸序列。可以在片段上附加连接子或接头，将DNA片段彼此相连。
方便起见，以转录的方向提供具有接头或多聚接头的启动子和终止子区域，所述接头含有用于插入该核酸序列的一个或多个限制位点。一般地，接头含有1至10，通常1至8，优选2至6个限制位点。接头在调节区内的大小一般小于100bp，常常小于60bp，但至少长5bp。对于宿主植物而言，启动子可以是天然的(或同源的)或外源的(或异源的)。表达盒优选以5’-3’转录方向含有启动子、编码核酸序列或核酸构建体，以及转录终止区。不同的终止区可以按需要互换。
终止子的实例有35S终止子(Guerineau等(1988)Nucl Acids Res.1611380)、nos终止子(Depicker A，Stachel S，Dhaese P，Zambryski P，Goodman HM.Nopaline synthasetranscript mapping and DNA sequence.J Mol Appl Genet.1982；1(6)561-73)或ocs终止子(Gielen，J，deBeuckeleer，M，Seurinck，J，Debroek，H，de Greve，H，Lemmers，M，vanMontagu，M，Schell，J(1984)The complete sequence of the TL-DNA of theAgrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5.EMBO J.3835-846)。
此外还可以进行操作，以提供适当的限制性切割位点，或删除冗余DNA或限制性切割位点。可能进行插入、缺失或替换(如转换和颠换)时，可以使用如体外诱变、引物修补、限制性酶切或连接的方法。
通过适当的操作(如限制性酶切、回嚼(chewing back)或将突出端填补成平端)，可提供进行连接的片段互补末端。
优选的多腺苷酸化信号是植物多腺苷酸化信号，优选那些基本上与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)来源的T-DNA多腺苷酸化信号对应的信号，特别是Ti质粒pTiACH5(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835 ff)的T-DNA(章鱼碱合成酶)基因3的多腺苷酸化信号或其功能等价物。
将外源基因转移进植物基因组称为转化。
为此，可以使用已知的转化和从植物组织或植物细胞再生植物的方法，以进行瞬时或稳定转化。
适于转化植物的方法有通过聚乙二醇诱导DNA摄取的原生质体转化、使用基因枪的生物轰击法——“粒子轰击”法、电穿孔、在含有DNA的溶液中孵育干胚、显微注射及上文所述农杆菌介导的基因转移。所述方法描述于例如B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，《Transgenic Plants》，卷1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，AcademicPress(1993)，128-143和Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225。
优选将要表达的构建体克隆入适于转化根癌农杆菌的载体，如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)，或特别优选pSUN2、pSUN3、pSUN4或pSUN5(WO 02/00900)。
用表达质粒转化的农杆菌可以通过已知的方式用于转化植物，例如在农杆菌溶液中浸浴损伤的叶子或叶子的碎片，并随后培养在适当的培养基中。
为了优选制备遗传修饰的植物(下文也称为转基因植物)，将融合表达盒克隆入适于在根癌农杆菌中转化的载体，如pBin19，或特别是pSUN5和pSUN3。此后将通过已知方式将这种载体转化的农杆菌用于转化植物(特别是农作物)，例如，通过在农杆菌溶液中浸浴损伤的叶子或叶子的碎片，并随后在适当的培养基中培养。
利用农杆菌进行植物转化特别公开于F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；《Transgenic Plants》，卷1中“Engineering andUtilization”，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，15-38页。可以通过已知的方式从损伤的叶子或叶片段的转化细胞进行转基因植物再生，所述转基因植物含有整合入表达盒的一个或多个基因。
为了用一个或多个本发明的作用基因转化宿主植物，将表达盒插入其DNA中含有额外功能调节信号(如用于复制或整合的序列)的重组载体。合适的载体特别描述于《Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology》(CRC Press)，6/7章，71-119页(1993)。
使用上文引用的重组和克隆技术，可以将表达盒克隆进能够在如大肠杆菌中复制的适当载体中。合适的克隆载体有例如pJIT117(Guerineau等(1988)Nucl.Acids Res.1611380)、pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。特别合适的是能够在大肠杆菌和农杆菌中复制的二元载体。
以下将通过实施例更为详细地描述本发明中遗传修饰微生物的产生，所述遗传修饰的微生物具有增加的或造成的酮酶活性，以及增加的或造成的β环化酶活性(其修饰的β环化酶活性是由于该β环化酶含有SEQ IDNO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性)。
其他活性，如羟化酶活性、HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性和/或MinD活性，可以通过使用相应的作用基因得到类似的增加。
优选将上述编码酮酶、β-羟化酶或β环化酶的核酸，以及编码HMG-CoA还原酶的核酸、编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸、编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸、编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸、编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码八氢番茄红素合酶的核酸、编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸、编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸、编码crtISO蛋白的核酸、编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白的核酸插入表达构建体及载体中，其中所述构建体含有处在调节性核酸序列遗传控制下的编码本发明中酶的核酸序列，所述载体至少含有一个这类表达构建体。
优选本发明的这类构建体含有，位于特定编码序列5’上游端的启动子和3’端下游的终止子序列，并在适当时还含有每种情况下与作用基因有效连接的其它常规调节元件。“有效连接”指的是启动子、编码序列、终止子及适当时其它调节元件以各调节元件能够在编码序列的表达中发挥其预期功能的方式依次排列。
有效连接的序列的实例有靶向序列和翻译增强子、增强子、多腺苷酸化信号等等。其它的调节元件包括选择性标记、扩增信号、复制起点等等。
除了人工调节序列之外，在实际的作用基因前仍可以存在天然的调节序列。通过遗传修饰可在需要时关闭这一天然调节作用，并增加或降低基因的表达。然而基因构建体也可以具有更简单的结构，即在结构基因的前面没有插入额外的调节信号，也没有除去天然启动子及其调节作用。反之则可以突变天然的调节序列使其不再产生调节作用，从而增加或降低基因表达。基因构建体中可以具有一个或多个拷贝的此类核酸序列。
可以使用的微生物启动子有例如在革兰氏阴性细菌中优先使用的cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc、ara-、SP6-、λ-PR-或λ-PL-启动子，及革兰氏阳性启动子amy和SPO2或酵母启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH。特别优选使用可诱导的启动子，如光、特别是温度诱导的启动子(如PrPl启动子)。
原则上可以使用所有天然的启动子及其调节序列。此外，也可以有利地使用合成的启动子。
所述调节序列可使核酸序列的选择性表达及蛋白质的表达成为可能。这可能意味着(例如取决于宿主生物的不同)基因只在诱导后表达或过表达，或是立即表达和/或过表达。
既然如此，可优选调节序列或因子使其正面影响表达，从而增加或降低之。因此，通过使用如启动子和/或增强子之类的强转录信号，可以在转录水平上有利的实现调节元件的增强作用。然而，也可以例如通过提高mRNA的稳定性，增强翻译。
通过将适当的启动子与以上描述的编码酮酶、β-羟化酶、β环化酶、HMG-CoA还原酶、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶、牻牛儿基二磷酸酯合酶、法呢基二磷酸酯合酶、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶、ζ-胡萝卜素去饱和酶、crtISO蛋白质、FtsZ蛋白质和/或MinD蛋白质的核酸序列，以及终止子或多腺苷酸化信号融合以产生表达盒。为此可使用如描述于T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，《Molecular CloningA LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等，《Current Protocols in Molecular Biology》，GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)的常规重组和克隆技术。
为了在合适的宿主生物中表达，将重组核酸构建体或基因构建体有利的插入能使基因在宿主中最佳表达的宿主特异性载体。载体是本领域技术人员所熟知的，并可见于如《Cloning Vectors》(Pouwels P.H.等，编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)。载体不仅指质粒，也指本领域技术人员已知的所有其它载体，如噬菌体、病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒)、转座子、IS元件、质粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或随染色体复制。
可以提及的合适的表达载体的实例为常规融合表达载体，如pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT 5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中重组目的蛋白质分别与谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白和A蛋白融合。
非融合蛋白表达载体，如pTrc(Amann等，(1988)Gene 69301-315)和pET 11d(Studier等Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)，或pBluescript及pUC载体。
用于在酿酒酵母中表达的酵母表达载体，如pYepSecl(Baldari等，(1987)Embo J.6229-234)、pMFα(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。
适合用于其它真菌(如丝状真菌)的载体以及构建载体的方法包括，van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)″Gene transfer systemsand vector development for filamentous fungi″，《Applied MolecularGenetics of Fungi》，J.F.Peberdy等编辑，1-28页，Cambridge UniversityPressCambridge中详细描述的载体和方法。
可用于在培养的昆虫细胞(如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体，包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
其它合适的原核和真核细胞表达系统描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，《Molecular cloningA Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N Y，1989的第16和17章。
借助于本发明的表达构建体或载体，可以利用如至少一种本发明的载体进行转化，制备遗传修饰的生物。
将上述的本发明重组构建体有利的引入合适的宿主系统，并加以表达。这一步中，优选使用本领域技术人员熟悉的克隆和转染方法(如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等)，以在特定表达系统中表达所述核酸。合适的系统如《Current Protocols in Molecular Biology》，F.Ausub等编辑，Wiley Interscience，New York 1997中所述。
可以通过同样存在于载体或表达盒中的标记基因来挑选成功转化的生物。这类标记基因的实例如抗生素耐药基因及催化成色反应(使转化细胞染色)的酶基因。然后可以通过自动细胞分选进行选择。
可以通过含有适当抗生素的培养基或营养培养基来选择被载体成功转化的微生物，所述载体具有适当抗生素耐药基因(如G418或潮霉素)。存在于细胞表面的标记蛋白质可用于亲和层析法进行选择。
宿主生物与适用于该生物的载体(如质粒、病毒或噬菌体，如具有RNA聚合酶/启动子系统的质粒、噬菌体8或其它温和噬菌体或转座子)和/或其它有利的调节序列的组合形成了表达系统。
本发明还涉及遗传修饰的非人生物，其中该遗传修饰A对于已经具有酮酶活性的野生型生物，与野生型相比增加其酮酶活性，且
B对于不具有酮酶活性的野生型生物，与野生型相比造成酮酶活性，且其中该遗传修饰C对于已经具有β环化酶活性的野生型生物，与野生型相比增加其β环化酶活性，且D对于不具有β环化酶活性的野生型生物，与野生型相比造成β环化酶活性，而C中增加的β环化酶活性或D中造成的β环化酶活性源于以下β环化酶，该β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
如上所述，优选通过提高编码酮酶的核酸的基因表达，以相对于野生型增加(A中)或造成(B中)酮酶活性。
在另一个优选实施方案中，通过将编码酮酶的核酸引入生物，提高编码酮酶的核酸的基因表达。
该实施方案中，与野生型相比，本发明的转基因生物中至少还存在一个酮酶基因。该实施方案中，本发明的遗传修饰的生物优选具有至少一个编码酮酶的外源(＝异源)核酸，或具有至少两个编码酮酶的内源核酸。
为此，原则上可以使用任何酮酶基因，即编码酮酶的任何核酸。
优选的编码酮酶的核酸如上面本发明方法所述。
如上所述，优选通过相对于野生型提高编码β环化酶的核酸的基因表达，以增加或造成β环化酶活性，所述β环化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
在优选实施方案中，通过向生物中插入至少一个编码β环化酶的核酸，提高编码β环化酶的核酸的基因表达，所述β环化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
该实施方案中，与野生型相比，本发明的转基因生物中至少还存在一个β环化酶基因。该实施方案中，本发明的遗传修饰的生物优选具有至少一个编码β环化酶的外源(＝异源)核酸，或具有至少两个编码β环化酶的内源核酸。
为此，原则上可以使用任何β环化酶基因，即编码β环化酶的任何核酸，所述β环化酶中含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
优选的β环化酶如上所述。
如上所述，特别优选的遗传修饰生物还具有相对于野生型生物增加或造成的羟化酶活性。其他优选实施方案如上面本发明方法所述。
此外，如上所述，特别优选的遗传修饰的非人生物相对于野生型还具有选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性及MinD活性中至少一种增加的活性。其他优选实施方案如上面本发明方法所述。
本发明的生物优选指野生型或起始生物可天然产生或能够通过遗传互补和/或代谢途径的再调节生产类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素和/或玉米黄质和/或新叶黄素和/或紫黄质和/或叶黄素的生物。
其他优选的生物，野生型或起始生物已经具有羟化酶的活性，因此其野生型或起始生物即能产生玉米黄质。
优选生物为植物或微生物，例如，细菌、酵母、藻类或真菌。
使用的细菌可以是由于插入生产类胡萝卜素的生物的类胡萝卜素生物合成基因而能合成叶黄素的细菌(例如含有例如欧文氏菌来源的crt基因的埃希氏杆菌属细菌)，以及自身即能够合成叶黄素的细菌(如欧文氏菌属、农杆菌属、黄杆菌属、产碱菌属、副球菌属、念珠藻属的细菌或集胞藻属的蓝细菌)。
优选的细菌为大肠杆菌、草生欧文氏菌、噬夏孢欧文氏菌、橙黄农杆菌、产碱菌属种PC-1、黄杆菌属种R1534菌株、集胞藻属蓝细菌PCC6803、Paracoccus marcusii或Paracoccus carotinifaciens。
优选的酵母为假丝酵母、酵母、汉逊酵母、毕赤酵母)或法夫酵母。特别优选的酵母为Xanthopyvllomyces dendrorhous或Phaffia rhodozyma。
优选的真菌为曲霉、木霉、阿舒囊霉、脉孢菌、布拉霉(特别是Blakesleatrispora)、须霉、镰孢霉或如Indian Chem.Engr.B部分卷37，No.1，2(1995)15页表6中描述的其它真菌。
优选的藻类有绿藻，如红球藻属、三角褐指藻、团藻属或杜氏藻属的藻类。特别优选的藻类有雨生红球藻或杜氏藻属巴德成藻。
其它可用于实施本发明方法的微生物及其生产，公开于如，此处引用作为参考的DE-A-19916140。
特别优选的植物选自苋科、石蒜科、夹竹桃科、紫菀科、凤仙花科、秋海棠科、小檗科、十字花科、大麻科、忍冬科、石竹科、藜科、菊科、葫芦科、十字花科、大戟属、豆科、龙胆科、牻牛儿苗科、禾本科、Illiaceae、唇形科、薄荷科、豆科、百合科、亚麻科、山梗菜属、锦葵科、木犀科、兰科、罂粟科、白花丹科、禾本科、花荵科、报春花科、毛茛科、蔷薇科、茜草科、玄参科、茄科、旱金莲科、伞状花科、毛蕊花科、葡萄科及紫罗兰科。
极其优选的植物选自万寿菊属、万寿菊、孔雀草、金合欢属、乌头属、侧金盏花属、阿尼菊属、耧斗菜属、紫菀属、黄芪属、紫葳属、金盏花属、驴蹄草属、风铃草属、美人蕉属、矢车菊属、桂竹香属、苘蒿属、柑桔属、还阳参属、番红花属、南瓜属、金雀儿属、Delonia属、翠雀属、石竹属、康乃馨属、多榔菊属、花菱草属、连翘属、Fremontia属、勋章菊属、钩吻属、染料木属、龙胆属、老鹳草属、非洲菊属、路边青属、银桦属、堆心菊属、向日葵属、细辛属、独活属、木槿属、赛菊芋属、金丝桃属、黄金菊属、凤仙花属、鸢尾属、蓝花楹属、棣堂属、毒豆属、山黧豆属、猫耳草属、百合属、亚麻属、百脉根属、番茄属、珍珠菜属、Maraia属、苜蓿属、沟酸浆属、水仙属、月见草属、木犀属、碧冬茄属、石楠属、酸浆属、牧根草属、委陵草属、火棘属、毛茛属、杜鹃花属、蔷薇属、金光菊属、千里光属、蝇子草属、松香草属、Sinapsis属、花楸属、鹰爪豆属、黄钟花属、蝴蝶草属、婆罗们参属、金莲花属、旱金莲属、郁金香属、款冬属、荆豆属、堇菜属或百日草属植物，特别优选万寿菊属、万寿菊、孔雀草、番茄属、蔷薇属、金盏花属、酸浆属、苜蓿属、向日葵属、苘蒿属、紫菀属、郁金香属、水仙属、碧冬茄属、老鹳草属、旱金莲属或侧金盏花属植物之一。
极其特别优选的遗传修饰的植物选自万寿菊属、万寿菊、孔雀草、侧金盏花属、番茄属、蔷薇属、金盏花属、酸浆属、苜蓿属、向日葵属、茼蒿属、紫菀属、郁金香属、水仙属、碧冬茄属、老鹳草属或旱金莲属，遗传修饰的植物含有至少一个编码酮酶的转基因核酸。
本发明还涉及转基因植物、其繁殖物质以及其植物细胞、组织或部分，特别是其果实、种子、花及花瓣。
如上所述，遗传修饰的植物可用于产生酮类胡萝卜素，特别是虾青素。
可以被人或动物食用的的本发明遗传修饰生物，特别是植物或植物的部分(例如特别是酮类胡萝卜素(特别是虾青素)含量增加的花瓣)，也可以直接或经过已知的方式加工后用作食品和饲料或食品和饲料的添加剂。
此外，遗传修饰生物也可以用于制备含有酮类胡萝卜素的生物提取物和/或制备食品和饲料添加剂。
与野生型相比，遗传修饰生物的酮类胡萝卜素含量增加。
酮类胡萝卜素含量的增加通常指酮类胡萝卜素总含量的增加。
然而，酮类胡萝卜素含量的增加也特别指优选的酮类胡萝卜素含量的改变，而总的类胡萝卜素含量不一定增加。
在特别优选的实施方案中，相对于野生型，本发明遗传修饰的植物的虾青素含量增加。
在这种情况下，增加的含量也指造成的酮类胡萝卜素(如虾青素)的含量。
通过以下的实施例(但并不仅限于此)对本发明进行说明。
一般实验条件重组DNA序列分析根据Sanger的方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467)，利用Licor激光荧光DNA测序仪(MWG Biotech，Ebersbach所售)对重组DNA分子测序。
实施例1扩增念珠藻属PCC 7120来源的编码NOST酮酶的完整一级序列DNA通过PCR从念珠藻属PCC 7120(″Pasteur Culture Collection ofCyanobacterium″菌株)中扩增编码念珠藻属PCC 7120的NOST酮酶DNA。
为了从念珠藻属PCC 7120悬浮培养物制备基因组DNA，将细胞离心收集，冷冻于液氮，并在研钵中碾磨成粉。所述悬浮培养物在25℃、连续光照且恒定振荡(150rpm)条件下于BG 11培养基(1.5g/l NaNO3、0.04g/lK2PO4×3H2O、0.075g/l MgSO4×H2O、0.036g/l CaCl2×2H2O、0.006g/l柠檬酸、0.006g/l柠檬酸铁铵、0.001g/l EDTA二钠镁、0.04g/l Na2CO3、1ml痕量金属混合物A5+Co(2.86g/l H3BO3、1.81g/l MnCl2×4H2O、0.222g/lZnSO4×7H2O、0.39g/l NaMoO4×2H2O、0.079g/l CuSO4×5H2O、0.0494g/lCo(NO3)2×6H2O))中生长1周。
从念珠藻PCC 7120中分离DNA的方法在8000rpm离心10分钟，从10ml液体培养物中沉淀细菌细胞。然后用研钵在液氮中粉碎并碾磨细胞。将细胞材料重悬浮于1ml 10mM TrisHCl(pH 7.5)，并转移至Eppendorf反应试管(容积2ml)内。加入100μl蛋白酶K(浓度20mg/ml)后，将细胞悬浮液在37℃孵育3小时。随后用500μl苯酚抽提悬浮液。在13000rpm离心5分钟后，将上层水相转移到新的2ml Eppendorf反应试管中。用苯酚反复抽提3次。加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和0.6体积的异丙醇沉淀DNA，然后用70％的乙醇洗涤。在室温干燥DNA沉淀，加入25μl水，并加热至65℃溶解。
通过聚合酶链式反应(PCR)，使用正义特异引物(NOSTF，SEQ ID NO79)和反义特异引物(NOSTG SEQ ID NO80)从念珠藻属PCC 7120中扩增编码念珠藻属PCC 7120酮酶的核酸。
使用的PCR条件如下在50μl反应混合物中用PCR扩增编码由完整一级序列组成的酮酶蛋白质的DNA，所述混合物含有-1μl念珠藻属PCC 7120 DNA(如上述制备)-0.25mM dNTP-0.2mM NOSTF(SEQ ID NO.79)-0.2mM NOSTG(SEQ ID NO80)-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8μl蒸馏水在以下循环条件下进行PCR1X94℃ 2分钟35X 94℃ 1分钟55℃ 1分钟72℃ 3分钟1X72℃ 10分钟利用SEQ ID NO.79和SEQ ID NO80进行PCR扩增产生了805bp的片段，所述片段编码由完整一级序列组成的蛋白质(SEQ ID NO81)。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pGEM-T(Promega)，获得pNOSTF-G克隆。
使用M 13F和M 13R引物对pNOSTF-G克隆的测序确证了与数据库条目AP003592的88,886-89,662之DNA序列一致的序列。此核苷酸序列在独立的扩增实验中可以重复，因此代表使用的念珠藻属PCC 7120中的核苷酸序列。
因此，该pNOSTF-G克隆被用于克隆进表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。通过从pNOSTF-G分离799bp SphI片段并连接进SphI切割的pJIT117载体，完成这一克隆。以正确方向含有念珠藻属PCC 7120酮酶的克隆被称为pJNOST，其中酮酶的N-末端与rbcS转运肽翻译融合。
实施例2构建质粒pMCL-CrtYIBZ/idi/gps，用于在大肠杆菌中合成玉米黄质。
经中间体pMCL-CrtYIBZ和pMCL-CrtYIBZ/idi，通过3个步骤构建pMCL-CrtYIBZ/idi/gps。使用的载体是与高拷贝数载体相容的pMCL200质粒(Nakano，Y.，Yoshida，Y.，Yamashita，Y.和Koga，T.；Construction of a series of pACYC-derived plasmid vectors；Gene 162(1995)，157-158)。
实施例2.1构建pMCL-CrtYIBZ生物合成基因crtY、crtB、crtI和crtZ来自噬夏孢欧文氏菌，并通过PCR方法扩增。噬夏孢欧文氏菌(DSM 30080)的基因组DNA由GermanCollection of Microorganisms and Cell Culture(DSMZ，Brunswick，Germany)作为提供的服务而制备。根据制造商提供的详细信息进行PCR(Roche，Long Template PCRProcedure for amplification of 5-20kbtargets with the expand long template PCR system)。扩增噬夏孢欧文氏菌生物合成簇的PCR条件如下Master Mix 1-1.75μl dNTP(终浓度350μM)-0.3μM引物Crt1(SEQ ID NO82)-0.3μM引物Crt2(SEQ ID NO83)-250-500ng DSM 30080基因组DNA
加蒸馏水至总体积50μlMaster Mix 2-5μl 10x PCR缓冲液1(终浓度1x，含1.75mM Mg2+)-10x PCR缓冲液2(终浓度1x，含2.25mM Mg2+)-10x PCR缓冲液3(终浓度1x，含2.25mM Mg2+)-0.75μl Expand Long Template Enzyme Mix(终浓度2.6单位)加蒸馏水至总体积50μl用移液器将两种混合物“Master Mix 1”和“Master Mix 2”混合。在50μl总体积中以如下循环条件进行PCR1X 94℃ 两分钟30X 94℃ 30秒58℃ 1分钟68℃ 4分钟1X 72℃ 10分钟使用SEQ ID NO82和SEQ ID NO83进行PCR扩增产生了编码基因CrtY(蛋白质SEQ ID NO85)、CrtI(蛋白质SET NID NO.86)、crtB(蛋白质SEQ ID NO87)和CrtZ(iDNA)的片段(SEQ ID NO84)。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pCR2.1(Invitrogen)，获得pCR2.1-CrtYIBZ克隆。
用SalI和HindIII切割pCR2.1-CrtYIBZ质粒，分离所产生的SalI/HindIII片段，并通过连接将其转移进SalI/HindIII切割的pMCL200载体。克隆入pMCL 200的pCR2.1-CrtYIBZ SalI/HindIII片段长度为4624bp，编码CrtY、CrtI、crtB和CrtZ基因，对应D90087中2295位点到6918位点的序列(SEQ ID NO84)。通过CrtZ基因内源性启动子，逆CrtY、CrtI和CrtB基因的阅读框方向转录该基因。产生的克隆被称为pMCL-CrtYIBZ。
实施例2.2构建pMCL-CrtYIBZ/idi
通过PCR方法从大肠杆菌中扩增idi(异戊烯二磷酸异构酶；IPP异构酶)基因。使用正义特异引物(5′-idi SEQ ID NO88)和反义特异引物(3′-idi SEQ ID NO89)，通过聚合酶链式反应(PCR)，从大肠杆菌中扩增包含idi启动子和核糖体结合位点的编码完整idi基因的核酸。
PCR条件如下扩增DNA的PCR在50μl反应混合物中进行，其中含有-1μl大肠杆菌TOP10悬浮液-0.25mM dNTP-0.2mM 5′-idi(SEQ ID NO88)-0.2mM 3′-idi(SEQ ID NO89)-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸馏水以下循环条件中进行PCR1X94℃ 2分钟20X 94℃ 1分钟62℃ 1分钟72℃ 1分钟1X72℃ 10分钟利用SEQ ID NO88和SEQ ID NO89进行PCR扩增产生679bp的片段，该片段编码由完整一级序列(SEQ ID NO90)组成的蛋白质。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pCR2.1(Invitrogen)，获得pCR2.1-idi克隆。
对pCR2.1-idi克隆的测序确证了与发表的AE000372序列8774到9440位置无异的序列。这一区域包括启动子区域、可能的核糖体结合位点和完整的IPP异构酶开放阅读框。由于在idi基因的5，端插入了XhoI切割位点、3’端插入了SalI切割位点，克隆进pCR2.1-idi的片段总长为679bp。
因此，使用该克隆将idi基因克隆进pMCL-CrtYIBZ载体。通过从pCR2.1-idi分离XhoI/SalI片段并连接进XhoI/SalI切割的pMCL-CrtYIBZ载体完成这一克隆。产生的克隆被称为pMCL-CrtYIBZ/idi。
实施例2.3.构建pMCL-CrtYIBZ/idi/gps通过PCR方法从嗜超高温硫酸根还原古细菌(Archaeglobus fulgidus)中扩增gps(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶；GGPP合酶)基因。使用正义特异引物(5′-gps SEQ ID NO92)和反义特异引物(5′-gps SEQ ID NO93)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增嗜超高温硫酸根还原古细菌gps基因。
嗜超高温硫酸根还原古细菌DNA由German Collection ofMicroorganisms and Cell Culture(DSMZ，Brunswick，Germany)作为提供的服务而制备。PCR条件如下在50μl反应混合物中用PCR扩增编码由完整一级序列组成的GGPP合酶蛋白质的DNA，所述混合物含有-1μl嗜超高温硫酸根还原古细菌DNA-0.25mM dNTP-0.2mM 5′-gps(SEQ ID NO92)-0.2mM 3′-gps(SEQ ID NO93)-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸馏水在以下循环条件进行PCR1X 94℃ 2分钟20X94℃ 1分钟56℃ 1分钟72℃ 1分钟1X 72℃ 10分钟用已知方法从琼脂糖凝胶中洗脱利用PCR和SEQ ID NO92及SEQID NO93引物扩增的DNA片段，并用限制酶NcoI和HindIII切割之。由此产生编码由完整一级序列(SEQ ID NO94)组成蛋白质的962bp片段。使用标准方法，将NcoI/HindIII切割的扩增子克隆进pCB97-30载体，获得pCB-gps克隆。
对pCB-gps克隆的测序确证了与发表的AF120272序列有一个核苷酸差异的A.fulgidus GGPP合酶序列。在gps基因中引入一个NcoI切割位点，改变GGPP合酶的第二个密码子。在发表的AF120272序列中，CTG(4-6位点)编码亮氨酸。使用SEQ ID NO92和SEQ ID NO93两种引物的扩增将此第二密码子改变为编码缬氨酸的GTG。
因此，使用pCB-gps克隆将gps基因克隆进pMCL-CrtYIBZ/idi载体。通过从pCB-gps中分离KpnI/XhoI片段并连接进用KpnI和XhoI切割的pMCL-CrtYIBZ/idi载体完成这一克隆。克隆的KpnI/XhoI片段(SEQ IDNO94)带有Prrn 16启动子和rbcL的最小5’UTR序列、延伸GGPP合酶N末端的前6个rbcL密码子和gps基因3’端的psbA序列。因此该GGPP合酶的N末端具有改变的氨基酸序列Met-Thr-Pro-Gln-Thr-Ala-Met-Val-Lys-Glu，而不是天然氨基酸序列Met-Leu-Lys-Glu(AF120272的1到4位氨基酸)。这使得重组GGPP合酶从位点3(在AF120272中)的Lys开始在氨基酸序列上具有同一性，并且没有更多改变。参考Eibl等(Plant J.19.(1999)，1-13)使用rbcL和psbA序列。产生的克隆被称为pMCL-CrtYIBZ/idi/gps。
实施例3在重组大肠杆菌菌株中生物转化玉米黄质为进行玉米黄质的生物转化，通过异源互补制备能产生玉米黄质的重组大肠杆菌菌株。大肠杆菌TOP10菌株作为宿主细胞，用于用质粒pNOSTF-G和pMCL-CrtYIBZ/idi/gps的互补实验。
为了制备可合成高浓度玉米黄质的大肠杆菌菌株，构建pMCL-CrtYIBZ/idi/gps质粒。该质粒带有噬夏孢欧文氏菌的生物合成基因crtY、crtB、crtI和crtY、嗜超高温硫酸根还原古细菌的gps(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶)基因和大肠杆菌idi(异戊烯二磷酸异构酶)基因。该构建体解除了类胡萝卜素以及其生物合成前体大量聚积的限速步骤。这一点已由Wang等之前使用若干质粒以相似的方式描述(Wang，C.-W.，Oh，M.-K.和Liao，J.C.；Engineered isoprenoid pathway enhances astaxanthinproduction in Escherichia coli，Biotechnology and Bioengineering 62(1999)，235-241)。
使用pNOSTF-G和pMCL-CrtYIBZ/idi/gps两种质粒，以已知的方式转化大肠杆菌TOP 10培养物，并在30℃或37℃的LB培养基培养过夜。同样通过已知的方式加入氨苄青霉素(50μg/ml)、氯霉素(50μg/ml)和异丙基-β-硫代半乳糖苷(1mmol)培养过夜。
为从重组菌株中分离类胡萝卜素，用丙酮抽提细胞，将有机溶剂蒸干，并通过HPLC方法在C30柱上分离类胡萝卜素。条件设置如下。
分离柱Prontosil C30柱、250×4.6mm(Bischoff，Leonberg)流速1.0ml/min洗脱液洗脱液A-100％甲醇洗脱液B-80％甲醇、0.2％醋酸胺洗脱液C-100％叔丁基甲基醚梯度曲线

检测300-500nm使用光(电)二极管矩阵检测器直接从洗脱峰检测光谱。
通过与标准样品比较吸收光谱和保留时间，鉴定分离的物质。
实施例4与先前的实施例类似，制备表达雨生红球藻Flotow em.Wille来源的酮酶大肠杆菌菌株。为此，扩增编码雨生红球藻Flotow em.Wille酮酶完整一级序列的cDNA，并将此cDNA克隆进与实施例1相同的表达载体中。
通过对雨生红球藻(″Collection of algal cultures of the University ofG_ttingen″的192.80菌株)悬浮培养物进行PCR，扩增编码雨生红球藻酮酶的cDNA。为了从雨生红球藻(192.80菌株)悬浮培养物中制备总RNA，收集细胞，在液氮中冷冻，并在研钵中碾磨成粉，所述悬浮培养物在室温间接日光条件下于红球藻培养基(1.2g/l醋酸钠、2g/l酵母提取物、0.2g/lMgCl2×6H2O、0.02CaCl2×2H2O；pH 6.8；高压灭菌后加入400mg/l L-天冬酰胺、10mg/1FeSO4×H2O)中生长两周。随后将100mg冷冻的藻类细胞研磨粉末转移到反应试管内，并加入0.8ml Trizol缓冲液(LifeTechnologies)。用0.2ml氯仿抽提悬浮液。12000g离心15分钟后，将水相上清液转移到新的反应试管内，并用一体积的乙醇抽提。用一体积异丙醇沉淀RNA，用75％的乙醇洗涤并将沉淀溶解于DEPC水(用1/1000体积焦碳酸二乙酯水在室温孵育过夜，然后高压灭菌)。通过分光光度法测定RNA浓度。
为合成cDNA，将2.5μg总RNA在60℃变性10分钟，冰上冷却2分钟，并按照制造商说明，使用反义特异引物PR1(gcaagctcga cagctacaaa cc)，通过cDNA试剂盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)转录成cDNA。
利用正义特异引物PR2(gaagcatgca gctagcagcgacag)和反义特异引物PR1，对雨生红球藻进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增编码雨生红球藻(192.80菌株)酮酶的核酸。
PCR条件如下在50μl反应混合物中用PCR扩增编码由完整一级序列组成的酮酶蛋白质的DNA，所述混合物含有-4ml雨生红球藻cDNA(如上述制备)-0.25mM dNTP-0.2mM PR1-0.2mM PR2-5ml 10X PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8ml蒸馏水在以下循环条件进行PCR1X 94℃ 2分钟35X94℃ 1分钟53℃ 2分钟72℃ 3分钟1X 72℃ 10分钟利用PR1和PR2进行PCR扩增产生编码由完整一级序列组成蛋白质的1155bp片段gaagcatgca gctagcagcg acagtaatgt tggagcagct taccggaagc gctgaggcac 60tcaaggagaa ggagaaggag gttgcaggca gctctgacgt gttgcgtaca tgggcgaccc120agtactcgct tccgtcagag gagtcagacg cggcccgccc gggactgaag aatgcctaca180agccaccacc ttccgacaca aagggcatca caatggcgct agctgtcatc ggctcctggg240ccgcagtgtt cctccacgcc atttttcaaa tcaagcttcc gacctccttg gaccagctgc300actggctgcc cgtgtcagat gccacagctc agctggttag cggcagcagc agcctgctgc360acatcgtcgt agtattcttt gtcctggagt tcctgtacac aggccttttt atcaccacgc420atgatgctat ccatggcacc atcgccatga gaaacaggca gcttaatgac ttcttgggca480gagtatgcat ctccttgtac gcctggtttg attacaacat gctgcaccgc aagcattggg540agcaccacaa ccacactggc gaggtgggca aggaccctga cttccacagg ggaaaccctg600gcattgtgcc ctggtttgcc agcttcatgt ccagctacat gtcgatgtgg cagtttgcgc660gcctcgcatg gtggacggtg gtcatgcagc tgctgggtgc gccaatggcg aacctgctgg720tgttcatggc ggccgcgccc atcctgtccg ccttccgctt gttctacttt ggcacgtaca780tgccccacaa gcctgagcct ggcgccgcgt caggctcttc accagccgtc atgaactggt840ggaagtcgcg cactagccag gcgtccgacc tggtcagctt tctgacctgc taccacttcg900acctgcactg ggagcaccac cgctggccct ttgccccctg gtgggagctg cccaactgcc960gccgcctgtc tggccgaggt ctggttcctg cctagctgga cacactgcag tgggccctgc 1020tgccagctgg gcatgcaggt tgtggcagga ctgggtgagg tgaaaagctg caggcgctgc 1080tgccggacac gctgcatggg ctaccctgtg tagctgccgc cactagggga gggggtttgt 1140agctgtcgag cttgc使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pGEM-Teasy(Promega)，获得pGKETO2克隆。
表10

表10中的数据表明，当3种整合酶中的每种整合酶与IHF和切除酶递送时，它都介导植物染色质中的分子内L/R重组。
VI.烟草中的定向整合A.利用农杆菌介导的转化递送的供体序列和Int1.阳性对照双元载体的构建实施例72用整合酶体外处理质粒CMPSVLucB/P以形成CMPSVLucIntronAttL，一种含有具有attL位点的内含子的阳性对照萤光素酶构建体利用来源于Gateway克隆试剂盒(Invitrogen)的酶和缓冲液，将约300ng质粒VCMLucB/P(2μl)与10μl水，4μl BP缓冲液和4μl BP克隆酶混合，并且在25℃温育1.5小时。用一半反应混合物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α。通过用Asp718I和BglII消化小量制备物鉴定分子内反应产物CMPSVLucIntronAttL。
2.靶序列的构建在这里所述的示例性构建体中，用于将靶序列插入到烟草中的质粒<p>从点形念珠藻ATCC 29133中分离DNA的方法在8000rpm离心10分钟，从10ml液体培养物中沉淀细菌细胞。然后用研钵在液氮中粉碎并碾磨细菌细胞。将细胞材料重悬浮于1ml 10mMTris HCI(pH7.5)，并转移至Eppendorf反应试管(容积2ml)。加入100μl蛋白酶K(浓度20mg/ml)后，将细胞悬浮液在37℃孵育3小时。随后用500μl苯酚抽提悬浮液。在13000rpm离心5分钟后，将上层水相转移到新的2ml Eppendorf反应试管中。用苯酚反复抽提3次。加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和0.6体积的异丙醇沉淀DNA，然后用70％的乙醇洗涤。在室温干燥DNA沉淀，加入25μl水，并加热至65℃溶解。
通过聚合酶链式反应(PCR)，使用正义特异引物(NP196-1，SEQ ID NO100)和反义特异引物(NP196-2SEQ ID NO101)从点形念珠藻ATCC29133中扩增编码点形念珠藻ATCC 29133酮酶的核酸。
PCR条件如下在50μl反应混合物中用PCR扩增编码由完整一级序列组成的酮酶蛋白质的DNA，所述混合物含有-1μl点形念珠藻ATCC29133DNA(如上述制备)-0.25mM dNTP-0.2mM NP196-1(SEQ ID NO100)-0.2mM NP196-2(SEQ ID NO101)-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8μl蒸馏水在以下循环条件下进行PCR1X 94℃ 2分钟35X 94℃ 1分钟55℃ 1分钟72℃ 3分钟1X 72℃ 10分钟利用SEQ ID NO100和SEQ ID NO101进行PCR扩增产生792bp的片段，所述片段编码由完整一级序列(NP196，SEQ ID NO102)组成的蛋白质。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pNP196克隆。
使用引物M13F和M13R对pNP196克隆的测序确证了与数据库NZ AABC01000196条目140,571-139,810的DNA序列一致的序列(与发表的数据库条目方向相反)，只是其中140,571位点的G被A取代以产生标准的起始密码子ATG。该核苷酸序列在独立扩增实验中可以重复，因此代表所用的点形念珠藻ATCC 29133中的核苷酸序列。
因此，该pNP196克隆被用于克隆进表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。
用根癌农杆菌Ti质粒pTi15955的OCS终止子(章鱼碱合酶)(数据库条目X00493，12,541-12,350位点，Gielen等(1984)EMBO J.3835-846)替换35S终止子，对pJIT117进行修饰。
使用质粒pHELLSGATE(数据库条目AJ311874，Wesley等(2001)Plant J.27581-590，用标准方法从大肠杆菌中分离)以及引物OCS-1(SEQ ID NO133)和OCS-2(SEQ ID NO134)，通过PCR方法制备含有OCT终止子区域的DNA片段。
PCR条件如下在50μl反应混合物中进行扩增含有章鱼碱合酶(OCS)终止子区域DNA(SEQ ID NO106)的PCR，所述混合物中含有-100ng pHELLSGATE质粒DNA-0.25mM dNTP-0.2mM OCS-1(SEQ ID NO104)-0.2mM OCS-2(SEQ ID NO105)-5μl 10X PCR缓冲液(Stratagene)-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸馏水在以下循环条件下进行PCR1X 94℃ 2分钟35X94℃ 1分钟50℃ 1分钟72℃ 1分钟1X 72℃ 10分钟使用标准方法，将210bp扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pOCS质粒。
对pOCS克隆测序确证了与根癌农杆菌Ti质粒pTi15955(数据库条目X00493)上12,541-12,350位点对应的序列部分。
从pOCS分离210bp的SalI-XhoI片段并将其连入SalI-XhoI切割的pJIT117载体，完成这一克隆。
该克隆被称为pJO，并用于克隆进表达载体pJONP196。
从pNP196分离782bp的SphI片段，并将其连入SphI切割的pJO载体，从而完成克隆。以正确方向含有点形念珠藻NP196酮酶的克隆被称为pJONP196，其中酮酶的N-末端与rbcS转运肽翻译融合。
实施例6制备用于在食用番茄和万寿菊中组成性表达点形念珠藻ATCC 29133来源的NP196酮酶的表达载体食用番茄和万寿菊中点形念珠藻NP196酮酶的表达，是在拟南芥来源的组成型启动子FNR(铁氧还蛋白NADPH氧化还原酶，数据库条目AB011474，70127到69493位；WO 03/006660)控制下进行的。FNR基因起始于69492碱基对，并被命名为“铁氧还蛋白-NADP+还原酶”。使用豌豆转运肽rbcS(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)进行表达。
使用基因组DNA(通过标准方法从拟南芥中分离)及引物FNR-1(SEQID NO107)和FNR-2(SEQ ID NO108)，通过PCR方法制备含有拟南芥FNR启动子区域的DNA片段。
PCR条件如下在50μl反应混合物中进行扩增含有FNR启动子片段FNR的DNA(SEQ ID NO109)的PCR，所述混合物含有-100ng拟南芥基因组DNA-0.25mM dNTP-0.2mM FNR-1(SEQ ID NO107)-0.2mM FNR-2(SEQ ID NO108)-5μl 10X PCR缓冲液(Stratagene)-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸馏水在以下循环条件下进行PCR1X 94℃ 2分钟35X 94℃ 1分钟50℃ 1分钟72℃ 1分钟IX 72℃ 10分钟使用标准方法将652bp扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pFNR质粒。
对pFNR克隆的测序确证了与拟南芥5号染色体上70127到69493位点(数据库条目AB011474)对应的序列片段。
该克隆被称为pFNR，并因此被用于克隆进表达载体pJONP196(如实施例5所述)。
从pFNR分离644bp的SmaI-HindIII片段，并将其连入Ecl136II-HindIII切割的pJONP196载体来完成克隆。含有FNR启动子而非原始d35S启动子且以正确方向含有NP196片段的克隆被称为pJOFNRNP196，所述NP196片段的N-末端与rbcS转运肽融合。
使用二元载体pSUN3(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向食用番茄转化念珠藻NP196酮酶的表达盒。
为制备表达载体MSP105，将来自pJOFNRNP196的1839bpEcoRI-XhoI片段与EcoRI-XhoI切割的pSUN3载体相连。表达载体MSP105含有FNR启动子片段--FNR启动子(635bp)、rbcS TP FRA GMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--编码点形念珠藻NP196酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。
使用二元载体pSUN5(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向万寿菊转化含有点形念珠藻NP196酮酶的表达载体的表达盒。
为制备万寿菊表达载体MSP106，将来自pJOFNR:NP196的1839bp的EcoRI-XhoI片段与EcoRI-XhoI切割的pSUN5载体相连。MSP106含有FNR启动子片段--FNR启动子(635bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--编码点形念珠藻NP196酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。
实施例7制备用于在食用番茄和万寿菊中花特异性表达点形念珠藻ATCC29133来源的NP196酮酶的表达载体使用豌豆rbcS转运肽(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)，在食用番茄和万寿菊中表达点形念珠藻NP196酮酶。该表达在碧冬茄来源的花特异性启动子EPSPS(数据库条目M37029；核苷酸区域7-1787；Benfey等(1990)Plant Cell 2849-856)的控制下进行。
使用基因组DNA(通过标准方法从碧冬茄中分离)及引物EPSPS-1(SEQ ID NO110)和EPSPS-2(SEQ ID NO111)，通过PCR方法制备含有碧冬茄EPSPS启动子区域的DNA片段(SEQ ID NO112)。
PCR条件如下在50μl反应混合物中进行扩增含有EPSPS启动子片段(数据库条目M37029核苷酸区域7-1787)DNA的PCR，所述混合物含有-100ng拟南芥基因组DNA
-0.25mM dNTP-0.2mM EPSPS-1(SEQ ID NO110)-0.2mM EPSPS-2(SEQ ID NO111)-5μl 10X PCR缓冲液(Stratagene)-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸馏水在以下循环条件下进行PCR1X 94℃ 2分钟35X 94℃ 1分钟50℃ 1分钟72℃ 2分钟1X 72℃ 10分钟使用标准方法将1773bp扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pEPSPS质粒。
对pEPSPS克隆的测序确证了与发表的EPSPS序列(数据库条目M37029核苷酸区域7-1787)仅相差两个缺失(M37029序列46-58位点的ctaagtttcagga碱基；M37029序列1422-1429位点的aaaaatat碱基)及碱基置换(T替换M37029序列1447位点的G；A替换M37029序列1525位点的C；A替换M37029序列1627位点的G)的序列。这两个缺失和M37029序列1447及1627位点的两个碱基置换在独立扩增实验中可以重复，因此代表实际所用的碧冬茄植物的核苷酸序列。
因此，pEPSPS克隆被用于克隆进pJONP196表达载体(如实施例5所述)。
通过从pEPSPS分离1763bp的SacI-HindIII片段，并将其连接进SacI-HindIII切割的JONP196载体来完成克隆。含有EPSPS启动子而非原始d35S启动子的克隆被称为pJOESP:NP196。该表达盒以正确方向含有NP196片段，所述片段的N-末端与rbcS转运肽融合。
使用二元载体pSUN3(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向食用番茄转化EPSPS控制的点形念珠藻ATCC 29133 NP196酮酶的表达载体。
为制备表达载体MSP107，将来自pJOESP:NP196的2961KBbpSachI-XhoI片段与SacI-XhoI切割的pSUN3载体相连。表达载体MSP107含有EPSPS片段--EPSPS启动子(1761bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--编码点形念珠藻NP196酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。
使用二元载体pSUN5(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向万寿菊转化EPSPS控制的点形念珠藻NP196酮酶的表达载体。
为制备表达载体MSP108，将来自pJOESP:NP196的2961 KBbp的SachI-XhoI片段与SacI-XhoI切割的pSUN5载体相连。表达载体MSP108含有EPSPS片段--EPSPS启动子(1761bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP196 KETO CDS片段(761bp)--编码点形念珠藻NP196酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。
实施例8扩增编码点形念珠藻ATCC 29133 NP195酮酶完整一级序列的DNA通过PCR方法，从点形念珠藻ATCC 29133(美国典型培养物保藏中心菌株)扩增编码点形念珠藻ATCC 29133 NP195酮酶的DNA。从点形念珠藻ATCC 29133的悬浮培养物中制备基因组DNA已在实施例5中描述。
使用正义特异引物(NP195-1，SEQ ID NO113)和反义特异引物(NP195-2SEQ ID NO114)，通过聚合酶链式反应(PCR)从点形念珠藻ATCC 29133中扩增编码点形念珠藻ATCC 29133酮酶的核酸。
PCR条件如下在50μl反应混合物中用PCR扩增编码由完整一级序列组成的酮酶蛋白质的DNA，所述混合物含有-1μl点形念珠藻ATCC 29133 DNA(如上述制备)
-0.25mM dNTP-0.2mM NP195-1(SEQ ID NO113)-0.2mM NP195-2(SEQ ID NO114)-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8μl蒸馏水在以下循环条件下进行PCR1X 94℃ 2分钟35X 94℃ 1分钟55℃ 1分钟72℃ 3分钟1X 72℃ 10分钟利用SEQ ID NO113和SEQ ID NO114进行PCR扩增产生819bp的片段，所述片段编码由完整一级序列(NP195，SEQ ID NO115)组成的蛋白质。使用标准方法，将扩增子克隆进PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，获得pNP195克隆。
使用M13F和M13R引物对pNP195克隆的测序确证了与数据库NZ AABC010001965条目55,604-56,392的DNA序列一致的序列，只是其中55,604位点的T被A替换以产生标准的起始密码子ATG。该核苷酸序列在独立扩增实验中可以重复，因此代表所用的点形念珠藻ATCC 29133中的核苷酸序列。
因此，该pNP195克隆被用于克隆进表达载体pJO(如实施例5所述)。通过从pNP195分离809bp的SphI片段，并将其连入SphI切割的pJO载体来完成克隆。以正确方向含有点形念珠藻NP195酮酶的克隆被称为pJONP195，其中所述酮酶的N-末端与rbcS转运肽翻译融合。
实施例9制备用于在食用番茄和万寿菊中组成性表达点形念珠藻ATCC 29133来源的NP195酮酶的表达载体食用番茄和万寿菊中点形念珠藻NP195酮酶的表达是在拟南芥来源的组成型启动子FNR(铁氧还蛋白NADPH氧化还原酶，数据库条目AB011474，70127到69493位；WO 03/006660)的控制进行的。FNR基因起始于69492碱基对，并被命名为“铁氧还蛋白-NADP+还原酶”。使用豌豆转运肽rbcS(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)进行表达。
因此，将pFNR克隆(如实施例6所述)用于克隆进表达载体pJONP195(如实施例8所述)。
通过从pFNR分离644bp的Sma-HindIII片段，并将其连入Ecl136II-HindIII切割的pJONP195载体来完成克隆。含有FNR启动子而非原始d35S启动子并以正确方向含有NP195片段的克隆被称为pJOFNR:NP195，所述NP195片段的N-末端与rbcS转运肽融合。
使用二元载体pSUN3(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向食用番茄转化点形念珠藻NP195酮酶的表达盒。
为制备表达载体MSP109，将来自pJOFNR:NP195的1866bpEcoRI-XhoI片段与EcoRI-XhoI切割的pSUN3载体相连。表达载体MSP109含有FNR启动子片段--FNR启动子(635bp)、rbcS TPFRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP195 KETO CDS片段(789bp)--编码点形念珠藻NP195酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。
使用二元载体pSUN5(WO 02/00900)制备用于通过农杆菌介导下向万寿菊转化含有点形念珠藻NP195酮酶的表达载体的表达盒。
为制备MSP110万寿菊表达载体，将来自pJOFNR:NP195的1866bp的EcoRI-XhoI片段与EcoRI-XhoI切割的pSUN5载体相连。表达载体MSP110含有FNR启动子片段--FNR启动子(635bp)、rbcS TPFRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP195KETO CDS片段(789bp)--编码点形念珠藻NP195酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。
实施例10制备用于在食用番茄和万寿菊中花特异性表达点形念珠藻ATCC29133来源的NP195酮酶的表达载体使用豌豆rbcS转运肽(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)在食用番茄和万寿菊中表达点形念珠藻NP195酮酶。该表达在碧冬茄来源的花特异性启动子EPSPS(数据库条目M37029；核苷酸区域7-1787；Benfey等(1990)Plant Cell 2849-856)的控制下进行。
因此，将pEPSPS克隆(如实施例7所述)用于克隆进表达载体pJONP195(如实施例8所述)。
通过从pEPSPS分离1763bp的SacI-HindIII片段，并将其连入SacI-HindIII切割的pJONP195载体来完成克隆。含有EPSPS启动子而非原始d35S启动子的克隆被称为pJOESP:NP195。该表达盒以正确方向含有NP195片段，所述片段的N-末端与rbcS转运肽融合。
使用二元载体pSUN3(WO 02/00900)制备用于通过农杆菌介导下向食用番茄转化EPSPS控制的点形念珠藻ATCC 29133 NP195酮酶的表达载体。
为制备MSP111表达载体，将来自pJOESP:NP195的2988KB bp的SachI-XhoI片段与SacI-XhoI切割的pSUN3载体相连。表达载体MSP111含有EPSPS片段--EPSPS启动子(1761bp)、rbcS TPFRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP195 KETO CDS片段(789bp)--编码点形念珠藻NP195酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。
使用二元载体pSUN5(WO 02/00900)制备用于农杆菌介导下向万寿菊转化EPSPS控制的点形念珠藻NP195酮酶的表达载体。
为制备MSP112表达载体，将来自pJOESP:NP195的2988KBbp的SachI-XhoI片段与SacI-XhoI切割的pSUN5载体相连。表达载体MSP112含有EPSPS片段--EPSPS启动子(1761bp)、rbcS TP FRAGMENT片段--豌豆rbcS转运肽(194bp)、NP195 KETO CDS片段(789bp)--编码点形念珠藻NP195酮酶、OCS终止子片段(192bp)--章鱼碱合酶的多聚腺苷酸化信号。
实施例11制备用于花特异性过量表达食用番茄色素体特异的β-羟化酶的表达盒在矮牵牛的花特异性启动子EPSPS(实施例7)的控制下，进行万寿菊中食用番茄色素体特异的β-羟化酶的表达。使用蚕豆(Vicia faba)来源的LB3为终止子元件。通过分离RNA、反转录和PCR制备色素体特异的β-羟化酶的序列。
为了制备蚕豆LB3终止子序列，按照标准方法从蚕豆组织中分离基因组DNA，并利用引物PR206和PR207对其进行基因组PCR。在50μl反应混合物中进行PCR扩增该LB3DNA片段，所述混合物含有-1μl cDNA(如上述制备)-0.25mM dNTP-0.2μM PR206(SEQ ID NO116)-0.2μM PR207(SEQ ID NO117)-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸馏水利用PR206和PR207进行PCR扩增得到含有LB终止子的0.3kb片段。将扩增子克隆到克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用引物T7和M13测序确证了与序列SEQ ID NO118一致的序列。该克隆被命名为pTA-LB3，并因此用于克隆到载体pJIT117中(见下文)。
从番茄制备总RNA，以制备β-羟化酶序列。为此，将100mg冰冻粉碎的花转移到反应试管中，并加入0.8ml Trizol缓冲液(Life Technologies)。用0.2ml氯仿抽提悬浮液。以12000g离心15分钟后，将水相上清液取出并转移到新反应试管中并用1体积乙醇抽提。用1体积异丙醇沉淀RNA，以75％乙醇洗涤之，并将沉淀溶于DEPC水(水与1/1000体积焦碳酸二乙酯在室温下过夜孵育，然后高压灭菌)中。通过光度法测定RNA浓度。为合成cDNA，将2.5μg总RNA在60℃变性10分钟，冰上冷却2分钟并根据生产商详细说明使用cDNA试剂盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)、利用反义特异引物(PR215 SEQ ID NO119)转录成cDNA。
随后的PCR条件如下在50μl反应混合物中进行PCR扩增编码β-羟化酶的VPR203-PR215DNA片段，所述混合物含有-1μl cDNA(如上述制备)-0.25mM dNTP-0.2μM VPR203(SEQ ID NO120)-0.2μM PR215(SEQ ID NO119)-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸馏水利用VPR203和PR215进行PCR扩增得到编码β-羟化酶的0.9kb片段。将扩增子克隆到克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用引物T7和M13的测序确证了与序列SEQ ID NO121一致的序列。该克隆被命名为pTA-CrtR-b2，并因此用于克隆到载体pCSP02中(见下文)。
使用质粒MSP107(见实施例7)以及引物VPR001和VPR002，通过PCR扩增制备来自矮牵牛的EPSPS启动子序列。在50μl反应混合物中进行PCR扩增该EPSPS DNA片段，所述混合物含有-1μl cDNA(如上述制备)-0.25mM dNTP-0.2μM VPR001(SEQ ID NO122)-0.2μM VPR002(SEQ ID NO123)-5μl 10X PCR缓冲液(TAKARA)
-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸馏水利用 VPR001和PR002进行PCR扩增得到编码EPSPS启动子的1.8kb片段。将扩增子克隆到克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用引物T7和M13的测序确证了与序列SEQ ID NO124一致的序列。该克隆被命名为pTA-EPSPS，并因此用于克隆到载体pCSP03中(见下文)。
从衍生自克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)的pTA-LB3中分离0.3kbPR206-PR207EcoRI-XhoI片段，并与EcoRI-XhoI切割的载体pJIT117连接，进行克隆第一步。该含有0.3kb终止子LB3的克隆被命名为pCSP02。
从衍生自克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)的pTA-CrtR-b2分离0.9kb VPR003-PR215EcoRI-HindIII片段，并与EcoRI-HindIII切割的载体pCSP02连接进行克隆第二步。该含有0.9kbβ-羟化酶片段CrtR-b2的克隆被命名为pCSP03。通过连接，在终止子LB3和β-羟化酶片段CrtR-b2间形成了转录融合。
从衍生自克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)的pTA-EPSPS上分离1.8kb VPR001-VPR002 NcoI-SacI片段，并与NcoI-SacI切割的载体pCSP03连接完成克隆第三步。该含有1.8kb EPSPS启动子片段的克隆被命名为pCSP04。通过连接，在EPSPS启动子和β-羟化酶片段CrtR-b2之间形成了转录融合。pCSP04含有片段EPSPS(1792bp)--EPSPS启动子、片段crtRb2(929bp)--β-羟化酶CrtRb2、LB3片段(301bp)--LB3终止子。
为将该β-羟化酶过量表达盒克隆到用于农杆菌介导下转化万寿菊的表达载体中，以3103bp Ecl136II-XhoI片段分离β-羟化酶盒。通过标准方法(Klenow填补)补平3’末端(30℃，30分钟)。
该表达载体被命名为pCSEbhyd。
实施例12制备用于在启动子P76控制下花特异性表达食用番茄色素体特异的番茄红素β环化酶以及在EPSPS启动子控制下花特异性表达点形念珠藻ATCC 29133酮酶NP196的表达载体通过PCR，以拟南芥基因组DNA为模板分离启动子P76(SEQ ID NO125)。
为此使用寡核苷酸引物P76for(SEQ ID NO126)和P76rev(SEQ IDNO127)。在合成过程中，提供具有5’-磷酸残基的寡核苷酸。
P76for 5’-CCCGGGTGCCAAAGTAACTCTTTAT-3’P76rev 5’-GTCGACAGGTGCATGACCAAGTAAC-3’如已描述的(Galbiati M等，Funct.Integr.Genomics 2000，20125-34)从拟南芥分离基因组DNA。
如下进行PCR扩增80ng基因组DNA1x Expand Long Template PCR缓冲液2.5mM MgCl2dATP、dCTP、dGTP、dTTp各350μM300nM各引物2.5单位Expand Long Template聚合酶终体积为25μl使用下面的温度程序94℃120秒1个循环94℃ 10秒，48℃ 30秒，68℃ 3分钟35个循环68℃ 10分钟1个循环。
通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并通过凝胶洗脱分离1032bp片段。
用限制性内切酶EcoRV消化载体pSUN5，也同样用琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶洗脱回收。
将纯化的PCR产物克隆到如此处理的载体中。
将该构建体命名为p76。对代表拟南芥启动子P76的长为1032bp的片断(SEQ ID NO131)进行测序。
使用限制性内切酶Kpn1和SmaI消化，从pJIT117得到35ST终止子。用琼脂糖凝胶电泳纯化该法所得的969bp片段，并以凝胶洗脱分离。
同样用限制性内切酶Kpn1和SmaI消化载体p76。用琼脂糖凝胶电泳纯化所得的7276bp片段，并以凝胶洗脱分离。
将所得35ST片段克隆到如此处理的p76中。
所得载体被命名为p7635ST。
以食用番茄的基因组DNA为模板，通过PCR方法分离Bgene(SEQ IDNO128)。
为此使用寡核苷酸引物BgeneFor(SEQ ID NO129)和BgeneRev(SEQ ID NO130)。在合成过程中，提供了具有5’-磷酸残基的寡核苷酸。
SEQ ID NO 129Bgenefor5’-CTATTGCTAGATTGCCAATCAG-3’SEQ ID NO 130Bgeneves5’-ATGGAAGCTCTTCTCAAG-3’如已描述的(Galbiati M等，Funct.Integr.Genomics 2000，20125-34)从食用番茄分离基因组DNA。
如下进行PCR扩增80ng基因组DNA1x Expand Long Template PCR缓冲液2.5mM MgCl2dATP、dCTP、dGTP、dTTp各350μM300nM各引物2.5单位Expand Long Template聚合酶终体积为25μl使用下面的温度程序94℃120秒1个循环94℃ 10秒，48℃ 30秒，68℃ 3分钟35个循环68℃ 10分钟1个循环。
利用琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，并通过凝胶洗脱分离1665bp片段。
用限制性内切酶SmaI消化载体p7635ST，并同样通过琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶洗脱回收。
将纯化的PCR产物克隆到如此处理的载体中。
该构建体被命名为pB。对代表番茄Bgene的长为1486bp的片断进行测序，其核苷酸序列与数据库条目AF254793(SEQ ID NO1)一致。
使用限制性内切酶PmeI和SspI消化pB，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶洗脱回收含有启动子P76、Bgene和35ST的3906bp片段。
用限制性内切酶Ecl126II消化MSP108(实施例7)，通过琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶洗脱回收。
将纯化的来自pB的含有启动子P76、Bgene和35ST的3906bp片段克隆到如此处理的载体MSP108中。
该构建体被命名为pMKP1。
实施例13转基因食用番茄植物的制备和分析根据Ling等发表的方法(Plant Cell Reports(1998)，17843-847)转化并再生番茄植物。对于品种Microtom，使用更高浓度的卡那霉素(100mg/l)进行选择。
使用Microtom系的7到10天龄幼苗的子叶和下胚轴作为转化用的起始外植体。萌发使用Murashige和Skoog所述含2％蔗糖、pH 6.1的培养基(1962Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant 15,473-)。在21℃、低光照(20-100μE)的条件下进行萌发。7到10天后，横向分割子叶并将下胚轴切成约5-10mm长的节段，并置于一天前预先涂布悬浮培养番茄细胞的MSBN培养基(MS，pH 6.1，3％蔗糖+1mg/1BAP、0.1mg/l NAA)上。所述番茄细胞用无菌滤纸无气泡覆盖。在上述培养基上将外植体预培养3到5天。分别用质粒独立转化根癌农杆菌LBA4404株细胞。每一次，将用二元载体转化的各农杆菌菌株在28℃含卡那霉素(20mg/l)的YEB培养基中过夜培养，并离心细胞。将细菌沉淀重悬浮于液体MS培养基(3％蔗糖、pH 6.1)，并调节到光密度为0.3(600nm处)。将预培养的外植体转移到悬浮液中，并在室温温和振荡的条件下孵育30分钟。随后，用无菌滤纸干燥外植体，并重置于其预培养基进行3天共培养(21℃)。
共培养后，将外植体转移到MSZ2培养基(MS pH 6.1+3％蔗糖、2mg/l玉米素、100mg/l卡那霉素、160mg/l替曼汀(timentin))并储存，以在21℃、弱光条件(20-100μE、光节律16h/8h)下选择性再生。在芽形成以前每两到3周转移一次外植体。可以从外植体上分离小芽，并使其在MS(pH 6.1+3％蔗糖)、160mg/l替曼汀、30mg/l卡那霉素、0.1mg/l IAA上生根。将生根的植物转移到温室。
根据上述转化方法，用以下表达构建体获得了如下株系用MSP105获得MSP105-1、MSP105-2、MSP105-3用MSP107获得MSP107-1、MSP107-2、MSP107-3用MSP109获得MSP109-1、MSP109-2、MSP109-3用MSP111获得MSP111-1、MSP111-2、MSP111-3实施例14转基因万寿菊植物的制备将万寿菊种子灭菌并置于萌发培养基(MS培养基；Murashige和Skoog，Physio.Plant.15(1962)，473-497)pH 5.8，2％蔗糖)上。萌发的温度/光照/时间间隔为18-28℃/20-200μE/3-16周，但是优选在21℃、20-70μE、持续4-8周。
到时收获体外发育的植物的所有叶子，并从中部横切。制备过程中将由此得到的10-60mm2大小的叶外植体储存于室温下的液体MS培养基中最多两小时。
过夜培养任何一种所需的根癌农杆菌菌株，并用于与叶子材料共培养，其中优选超毒力菌株，如具有适当二元质粒的EHA 105，所述二元质粒可以携带选择性标记基因(优选bar或pat)和一种或多种性状或报告基因。可以如下培养细菌菌株将适当菌株的单菌落接种于具有25mg/l卡那霉素的YEB(0.1％酵母提取物、0.5％牛肉膏、0.5％蛋白胨、0.5％蔗糖、0.5％硫酸镁x7H2O)，并在28℃培养16到20小时。然后以6000g离心10分钟收获细菌悬浮液，并以产生约0.1到0.8的OD600的方式重悬浮于液体MS培养基。这一悬浮液用于与叶子材料共培养。
紧邻共培养之前，用细菌悬浮液替换储存叶子的MS培养基。室温及温和振荡下在农杆菌悬浮液中孵育叶子30分钟。然后将感染的外植体置于用琼脂(如0.8％的植物琼脂(Duchefa，NL))固化的具有生长调节剂(如3mg/l的苄氨基嘌呤(BAP)和1mg/l吲哚乙酸(IAA))的MS培养基上。叶子在培养基上的方向并不重要。外植体的培养进行1到8天，但优选6天，此过程中可使用以下条件光强度30-80μmol/m2x秒，温度22-24℃，16/8小时明/暗交替。然后，将共培养的外植体转移到新鲜MS培养基，优选具有相同生长调节剂，此第二培养基额外含有抑制细菌生长的抗生素。浓度为200到500mg/l的替曼汀特别适合这一目的。使用可用于选择成功转化的第二选择性组分。1到5mg/l浓度的膦丝菌素选择特别有效，但是也可以根据所用方法考虑其它选择性组分。
每次在1到3周后，将外植体转移到新鲜培养基直至形成胚芽和小芽，此后将其转移以植根于相同基础培养基，所述培养基含有替曼汀和PPT或替代组分，以及生长调节剂(即如0.5mg/l的吲哚丁酸(IBA)和0.5mg/l的赤霉酸GA3)。已生根的芽可以被转移到温室。
除所述方法外，可以进行以下有利的修改●在用细菌感染外植体以前，可以将其于上述共培养用的培养基上预孵育1到12天(优选3-4天)。然后如上述进行感染、共培养和选择性再生。
●再生的pH值(通常为5.8)可降为5.2。这样能改善对农杆菌生长的控制。
●向再生培养基加入AgNO3(3-10mg/l)能改善包括再生自身在内的培养条件。
●技术人员所知的减少苯酚形成的组分(如柠檬酸、抗坏血酸、PVP和许多其它组分)对于培养有利。
●整个过程可以使用液体培养基。也可以将培养物孵育在置于液体培养基上的可购支持物上。
根据上述转化方法，用以下表达构建体获得了下述株系用MSP106获得MSP106-1、MSP106-2、MSP106-3用MSP108获得MSP108-1、MSP108-2、MSP108-3用MSP110获得MSP110-1、MSP110-2、MSP110-3用MSP112获得MSP112-1、MSP112-2、MSP112-3用pCSEbhyd获得csebhyd-1、csebhyd1-2、csebhyd1-3用pMKP1获得mkp-1、mkp1-2、mkp1-3实施例15植物材料来源的类胡萝卜素酯的脂酶催化水解以及类胡萝卜素的鉴定一般方法a)用100％的丙酮抽提(3次500μl；每次振荡约15分钟)在研钵中碾磨的植物材料(湿重30-100mg)。将溶剂蒸发。然后将类胡萝卜素溶解于495μl丙酮，加入4.95ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.4)后充分混合溶液。然后加入约17mg胆汁盐(Sigma)以及149μl NaCl/CaCl2溶液(3MNaCl和75mM CaCl2)。将悬浮液在37℃孵育30分钟。为了酶促水解类胡萝卜素酯，加入595μl脂酶溶液(50mg/ml皱褶假丝酵母(Candidarugosa)来源的7型脂酶(Sigma))并在37℃振荡下孵育。约21小时后，再次加入595μl脂酶在37℃再孵育至少5小时。然后在溶液中溶解约700mgNa2SO4。加入1800μl石油醚后，通过剧烈振荡将类胡萝卜素抽提至有机相。重复这一振荡抽提直至有机相变为无色。合并石油醚级分并蒸发掉石油醚。用100-120μl丙酮吸收游离的类胡萝卜素。通过HPLC和C30反相柱方法，根据滞留时间和UV-VIS光谱鉴定游离的类胡萝卜素。
所用的胆汁盐或胆酸盐为胆酸盐与脱氧胆酸盐1∶1的混合物。
b)当植物材料中仅存在少量类胡萝卜素酯时采用的方法另外，也可以利用薄层层析法分离的皱褶假丝酵母来源的脂酶水解类胡萝卜素酯。为此，用约750μl丙酮抽提50-100mg植物材料3次。将溶剂抽提物在旋转蒸发器的真空中浓缩(可耐受升高温度至40-50℃)。随后加入300ul石油醚∶丙酮(比例5∶1)并充分混合。然后将悬浮物离心(1-2分钟)沉淀。将上层相转移到新的反应试管中。残留物再次用200ul石油醚∶丙酮(比例5∶1)抽提并离心去除悬浮物。将两次抽提物混合(体积500ul)并蒸发掉溶剂。残余物在30ul石油醚∶丙酮(比例5∶1)中重悬浮并铺在薄层板上(silica gel 60，Merck)。如果为制备/分析目的需要使用一次以上，每次应当按照薄层层析法分离所述的方法准备湿重为50-100mg的若干等分试样。
薄层板在石油醚∶丙酮(比例5∶1)中展开。可根据其颜色肉眼鉴别类胡萝卜素条带。刮下单个类胡萝卜素条带，并可为制备/分析目的而富集。用丙酮将类胡萝卜素从硅材料上洗脱；将溶剂在真空中蒸发。为水解类胡萝卜素酯，将残留物溶解于495μl丙酮中，并加入17mg胆汁盐(Sigma)、4.95ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)以及149μl 3M NaCl+75mM CaCl2。充分混合后，将溶液在37℃平衡30分钟。随后加入595μl皱褶假丝酵母脂酶(Sigma，5mM CaCl2贮藏液中50mg/ml)，并在37℃时振荡孵育过夜。约21小时后，再次加入等量的脂酶；将此混合物在37℃时再次振荡孵育至少5小时。然后加入约700mg Na2SO4(无水)，加入1800μl石油醚振荡抽提该混合物约1分钟并在3500转/分钟下离心5分钟。将上层相转移到新的反应试管中，重复振荡抽提直至上层相变为无色。合并石油醚相在真空中浓缩(温度可以为40-50℃)。残余物溶解于120μl丙酮中，如需要可使用超声。利用C30柱通过HPLC方法分离溶解的类胡萝卜素，并借助参照物质定量。
实施例16游离类胡萝卜素的HPLC分析在以下条件下分析根据实施例15的工作步骤获取的样品设定了以下HPLC条件。
分离柱Prontosil C30柱，250×4.6mm，(Bischoff，Leonberg，Germany)流速1.0ml/min洗脱液洗脱液A-100％甲醇洗脱液B-80％甲醇、0.2％乙酸铵洗脱液C-100％叔丁基甲基醚检测300-530nm梯度曲线

某些根据本发明形成的类胡萝卜素特征性的迟滞时间为，例如，紫黄质11.7分钟，虾青素17.7分钟，金盏花黄质19分钟，金盏花玉红质19.9分钟，玉米黄质21分钟。
序列表序列表&lt;110&gt;太阳基因有限公司&lt;120&gt;在遗传修饰的非人类生物中制备酮式类胡萝卜素的方法&lt;130&gt;PF 55340&lt;160&gt;131&lt;170&gt;PatentIn版本3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;1666&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;食用番茄&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(1)..(1494)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;1atg gaa gct ctt ctc aag cct ttt cca tct ctt tta ctt tcc tct cct 48Met Glu Ala Leu Leu Lys Pro Phe Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ser Pro1 5 10 15
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1 5 10 15Thr Pro His Arg Ser Ile Phe Gln Gln Asn Pro Ser Phe Leu Ser Pro20 25 30Thr Thr Lys Lys Lys Ser Arg Lys Cys Leu Leu Arg Asn Lys Ser Ser35 40 45Lys Leu Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Thr Ser Lys Pro Glu50 55 60Ser Leu Asp Val Asn Ile Ser Trp Val Asp Pro Asn Ser Asn Arg Ala65 70 75 80Gln Phe Asp Val Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Arg Leu85 90 95Ala Glu Gln Val Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Val Cys Cys Val Asp Pro100 105 110Ser Pro Leu Ser Met Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu115 120 125Phe Glu Asn Leu Gly Leu Glu Asn Cys Leu Asp His Lys Trp Pro Met130 135 140Thr Cys Val His Ile Asn Asp Asn Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Arg Pro145 150 155 160Tyr Gly Arg Val Ser Arg Lys Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Asn Ser165 170 175Cys Val Glu Asn Arg Val Lys Phe Tyr Lys Ala Lys Val Trp Lys Val180 185 190Glu His Glu Glu Phe Glu Ser Ser Ile Val Cys Asp Asp Gly Lys Lys195 200 205
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&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(166)..(1155)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;3ggcacgagct tgcacgcaag tcagcgcgcg caagtcaaca cctgccggtc cacagcctca 60
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aca tcc atg gac cag ctt cac tgg ttg cct gtg tcc gaa gcc aca gcc464Thr Ser Met Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu Ala Thr Ala85 90 95cag ctt ttg ggc gga agc agc agc cta ctg cac atc gct gca gtc ttc512Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Ala Ala Val Phe100 105 110 115att gta ctt gag ttc ctg tac act ggt cta ttc atc acc aca cat gac560Ile Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp120 125 130gca atg cat ggc acc ata gct ttg agg cac agg cag ctc aat gat ctc608Ala Met His Gly Thr Ile Ala Leu Arg His Arg Gln Leu Asn Asp Leu135 140 145ctt ggc aac atc tgc ata tca ctg tac gcc tgg ttt gac tac agc atg656Leu Gly Asn Ile Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Ser Met150 155 160ctg cat cgc aag cac tgg gag cac cac aac cat act ggc gaa gtg ggg704Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly165 170 175aaa gac cct gac ttc cac aag gga aat ccc ggc ctt gtc ccc tgg ttc752Lys Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val Pro Trp Phe180 185 190 195gcc agc ttc atg tcc agc tac atg tcc ctg tgg cag ttt gcc cgg ctg800Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe Ala Arg Leu200 205 210gca tgg tgg gca gtg gtg atg caa atg ctg ggg gcg ccc atg gca aat848Ala Trp Trp Ala Val Val Met Gln Met Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn215 220 225ctc cta gtc ttc atg gct gca gcc cca atc ttg tca gca ttc cgc ctc896Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu230 235 240ttc tac ttc ggc act tac ctg cca cac aag cct gag cca ggc cct gca944Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Pro Ala245 250 255gca ggc tct cag gtg atg gcc tgg ttc agg gcc aag aca agt gag gca992Ala Gly Ser Gln Val Met Ala Trp Phe Arg Ala Lys Thr Ser Glu Ala260 265 270 275
tct gat gtg atg agt ttc ctg aca tgc tac cac ttt gac ctg cac tgg1040Ser Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp280 285 290gag cac cac agg tgg ccc ttt gcc ccc tgg tgg cag ctg ccc cac tgc1088Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Gln Leu Pro His Cys295 300 305cgc cgc ctg tcc ggg cgt ggc ctg gtg cct gcc ttg gca tga1130Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala Leu Ala310 315 320cctggtccct ccgctggtga cccagcgtct gcacaagagt gtcatgctac agggtgctgc 1190ggccagtggc agcgcagtgc actctcagcc tgtatggggc taccgctgtg ccactgagca 1250ctgggcatgc cactgagcac tgggcgtgct actgagcaat gggcgtgcta ctgagcaatg 1310ggcgtgctac tgacaatggg cgtgctactg gggtctggca gtggctagga tggagtttga 1370tgcattcagt agcggtggcc aacgtcatgt ggatggtgga agtgctgagg ggtttaggca 1430gccggcattt gagagggcta agttataaat cgcatgctgc tcatgcgcac atatctgcac 1490acagccaggg aaatcccttc gagagtgatt atgggacact tgtattggtt tcgtgctatt 1550gttttattca gcagcagtac ttagtgaggg tgagagcagg gtggtgagag tggagtgagt 1610gagtatgaac ctggtcagcg aggtgaacag cctgtaatga atgactctgt ct 1662&lt;210&gt;36&lt;211&gt;320&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;雨生红球藻&lt;400&gt;36Met His Val Ala Ser Ala Leu Met Val Glu Gln Lys Gly Ser Glu Ala1 5 10 15Ala Ala Ser Ser Pro Asp Val Leu Arg Ala Trp Ala Thr Gln Tyr His20 25 30
Met Pro Ser Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Ala Leu Lys His Ala35 40 45Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Thr50 55 60Ile Ile Gly Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile65 70 75 80Arg Leu Pro Thr Ser Met Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu85 90 95Ala Thr Ala Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Ala100 105 110Ala Val Phe Ile Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr115 120 125Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Leu Arg His Arg Gln Leu130 135 140Asn Asp Leu Leu Gly Asn Ile Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp145 150 155 160Tyr Ser Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly165 170 175Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Lys Gly Asn Pro Gly Leu Val180 185 190Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Leu Trp Gln Phe195 200 205Ala Arg Leu Ala Trp Trp Ala Val Val Met Gln Met Leu Gly Ala Pro210 215 220
Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala225 230 235 240Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Glu Pro245 250 255Gly Pro Ala Ala Gly Ser Gln Val Met Ala Trp Phe Arg Ala Lys Thr260 265 270Ser Glu Ala Ser Asp Val Met Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp275 280 285Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Gln Leu290 295 300Pro His Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala Leu Ala305 310 315 320&lt;210&gt;37&lt;211&gt;729&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;橙黄农杆菌&lt;220&gt;
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atc gtc tcg ggc ggc atc atc gcc gct tgg ctg gcc ctg cat gtg cat96Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His20 25 30gcg ctg tgg ttt ctg gac gca gcg gcg cat ccc atc ctg gcg atc gca144Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Ile Ala35 40 45aat ttc ctg ggg ctg acc tgg ctg tcg gtc gga ttg ttc atc atc gcg192Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala50 55 60cat gac gcg atg cac ggg tcg gtg gtg ccg ggg cgt ccg cgc gcc aat240His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn65 70 75 80gcg gcg atg ggc cag ctt gtc ctg tgg ctg tat gcc gga ttt tcg tgg288Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp85 90 95cgc aag atg atc gtc aag cac atg gcc cat cac cgc cat gcc gga acc336Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr100 105 110gac gac gac ccc gat ttc gac cat ggc ggc ccg gtc cgc tgg tac gcc384Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala115 120 125cgc ttc atc ggc acc tat ttc ggc tgg cgc gag ggg ctg ctg ctg ccc432Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro130 135 140gtc atc gtg acg gtc tat gcg ctg atc ctt ggg gat cgc tgg atg tac480Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr145 150 155 160gtg gtc ttc tgg ccg ctg ccg tcg atc ctg gcg tcg atc cag ctg ttc528Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe165 170 175gtg ttc ggc acc tgg ctg ccg cac cgc ccc ggc cac gac gcg ttc ccg576Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro180 185 190gac cgc cac aat gcg cgg tcg tcg cgg atc agc gac ccc gtg tcg ctg624Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu195 200 205
ctg acc tgc ttt cac ttt ggc ggt tat cat cac gaa cac cac ctg cac672Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His210 215 220ccg acg gtg ccg tgg tgg cgc ctg ccc agc acc cgc acc aag ggg gac720Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp225 230 235 240acc gca tga729Thr Ala&lt;210&gt;38&lt;211&gt;242&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;橙黄农杆菌&lt;400&gt;38Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu1 5 10 15Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His20 25 30Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Ile Ala35 40 45Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala50 55 60His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn65 70 75 80Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp85 90 95
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ttc ggc tgg cga gag gga ctg ctg cta ccg gtg atc gtc acc acc tat548Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro Val Ile Val Thr Thr Tyr135 140 145 150gcg ctg atc ctg ggc gat cgc tgg atg tat gtc atc ttc tgg ccg gtc596Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr Val Ile Phe Trp Pro Val155 160 165ccg gcc gtt ctg gcg tcg atc cag att ttc gtc ttc gga act tgg ctg644Pro Ala Val Leu Ala Ser Ile Gln Ile Phe Val Phe Gly Thr Trp Leu170 175 180ccc cac cgc ccg gga cat gac gat ttt ccc gac cgg cac aac gcg agg692Pro His Arg Pro Gly His Asp Asp Phe Pro Asp Arg His Asn Ala Arg185 190 195tcg acc ggc atc ggc gac ccg ttg tca cta ctg acc tgc ttc cat ttc740Ser Thr Gly Ile Gly Asp Pro Leu Ser Leu Leu Thr Cys Phe His Phe200 205 210ggc ggc tat cac cac gaa cat cac ctg cat ccg cat gtg ccg tgg tgg788Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His Pro His Val Pro Trp Trp215 220 225 230cgc ctg cct cgt aca cgc aag acc gga ggc cgc gca tga cgcaattcct 837Arg Leu Pro Arg Thr Arg Lys Thr Gly Gly Arg Ala235 240cattgtcgtg gcgacagtcc tcgtgatgga gctgaccgcc tattccgtcc accgctggat 897tatgcacggc cccctaggct ggggctggca caagtcccat cacgaagagc acgaccacgc 957gttggagaag aacgacctct acggcgtcgt cttcgcggtg ctggcgacga tcctcttcac 1017cgtgggcgcc tattggtggc cggtgctgtg gtggatcgcc ctgggcatga cggtctatgg 1077gttgatctat ttcatcctgc acgacgggct tgtgcatcaa cgctggccgt ttcggtatat 1137tccgcggcgg ggctatttcc gcaggctcta ccaagctcat cgcctgcacc acgcggtcga 1197ggggcgggac cactgcgtca gcttcggctt catctatgcc ccacccgtgg acaagctgaa 1257gcaggatctg aagcggtcgg gtgtcctgcg cccccaggac gagcgtccgt cgtgatctct 1317gatcccggcg tggccgcatg aaatccgacg tgctgctggc aggggccggc cttgccaacg 1377gactgatcgc gctggcgatc cgcaaggcgc ggcccgacct tcgcgtgctg ctgctggacc 1437gtgcggcggg cgcctcggac gggcatactt ggtcctgcca cgacaccgat ttggcgccgc 1497
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&lt;223&gt;
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&lt;211&gt;1629&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Synechococystis&lt;220&gt;
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Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Val Glu165 170 175Gly Tyr Lys Glu Pro His Arg Ser Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp180 185 190Trp Ser Phe Ile Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Tyr Glu His His195 200 205Glu Tyr Pro His Val Pro Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Met210 215 220Ser Lys Ser Asn Leu225&lt;210&gt;57&lt;211&gt;789&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;点形念珠藻ATCC29133&lt;220&gt;
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&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(3)..(956)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;92cc atg gtg aag gag gaa ata gcg aaa agg gcc gaa ata atc aac aaa 47Met Val Lys Glu Glu Ile Ala Lys Arg Ala Glu Ile Ile Asn Lys1 5 10 15gcc att gaa gag ctt ctg ccc gaa agg gag ccg att gga ctc tac aaa 95Ala Ile Glu Glu Leu Leu Pro Glu Arg Glu Pro Ile Gly Leu Tyr Lys20 25 30gcc gca agg cat ctg atc aaa gca ggt ggc aag agg cta agg cct gta143Ala Ala Arg His Leu Ile Lys Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Val35 40 45ata agc ctc tta gca gtc gaa gcc ctt ggg aaa gac tac aga aag att191Ile Ser Leu Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Lys Asp Tyr Arg Lys Ile50 55 60atc ccg gct gct gtc agc att gaa aca atc cac aac ttc acc ctc gtg239Ile Pro Ala Ala Val Ser Ile Glu Thr Ile His Asn Phe Thr Leu Val65 70 75
cat gac gac ata atg gac agg gac gag atg agg agg gga gtt ccg acg287His Asp Asp Ile Met Asp Arg Asp Glu Met Arg Arg Gly Val Pro Thr80 85 90 95gta cac agg gtt tat ggg gaa gcg acq gcc att tta gca ggc gac aca335Val His Arg Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ala Ile Leu Ala Gly Asp Thr100 105 110ctc ttt gct gaa gcc ttc aag ctg ctg aca aag tgc gat gtt gag agc383Leu Phe Ala Glu Ala Phe Lys Leu Leu Thr Lys Cys Asp Val Glu Ser115 120 125gag gga atc aga aaa gct aca gaa atg ctt tcg gac gtt tgc ata aaa431Glu Gly Ile Arg Lys Ala Thr Glu Met Leu Ser Asp Val Cys Ile Lys130 135 140ata tgc gag ggg cag tac tac gac atg agc ttt gag aaa aag gag agc479Ile Cys Glu Gly Gln Tyr Tyr Asp Met Ser Phe Glu Lys Lys Glu Ser145 150 155gtt tcc gag gag gag tat ctc agg atg gtc gag ctg aag acc gga gtg527Val Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Arg Met Val Glu Leu Lys Thr Gly Val160 165 170 175ctg att gca gct tct gca gca tta cct gcg gtg ctt ttt ggg gag agc575Leu Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ala Val Leu Phe Gly Glu Ser180 185 190gag gaa att gta aag gcg ctg tgg gac tac gga gtt ctt agc ggt att623Glu Glu Ile Val Lys Ala Leu Trp Asp Tyr Gly Val Leu Ser Gly Ile195 200 205ggc ttc cag atc cag gac gac ctg ctt gac ctg act gag gag acc gga671Gly Phe Gln Ile Gln Asp Asp Leu Leu Asp Leu Thr Glu Glu Thr Gly210 215 220aag gac tgg gga agc gac ctg ctt aaa ggg aag aaa acc ctg att gtc719Lys Asp Trp Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gly Lys Lys Thr Leu Ile Val225 230 235ata aag gcg ttc gaa aag gga gtg aag cta aag acg ttt gga aag gaa767Ile Lys Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Leu Lys Thr Phe Gly Lys Glu240 245 250 255aag gcg gac gtc tct gag att aga gat gat atc gaa aag tta aga gag815Lys Ala Asp Val Ser Glu Ile Arg Asp Asp Ile Glu Lys Leu Arg Glu260 265 270
tgt ggt gcg att gat tac gct gcc agc atg gca aga aag atg gct gaa863Cys Gly Ala Ile Asp Tyr Ala Ala Ser Met Ala Arg Lys Met Ala Glu275 280 285gag gcg aaa aga aag ctc gaa gtt ctg cct gaa agc aaa gcc aag gaa911Glu Ala Lys Arq Lys Leu Glu Val Leu Pro Glu Ser Lys Ala Lys Glu290 295 300aca ctg ctg gaa ctt acc gac ttc ttg gtt aca aga aaa aag tga956Thr Leu Leu Glu Leu Thr Asp Phe Leu Val Thr Arg Lys Lys305 310 315aagctt 962&lt;210&gt;93&lt;211&gt;317&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜超高温硫酸根还原古细菌&lt;400&gt;93Met Val Lys Glu Glu Ile Ala Lys Arg Ala Glu Ile Ile Asn Lys Ala1 5 10 15Ile Glu Glu Leu Leu Pro Glu Arg Glu Pro Ile Gly Leu Tyr Lys Ala20 25 30Ala Arg His Leu Ile Lys Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Val Ile35 40 45Ser Leu Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Lys Asp Tyr Arg Lys Ile Ile50 55 60Pro Ala Ala Val Ser Ile Glu Thr Ile His Asn Phe Thr Leu Val His65 70 75 80Asp Asp Ile Met Asp Arg Asp Glu Met Arg Arg Gly Val Pro Thr Val85 90 95
His Arg Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ala Ile Leu Ala Gly Asp Thr Leu100 105 110Phe Ala Glu Ala Phe Lys Leu Leu Thr Lys Cys Asp Val Glu Ser Glu115 120 125Gly Ile Arg Lys Ala Thr Glu Met Leu Ser Asp Val Cys Ile Lys Ile130 135 140Cys Glu Gly Gln Tyr Tyr Asp Met Ser Phe Glu Lys Lys Glu Ser Val145 150 155 160Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Arg Met Val Glu Leu Lys Thr Gly Val Leu165 170 175Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ala Val Leu Phe Gly Glu Ser Glu180 185 190Glu Ile Val Lys Ala Leu Trp Asp Tyr Gly Val Leu Ser Gly Ile Gly195 200 205Phe Gln Ile Gln Asp Asp Leu Leu Asp Leu Thr Glu Glu Thr Gly Lys210 215 220Asp Trp Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gly Lys Lys Thr Leu Ile Val Ile225 230 235 240Lys Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Leu Lys Thr Phe Gly Lys Glu Lys245 250 255Ala Asp Val Ser Glu Ile Arg Asp Asp Ile Glu Lys Leu Arg Glu Cys260 265 270Gly Ala Ile Asp Tyr Ala Ala Ser Met Ala Arg Lys Met Ala Glu Glu275 280 285
Ala Lys Arg Lys Leu Glu Val Leu Pro Glu Ser Lys Ala Lys Glu Thr290 295 300Leu Leu Glu Leu Thr Asp Phe Leu Val Thr Arg Lys Lys305 310 315&lt;210&gt;94&lt;211&gt;1293&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;嗜超高温硫酸根还原古细菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(206)..(1159)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;94taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 60gccccccctc gacgccgtcg ttcaatgaga atggataaga ggctcgtggg attgacgtga120gggggcaggg atggctatat ttctgggagc gaactccggg cgaggatcta gttgtaggga180gggattcatg acaccacaaa cagcc atg gtg aag gag gaa ata gcg aaa agg 232Met Val Lys Glu Glu Ile Ala Lys Arg1 5gcc gaa ata atc aac aaa gcc att gaa gag ctt ctg ccc gaa agg gag 280Ala Glu Ile Ile Asn Lys Ala Ile Glu Glu Leu Leu Pro Glu Arg Glu10 15 20 25ccg att gga ctc tac aaa gcc gca agg cat ctg atc aaa gca ggt ggc 328Pro Ile Gly Leu Tyr Lys Ala Ala Arg His Leu Ile Lys Ala Gly Gly30 35 40
aag agg cta agg cct gta ata agc ctc tta gca gtc gaa gcc ctt ggg376Lys Arg Leu Arg Pro Val Ile Ser Leu Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly45 50 55aaa gac tac aga aag att atc ccg gct gct gtc agc att gaa aca atc424Lys Asp Tyr Arg Lys Ile Ile Pro Ala Ala Val Ser Ile Glu Thr Ile60 65 70cac aac ttc acc ctc gtg cat gac gac ata atg gac agg gac gag atg472His Asn Phe Thr Leu Val His Asp Asp Ile Met Asp Arg Asp Glu Met75 80 85agg agg gga gtt ccg acg gta cac agg gtt tat ggg gaa gcg acg gcc520Arg Arg Gly Val Pro Thr Val His Arg Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ala90 95 100 105att tta gca ggc gac aca ctc ttt gct gaa gcc ttc aag ctg ctg aca568Ile Leu Ala Gly Asp Thr Leu Phe Ala Glu Ala Phe Lys Leu Leu Thr110 115 120aag tgc gat gtt gag agc gag gga atc aga aaa gct aca gaa atg ctt616Lys Cys Asp Val Glu Ser Glu Gly Ile Arg Lys Ala Thr Glu Met Leu125 130 135tcg gac gtt tgc ata aaa ata tgc gag ggg cag tac tac gac atg agc664Ser Asp Val Cys Ile Lys Ile Cys Glu Gly Gln Tyr Tyr Asp Met Ser140 145 150ttt gag aaa aag gag agc gtt tcc gag gag gag tat ctc agg atg gtc712Phe Glu Lys Lys Glu Ser Val Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Arg Met Val155 160 165gag ctg aag acc gga gtg ctg att gca gct tct gca gca tta cct gcg760Glu Leu Lys Thr Gly Val Leu Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ala170 175 180 185gtg ctt ttt ggg gag agc gag gaa att gta aag gcg ctg tgg gac tac808Val Leu Phe Gly Glu Ser Glu Glu Ile Val Lys Ala Leu Trp Asp Tyr190 195 200gga gtt ctt agc ggt att ggc ttc cag atc cag gac gac ctg ctt gac856Gly Val Leu Ser Gly Ile Gly Phe Gln Ile Gln Asp Asp Leu Leu Asp205 210 215ctg act gag gag acc gga aag gac tgg gga agc gac ctg ctt aaa ggg904Leu Thr Glu Glu Thr Gly Lys Asp Trp Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gly220 225 230
aag aaa acc ctg att gtc ata aag gcg ttc gaa aag gga gtg aag cta 952Lys Lys Thr Leu Ile Val Ile Lys Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Leu235 240 245aag acg ttt gga aag gaa aag gcg gac gtc tct gag att aga gat gat 1000Lys Thr Phe Gly Lys Glu Lys Ala Asp Val Ser Glu Ile Arg Asp Asp250 255 260 265atc gaa aag tta aga gag tgt ggt gcg att gat tac gct gcc agc atg 1048Ile Glu Lys Leu Arg Glu Cys Gly Ala Ile Asp Tyr Ala Ala Ser Met270 275 280gca aga aag atg gct gaa gag gcg aaa aga aag ctc gaa gtt ctg cct 1096Ala Arg Lys Met Ala Glu Glu Ala Lys Arg Lys Leu Glu Val Leu Pro285 290 295gaa agc aaa gcc aag gaa aca ctg ctg gaa ctt acc gac ttc ttg gtt 1144Glu Ser Lys Ala Lys Glu Thr Leu Leu Glu Leu Thr Asp Phe Leu Val300 305 310aca aga aaa aag tga aagcttcaat tgcatgctct agatgatcaa agaattcctg 1199Thr Arg Lys Lys315gcctagtcta taggaggttt tgaaaagaaa ggagcaataa tcattttctt gttctatcaa1259gagggtgcta ttgctccttt ctttttttct cgag1293&lt;210&gt;95&lt;211&gt;317&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜超高温硫酸根还原古细菌&lt;400&gt;95Met Val Lys Glu Glu Ile Ala Lys Arg Ala Glu Ile Ile Asn Lys Ala1 5 10 15Ile Glu Glu Leu Leu Pro Glu Arg Glu Pro Ile Gly Leu Tyr Lys Ala20 25 30
Ala Arg His Leu Ile Lys Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Val Ile35 40 45Ser Leu Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Lys Asp Tyr Arg Lys Ile Ile50 55 60Pro Ala Ala Val Ser Ile Glu Thr Ile His Asn Phe Thr Leu Val His65 70 75 80Asp Asp Ile Met Asp Arg Asp Glu Met Arg Arg Gly Val Pro Thr Val85 90 95His Arg Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ala Ile Leu Ala Gly Asp Thr Leu100 105 110Phe Ala Glu Ala Phe Lys Leu Leu Thr Lys Cys Asp Val Glu Ser Glu115 120 125Gly Ile Arg Lys Ala Thr Glu Met Leu Ser Asp Val Cys Ile Lys Ile130 135 140Cys Glu Gly Gln Tyr Tyr Asp Met Ser Phe Glu Lys Lys Glu Ser Val145 150 155 160Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Arg Met Val Glu Leu Lys Thr Gly Val Leu165 170 175Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ala Val Leu Phe Gly Glu Ser Glu180 185 190Glu Ile Val Lys Ala Leu Trp Asp Tyr Gly Val Leu Ser Gly Ile Gly195 200 205Phe Gln Ile Gln Asp Asp Leu Leu Asp Leu Thr Glu Glu Thr Gly Lys210 215 220Asp Trp Gly Ser Asp Leu Leu Lys Gly Lys Lys Thr Leu Ile Val Ile225 230 235 240
Lys Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Leu Lys Thr Phe Gly Lys Glu Lys245 250 255Ala Asp Val Ser Glu Ile Arg Asp Asp Ile Glu Lys Leu Arg Glu Cys260 265 270Gly Ala Ile Asp Tyr Ala Ala Ser Met Ala Arg Lys Met Ala Glu Glu275 280 285Ala Lys Arg Lys Leu Glu Val Leu Pro Glu Ser Lys Ala Lys Glu Thr290 295 300Leu Leu Glu Leu Thr Asp Phe Leu Val Thr Arg Lys Lys305 310 315&lt;210&gt;96&lt;211&gt;35&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;primer_bind&lt;222&gt;(1)..(35)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;96gagctcttca ttatttcgat tttgatttcg tgacc 35&lt;210&gt;97
&lt;211&gt;38&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;Primer&lt;222&gt;(1)..(38)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;97aagcttggttgatcagaaga agaagaagaa gatgaact 38&lt;210&gt;98&lt;211&gt;647&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;拟南芥&lt;220&gt;
&lt;221&gt;启动子&lt;222&gt;(1)..(647)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;98gagctcttca ttatttcgat tttgatttcg tgaccagcga acgcagaata ccttgttgtg 60taatacttta cccgtgtaaa tcaaaaacaa aaaggctttt gagctttttg tagttgaatt120tctctggctg atcttttctg tacagattca tatatctgca gagacgatat cattgattat180
ttgagcttct tttgaactat ttcgtgtaat ttgggatgag agctctatgt atgtgtgtaa240actttgaaga caacaagaaa ggtaacaagt gagggaggga tgactccatg tcaaaataga300tgtcataaga ggcccatcaa taagtgcttg agcccattag ctagcccagt aactaccaga360ttgtgagatg gatgtgtgaa cagttttttt tttgatgtag gactgaaatg tgaacaacag420gcgcatgaaa ggctaaatta ggacaatgat aagcagaaat aacttatcct ctctaacact480tggcctcaca ttgcccttca cacaatccac acacatccaa tcacaacctc atcatatatc540tcccgctaat ctttttttct ttgatctttt tttttttgct tattattttt ttgactttga600tctcccatca gttcatcttc ttcttcttct tctgatcaac caagctt 647&lt;210&gt;99&lt;211&gt;28&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;primer_bind&lt;222&gt;(1)..(28)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;99gagctcactc actgatttcc attgcttg 28&lt;210&gt;100&lt;211&gt;37&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(37)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;100gcgcatgcat ctagaaatga tccagttaga acaacca 37&lt;210&gt;101&lt;211&gt;37&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(37)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;101gcgcatgctc tagactattt tgctttgtaa atttctg 37&lt;210&gt;102&lt;211&gt;792&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;点形念珠藻ATCC 29133
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(5)..(775)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;102gcgc atg cat cta gaa atg atc cag tta gaa caa cca ctc agt cat caa49Met His Leu Glu Met Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln1 5 10 15gca aaa ctg act cca gta ctg aga agt aaa tct cag ttt aag ggg ctt 97Ala Lys Leu Thr Pro Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu20 25 30ttc att gct att gtc att gtt agc gca tgg gtc att agc ctg agt tta145Phe Ile Ala Ile Val Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu35 40 45tta ctt tcc ctt gac atc tca aag cta aaa ttt tgg atg tta ttg cct193Leu Leu Ser Leu Asp Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro50 55 60gtt ata cta tgg caa aca ttt tta tat acg gga tta ttt att aca tct241Val Ile Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser65 70 75cat gat gcc atg cat ggc gta gta ttt ccc caa aac acc aag att aat289His Asp Ala Met His Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn80 85 90 95cat ttg att gga aca ttg acc cta tcc ctt tat ggt ctt tta cca tat337His Leu Ile Gly Thr Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr100 105 110caa aaa cta ttg aaa aaa cat tgg tta cac cac cac aat cca gca agc385Gln Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser115 120 125tca ata gac ccg gat ttt cac aat ggt aaa cac caa agt ttc ttt gct433Ser Ile Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala130 135 140
tgg tat ttt cat ttt atg aaa ggt tac tgg agt tgg ggg caa ata att481Trp Tyr Phe His Phe Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile145 150 155gcg ttg act att att tat aac ttt gct aaa tac ata ctc cat atc cca529Ala Leu Thr Ile Ile Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro160 165 170 175agt gat aat cta act tac ttt tgg gtg cta ccc tcg ctt tta agt tca577Ser Asp Asn Leu Thr Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser180 185 190tta caa tta ttc tat ttt ggt act ttt tta ccc cat agt gaa cca ata625Leu Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile195 200 205ggg ggt tat gtt cag cct cat tgt gcc caa aca att agc cgt cct att673Gly Gly Tyr Val Gln Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile210 215 220tgg tgg tca ttt atc acg tgc tat cat ttt ggc tac cac gag gaa cat721Trp Trp Ser Phe Ile Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His225 230 235cac gaa tat cct cat att tct tgg tgg cag tta cca gaa att tac aaa769His Glu Tyr Pro His Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys240 245 250 255gca aaa tagtctagag catgcgc 792Ala Lys&lt;210&gt;103&lt;211&gt;257&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;点形念珠藻ATCC 29133&lt;400&gt;103Met His Leu Glu Met Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala1 5 10 15
Lys Leu Thr Pro Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe20 25 30Ile Ala Ile Val Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu Leu35 40 45Leu Ser Leu Asp Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Val50 55 60Ile Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser His65 70 75 80Asp Ala Met His Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn His85 90 95Leu Ile Gly Thr Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln100 105 110Lys Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Ser115 120 125Ile Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp130 135 140Tyr Phe His Phe Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala145 150 155 160Leu Thr Ile Ile Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser165 170 175Asp Asn Leu Thr Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu180 185 190Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly195 200 205Gly Tyr Val Gln Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp210 215 220
Trp Ser Phe Ile Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His225 230 235 240Glu Tyr Pro His Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala245 250 255Lys&lt;210&gt;104&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(26)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;104gtcgaccctg ctttaatgag atatgc 26&lt;210&gt;105&lt;211&gt;27&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(27)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;105ctcgagcttg gacaatcagt aaattga27&lt;210&gt;106&lt;211&gt;210&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;根癌农杆菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;终止子&lt;222&gt;(1)..(210)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;106gtcgaccctg ctttaatgag atatgcgaga cgcctatgat cgcatgatat ttgctttcaa 60ttctgttgtg cacgttgtaa aaaacctgag catgtgtagc tcagatcctt accgccggtt120tcggttcatt ctaatgaata tatcacccgt tactatcgta tttttatgaa taatattctc180cgttcaattt actgattqtc caagctcgag 210&lt;210&gt;107&lt;211&gt;37
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(37)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;107cccgggaatt cttcattatt tcgattttga tttcgtg 37&lt;210&gt;108&lt;211&gt;38&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(38)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;108aagcttggtt gatcagaaga agaagaagaa gatgaact 38&lt;210&gt;109&lt;211&gt;652
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;拟南芥&lt;220&gt;
&lt;221&gt;启动子&lt;222&gt;(1)..(652)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;109cccgggaatt cttcattatt tcgattttga tttcgtgacc agcgaacgca gaataccttg 60ttgtgtaata ctttacccgt gtaaatcaaa aacaaaaagg cttttgagct ttttgtagtt120gaatttctct ggctgatctt ttctgtacag attcatatat ctgcagagac gatatcattg180attatttgag cttcttttga actatttcgt gtaatttggg atgagagctc tatgtatgtg240tgtaaacttt gaagacaaca agaaaggtaa caagtgaggg agggatgact ccatgtcaaa300atagatgtca taagaggccc atcaataagt gcttgagccc attagctagc ccagtaacta360ccagattgtg agatggatgt gtgaacagtt ttttttttga tgtaggactg aaatgtgaac420aacaggcgca tgaaaggcta aattaggaca atgataagca gaaataactt atcctctcta480acacttggcc tcacattgcc cttcacacaa tccacacaca tccaatcaca acctcatcat540atatctcccg ctaatctttt tttctttgat cttttttttt ttgcttatta tttttttgac600tttgatctcc catcagttca tcttcttctt cttcttctga tcaaccaagc tt652&lt;210&gt;110&lt;211&gt;29&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(29)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;110gagctctagc gcaatcttat gtggtacaa29&lt;210&gt;111&lt;211&gt;29&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(29)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;111aagcttttct tgaaagtaaa gattgagtc29&lt;210&gt;112&lt;211&gt;1773&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;碧冬茄
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;启动子&lt;222&gt;(1)..(1773)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;112gagctctagc gcaatcttat gtggtacaaa tcttgattag tcgggaaaaa atgatgtggc 60cctacaaatg gttggaggat gggagatttg gctctatcta gagttatgtg gttgttgaag 120catttggtta ctctctgctg tggtagttgg catatccaca ttgtctcctt ccacttttat 180gacaattacg tgaaagttat gggttgtttt gtctattttt gtcgagqcct ttcttttcct 240tccaggttgt tgaagatggt ccaattcgat tagaataatg ttttgagctt tagcatattc 300tctctcgttt acacgattat agtaataatg atataggatg acagaagttg acacataaat 360tttttattct ctccatttac tttaatccaa atctcaccta ccctaaactt ctttaatatg 420tattcaatag tctatccgag taaattgtaa atttaacaac cattgataat attgacacct 480actaacatat actagtaaag agaatattaa catggcacat ataatttgat gcaaaatgag 540tatgatgaaa tttaaaccca aaatctcttg attttgacag tgtcaccttg acttgttaac 600taataagtca tgttttagtg gcagaaagac aaactcatcc accaactgta tagcaataaa 660aaatagaaga atcttcctga ggcaaagttt tggaaaaatt aagagtggct gagatttaat 720ttcaacagga attagttcca cttaactttt aggttacgat acagtgctaa ttaaataact 780taattgtatt agatatttct tqcacctaaa aaatttaaaa actgaaaaaa ggtagcaatc 840aaaataaaca aaaggacaaa ataagtgaaa ggtacagcca ccaaccctgg cggctcactg 900tttgttggtt aaaacgtaga cttacaccta ccaaaatcta caactaaaat gagqcaataa 960tactttgccc aaaattacca agaaaagaaa aagaaaggaa tcccttaata ttactctcct1020ccatttcaca ataaatatcc tagtttgact taaattagag tttaaaaaat gaaagacgac1080
ttttaaaact tgtaatctaa aataaatcat agttaaatgt gtggctataa atcattgtat1140taacggtaaa gtggtaagtt taaaagttaa ttgttttcaa atataaaatt gtactatcat1200tctttttgga atggactaat aagaaaacta tgacatccat tatggagcgg agggagtatc1260tccttttaac aataaccttt gtcccttcaa ttcaattatc agtatgcaaa cattaaaaat1320tattattgat gttaagtacc acatcatcct taatgataga atcatcgtag aacgcttttc1380caggcacaca ttcaaactag ttagaccagt accacacatc gaatattcca gacttctttg1440tttgaatagt cgactacatt ggataatgga acttctcgaa ttaacttcga attagtcgag1500cccaaaataa tatatacgtc gggtggaaaa ctataaaatg tttgacaaaa atgtcaaatt1560aatatatcaa tctgcaacaa ccttttcacc ttgagaacgc agctgaaatt ttttacaaag1620gtagttggtg aagctagtca gcgaatccca ttaccttcca ctctacctaa cccccttcac1680caacaacaaa tttctgtaat ttaaaaacta gccaaaaaag aactctcttt tacaaagagc1740caaagactca atctttactt tcaagaaaag ctt 1773&lt;210&gt;113&lt;211&gt;39&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(39)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;113gcgcatgcat ctagaaatga atttttgtga taaaccagt 39
&lt;210&gt;114&lt;211&gt;37&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(37)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;114gcgcatgctc tagattacga attggttact gaattgt 37&lt;210&gt;115&lt;211&gt;819&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;点形念珠藻ATCC 29133&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(5)..(802)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;115gcgcatgcat ctagaaatga atttttgtga taaaccagtt agctattatg ttgcaataga 60gcaattaagt gctaaagaag atactgtttg ggggctggtg attgtcatag taattattag120
tctttgggta gctagtttgg cttttttact agctattaat tatgccaaag tcccaatttg180gttgatacct attgcaatag tttggcaaat gttcctttat acagggctat ttattactgc240acatgatgct atgcatgggt cagtttatcg taaaaatccc aaaattaata attttatcgg300ttcactagct gtagcgcttt acgctgtgtt tccatatcaa cagatgttaa agaatcattg360cttacatcat cgtcatcctg ctagcgaagt tgacccagat tttcatgatg gtaagagaac420aaacgctatt ttctggtatc tccatttcat gatagaatac tccagttggc aacagttaat480agtactaact atcctattta atttagctaa atacgttttg cacatccatc aaataaatct540catcttattt tggagtattc ctccaatttt aagttccatt caactgtttt atttcggaac600atttttgcct catcgagaac ccaagaaagg atatgtttat ccccattgca gccaaacaat660aaaattgcca acttttttgt catttatcgc ttgctaccac tttggttatc atgaagaaca720tcatgagtat ccccatgtac cttggtggca acttccatct gtatataagc agagagtatt780caacaattca gtaaccaatt cgtaatctag agcatgcgc 819&lt;210&gt;116&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(24)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;116gaattcctgc aatagaatgt tgag 24
&lt;210&gt;117&lt;211&gt;25&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(25)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;117ctcgagctta cgagcatttt ctaag 25&lt;210&gt;118&lt;211&gt;307&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;蚕豆&lt;220&gt;
&lt;221&gt;终止子&lt;222&gt;(1)..(307)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;118gaattcctgc aatagaatgt tgaggtgacc actttctgta ataaaataat tataaaataa 60atttagaatt gctgtagtca agaacatcag ttctaaaata ttaataaagt tatggccttt120
tgacatatgt gtttcgataa aaaaatcaaa ataaattgag atttattcga aatacaatga180aagtttgcag atatgagata tgtttctaca aaataataac ttaaaactca actatatgct240aatgtttttc ttggtgtgtt tcatagaaaa ttgtatccgt ttcttagaaa atgctcgtaa300gctcgag 307&lt;210&gt;119&lt;211&gt;25&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(25)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;119gaattcccaa taataatcta cagcc 25&lt;210&gt;120&lt;211&gt;25&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(25)
&lt;223&gt;
&lt;400&gt;120aagcttccat gqcggccgga atttc 25&lt;210&gt;121&lt;211&gt;1020&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;食用番茄&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(1)..(1020)&lt;223&gt;编码β-羟化酶的核酸&lt;400&gt;121aagcttccat ggcggccgga atttcagcct ccgctagttc ccgaaccatt cgcctccgtc 60ataacccgtt tctcagtcca aaatccgcct caaccgcccc gccggttctg ttcttctctc120cgttaactcg caattttggc gcaattttgc tgtctagaag aaagccgaga ttggcggttt180gttttgtgct ggagaatgag aaattgaata gtactatcga aagtgagagt gaagtaatag240aggatcggat acaagtagag attaatgagg agaagagttt agctgccagt tggctggcgg300agaaattggc gaggaagaaa tcggagaggt ttacttatct tgtggcagct gtgatgtcta360gtttggggat tacttctatg gcgattttgg cggtttatta cagattttca tggcaaatgg420agggtggaga agtgcctttt tctgaaatgt tagctacatt cactctctcg tttggcgctg480ccgtaggaat ggagtactgg gcgagatggg ctcatagagc actatggcat gcttctttat540ggcacatgca cgagtcgcac catagaccaa gagaaggacc ttttgagatg aacgacgttt600
tcgccataac aaatgctgtt ccagctatag gtcttctttc ctacggtttc ttccataaag 660ggatcgtccc tggcctctgt ttcggcgctg gattggggat cacagtattt gggatggctt 720acatgttcgt tcacgatgga ctggttcata agagatttcc cgtagggcct attgccaacg 780tgccttactt tcggagggta gctgcagcac atcagcttca tcactcggac aaatttgatg 840gtgtcccata tggcttgttt ctaggaccta aggaattgga agaagtagga ggacttgaag 900agttagaaaa ggaagtcaac cgaaggatta aaatttctaa gggattatta tgatcaaaag 960atacgtctga taataataaa atgcgattgt atttaggctg tagattatta ttgggaattc1020&lt;210&gt;122&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(24)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;122gagctctagc gcaatcttat gtgg 24&lt;210&gt;123&lt;211&gt;22&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(22)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;123ccatggttct cacttctgta tg 22&lt;210&gt;124&lt;211&gt;1802&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;碧冬茄&lt;220&gt;
&lt;221&gt;启动子&lt;222&gt;(1)..(1802)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;124gagctctagc gcaatcttat gtggtacaaa tcttgattag tcgggaaaaa atgatgtggc 60cctacaaatg gttggaggat gggagatttg gctctatcta gagttatgtg gttgttgaag120catttggtta ctctctgctg tggtagttgg catatccaca ttgtctcctt ccacttttat180gacaattacg tgaaagttat gggttgtttt gtctattttt gtcgaggcct ttcttttcct240tccaggttgt tgaagatggt ccaattcgat tagaataatg ttttgagctt tagcatattc300tctctcgttt acacgattat agtaataatg atataggatg acagaagttg acacataaat360tttttattct ctccatttac tttaatccaa atctcaccta ccctaaactt ctttaatatg420
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&lt;210&gt;125&lt;211&gt;1033&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;拟南芥&lt;220&gt;
&lt;221&gt;启动子&lt;222&gt;(1)..(1033)&lt;223&gt;P76&lt;400&gt;125aggtgcatga ccaagtaaca atttgattcc tttccagcat aacgtcatgt tggttgcaaa 60aagaaggcaa agtagagcaa gcaagcaagc aaagcatttt tcttatttta tattttgttg120cggattccac cacccacttg aaaaattgac atgtcacaat gatttcgtat cctagtcttt180tattatttaa cactctcaca atcccattac tctacacctc tttcattaag tcaacacacg240gttttcaaaa atccactacc ctcccaccac ctagaatctt ttgttaccta ccaacaccct300cctttgttct ctttatatat tggtccaact aaatcaataa gggaaagcat ccttttggtt360ggaggaattg ctttcattct cactctttgt gtgttgatca atggactagc taataacaag420ttcctcctct atatatttca aaagaatgga acagaaacat aaacgaaaga cagagtacct480gatgttgatg attcattgtc tgtctggagc tcccaaatgc cttttatgct tacatattca540taaccaacaa cggctattaa ttataaacca aaaacacgaa ataagtttgt agcaaagtga600aattaggaat cttggagatg gatccattag tagtaggata ataggatatg atggaatttg660gttggggaac agtgataact tacgcttgct tccggcgccg ggaaagttgg aaaacctaca720aagtacagaa atggatctgg gccttgaagt gggcttttta ttaaagaaaa aaatacatct780ccgttatcaa tcaccatctt cttctatcta caaattaaag aaggtaacaa cagaacgtgg840
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&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(19)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;126tgccaaagta actctttat 19&lt;210&gt;127&lt;211&gt;19&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(19)
&lt;223&gt;
&lt;400&gt;127aggtgcatga ccaagtaac 19&lt;210&gt;128&lt;211&gt;996&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(1)..(996)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;128ggcacgagcc tctctctatt tttacacttc aatggcggca gcaattgctg tcccttgtag 60ctcaagacca tttggcttag gtcgaatgcg gttacttggt cataaaccca caaccataac120ttgtcacttc cccttttctt tttctatcaa atcatttacc ccaattgtta ggggcagaag180atgtactgtt tgttttgttg ccggtggcga cagtaatagt aacagtaata ataatagtga240cagtaatagt aataatccgg gtctggattt aaacccggcg gttatgaacc gtaaccgttt300ggttgaagaa aaaatggaga ggaaaaaatc ggaacgattt acttatcttg ttgcagctat360tatgtctact tttggaatta cttcaatggc ggttatggcg gtttattacc ggttttcatg420gcaaatggag ggtggagaaa ttccttatgt ggagatgttt ggtacatttg ctctctccgt480tggtgctgcg gtaggaatgg agtattgggc aagatgggct catgaggcac tatggcatgc540ttctttgtgg cacatgcatg agtcacacca taagccacga gaaggtccgt ttgagcttaa600
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&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(18)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;129atggaagctc ttctcaag 18&lt;210&gt;130&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;引物&lt;222&gt;(1)..(18)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;130accttaccta aaacattt 18&lt;210&gt;131&lt;21I&gt;1045&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;拟南芥&lt;220&gt;
&lt;221&gt;启动子&lt;222&gt;(1)..(1045)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;131gtcgacaggt gcatgaccaa gtaacaattt gattcctttc cagcataacg tcatgttggt 60tgcaaaaaga aggcaaagta gagcaagcaa gcaagcaaag catttttctt attttatatt120ttgttgcgga ttccaccacc cacttgaaaa attgacatgt cacaatgatt tcgtatccta180gtcttttatt atttaacact ctcacaatcc cattactcta cacctctttc attaagtcaa240cacacggttt tcaaaaatcc actaccctcc caccacctag aatcttttgt tacctaccaa300caccctcctt tgttctcttt atatattggt ccaactaaat caataaggga aagcatcctt360ttggttggag gaattgcttt cattctcact ctttgtgtgt tgatcaatgg actagctaat420
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1.通过培养遗传修饰的非人生物制备酮类胡萝卜素的方法，所述遗传修饰的生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性及修饰的β环化酶活性，而其修饰的β环化酶活性是由于β环化酶造成，其含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
2.如权利要求1的方法，其中使用野生型具有酮酶活性而遗传修饰使其酮酶活性相对于野生型增加的非人生物。
3.如权利要求2的方法，其中通过提高编码酮酶的核酸相对于野生型的基因表达来增加酮酶活性。
4.如权利要求3的方法，其中通过向生物中插入编码酮酶的核酸来增加基因表达。
5.如权利要求4的方法，其中插入的编码酮酶的核酸所编码的酮酶含有SEQ ID NO4氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO4序列至少有70％的同一性。
6.如权利要求1的方法，其中使用野生型不具有酮酶活性而遗传修饰使其相对于野生型造成酮酶活性的非人生物。
7.如权利要求6的方法，其中使用转基因表达酮酶的遗传修饰生物。
8.如权利要求6或7的方法，其中通过向生物中插入编码酮酶的核酸来造成基因表达。
9.如权利要求8的方法，其中插入的核酸编码的酮酶含有SEQ ID NO4氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO4序列至少有70％的同一性。
10.如权利要求5或9的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO3的核酸。
11.如权利要求1至10中任一项的方法，其中使用野生型已经具有β环化酶活性而遗传修饰使其β环化酶活性相对于野生型增加的生物。
12.如权利要求11的方法，其中通过提高编码β环化酶的核酸相对于野生型的基因表达来增加β环化酶活性，所述β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
13.如权利要求12的方法，其中通过向生物中插入编码β环化酶的核酸来增加基因表达，所述β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
14.如权利要求1至10中任一项的方法，其中使用野生型不具有β环化酶活性而遗传修饰使其相对于野生型造成β环化酶活性的生物。
15.如权利要求14的方法，其中使用转基因表达β环化酶的遗传修饰生物，所述β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
16.如权利要求14或15的方法，其中通过向生物中插入编码β环化酶的核酸来造成基因表达，所述β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
17.如权利要求13或16的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO1的核酸。
18.如权利要求1至17中任一项的方法，其中使用相对于野生型额外具有增加的或造成的羟化酶活性的非人生物。
19.如权利要求18的方法，其中通过增加或造成编码羟化酶的核酸相对于野生型的基因表达来额外增加或造成羟化酶活性。
20.如权利要求19的方法，其中通过向生物中插入编码羟化酶的核酸来增加或造成基因表达。
21.如权利要求20的方法，其中插入的编码羟化酶的核酸，其编码的羟化酶含有SEQ ID NO6氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO6序列至少有70％的同一性。
22.如权利要求21的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO5的核酸。
23.如权利要求1至22中任一项的方法，其中使用相对于野生型额外具有增加的或造成的选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性以及MinD活性中至少一种的生物。
24.如权利要求23的方法，其中通过增加选自编码HMG-CoA还原酶的核酸、编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸、编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸、编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸、编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码八氢番茄红素合酶的核酸、编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸、编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸、编码crtISO蛋白的核酸、编码FtsZ蛋白的核酸、编码MinD蛋白的核酸中至少一种相对于野生型的基因表达来额外增加或造成至少一种活性。
25.如权利要求24的方法，其中通过向非人生物中插入选自编码HMG-CoA还原酶的核酸、编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸、编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸、编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸、编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸、编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸、编码八氢番茄红素合酶的核酸、编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸、编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸、编码crtISO蛋白的核酸、编码FtsZ蛋白的核酸、编码MinD蛋白的核酸中至少一种来增加或造成至少一种核酸的基因表达。
26.如权利要求25的方法，其中插入编码HMG-CoA还原酶的核酸，其编码的HMG-CoA还原酶含有SEQ ID NO8氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO8序列至少有20％的同一性。
27.如权利要求26的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO7的核酸。
28.如权利要求25的方法，其中插入编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶的核酸，其编码的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸酯还原酶含有SEQ ID NO10氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO10序列至少有20％的同一性。
29.如权利要求28的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO9的核酸。
30.如权利要求25的方法，其中插入编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸，其编码的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶含有SEQ ID NO12氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO12序列至少有20％的同一性。
31.如权利要求30的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO11的核酸。
32.如权利要求25的方法，其中插入编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸，其编码的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶含有SEQ IDNO14氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO14序列至少有20％的同一性。
33.如权利要求32的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO13的核酸。
34.如权利要求25的方法，其中插入编码异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶的核酸，其编码的异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶含有SEQ ID NO16氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO16序列至少有20％的同一性。
35.如权利要求34的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO15的核酸。
36.如权利要求25的方法，其中插入编码牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸，其编码的牻牛儿基二磷酸酯合酶含有SEQ ID NO18氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO18序列至少有20％的同一性。
37.如权利要求36的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO17的核酸。
38.如权利要求25的方法，其中插入编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸，其编码的法呢基二磷酸酯合酶含有SEQ ID NO20氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQID NO20序列至少有20％的同一性。
39.如权利要求38的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO19的核酸。
40.如权利要求25的方法，其中插入编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸，其编码的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶含有SEQ ID NO22氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO22序列至少有20％的同一性。
41.如权利要求40的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO21的核酸。
42.如权利要求25的方法，其中插入编码八氢番茄红素合酶的核酸，其编码的八氢番茄红素合酶含有SEQ ID NO24氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO24序列至少有20％的同一性。
43.如权利要求42的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO23的核酸。
44.如权利要求25的方法，其中插入编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸，其编码的八氢番茄红素去饱和酶含有SEQ ID NO26氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO26序列至少有20％的同一性。
45.如权利要求44的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO25的核酸。
46.如权利要求25的方法，其中插入编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸，其编码的ζ-胡萝卜素去饱和酶含有SEQ ID NO28氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQID NO28序列至少有20％的同一性。
47.如权利要求46的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO27的核酸。
48.如权利要求25的方法，其中插入编码crtISO蛋白的核酸，其编码的crtISO蛋白含有SEQ ID NO30氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO30序列至少有20％的同一性。
49.如权利要求48的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO29的核酸。
50.如权利要求25的方法，其中插入编码FtsZ蛋白的核酸，其编码的FtsZ蛋白含有SEQ ID NO32氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO32序列至少有20％的同一性。
51.如权利要求50的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO31的核酸。
52.如权利要求25的方法，其中插入编码MinD蛋白的核酸，其编码的MinD蛋白含有SEQ ID NO34氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO34序列至少有20％的同一性。
53.如权利要求52的方法，其中插入含有序列SEQ ID NO33的核酸。
54.如权利要求1至53中任一项的方法，其中在培养后收集遗传修饰的生物并随后从生物中分离酮类胡萝卜素。
55.如权利要求1至54中任一项的方法，其中使用起始生物可天然产生或能够通过遗传互补或代谢途径的再调节生产类胡萝卜素的生物。
56.如权利要求1至55中任一项的方法，其中使用的生物是微生物或植物。
57.如权利要求56的方法，其中使用的微生物为细菌、酵母、藻类或真菌。
58.如权利要求57的方法，其中微生物选自埃希氏杆菌属、欧文氏菌属、农杆菌属、黄杆菌属、产碱菌属、副球菌属、念珠藻属、集胞藻属蓝细菌、假丝酵母属、酵母属、汉逊酵母属、法夫酵母属、毕赤酵母属、曲霉属、木霉属、阿舒囊霉属、脉孢菌属、布拉霉属、须霉属、镰孢霉属、红球藻属、三角褐指藻、团藻属或杜氏藻属。
59.如权利要求56的方法，其中使用的生物为植物。
60.如权利要求59的方法，其中使用的植物选自苋科、石蒜科、夹竹桃科、紫菀科、凤仙花科、秋海棠科、小檗科、十字花科、大麻科、忍冬科、石竹科、藜科、菊科、葫芦科、十字花科、大戟属、豆科、龙胆科、牻牛儿苗科、禾本科、Illiaceae、唇形科、薄荷科、豆科、百合科、亚麻科、山梗菜属、锦葵科、木犀科、兰科、罂粟科、白花丹科、禾本科、花荵科、报春花科、毛茛科、蔷薇科、茜草科、玄参科、茄科、旱金莲科、伞状花科、毛蕊花科、葡萄科或紫罗兰科。
61.如权利要求60的方法，其中使用的植物选自万寿菊属、万寿菊、孔雀草、金合欢属、乌头属、侧金盏花属、阿尼菊属、耧斗菜属、紫菀属、黄芪属、紫葳属、金盏花属、驴蹄草属、风铃草属、美人蕉属、矢车菊属、桂竹香属、茼蒿属、柑桔属、还阳参属、番红花属、南瓜属、金雀儿属、Delonia属、翠雀属、石竹属、康乃馨属、多榔菊属、花菱草属、连翘属、Fremontia属、勋章菊属、钩吻属、染料木属、龙胆属、老鹳草属、非洲菊属、路边青属、银桦属、堆心菊属、向日葵属、细辛属、独活属、木槿属、赛菊芋属、金丝桃属、黄金菊属、凤仙花属、鸢尾属、蓝花楹属、棣堂属、毒豆属、山黧豆属、猫耳草属、百合属、亚麻属、百脉根属、番茄属、珍珠菜属、Maratia、苜蓿属、沟酸浆属、水仙属、月见草属、木犀属、碧冬茄属、石楠属、酸浆属、牧根草属、委陵草属、火棘属、毛茛属、杜鹃花属、蔷薇属、金光菊属、千里光属、蝇子草属、松香草属、Sinapsis、花楸属、鹰爪豆属、黄钟花属、蝴蝶草属、婆罗们参属、金莲花属、旱金莲属、郁金香属、款冬属、荆豆属、堇菜属或百日草属植物。
62.如权利要求1至61中任一项的方法，其中酮类胡萝卜素选自虾青素、角黄素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3’-羟基海胆酮、金盏花玉红质和金盏花黄质。
63.遗传修饰的非人生物，其中该遗传修饰，A.对于已经具有酮酶活性的野生型生物，与野生型相比增加其酮酶活性，且B.对于不具有酮酶活性的野生型生物，与野生型相比造成酮酶活性，且其中该遗传修饰C.对于已经具有β环化酶活性的野生型生物，与野生型相比增加其β环化酶活性，且D.对于不具有β环化酶活性的野生型生物，与野生型相比造成β环化酶活性，而C中增加的β环化酶活性或D中造成的β环化酶活性源于以下β环化酶，该β环化酶含有SEQ ID NO2氨基酸序列或对该序列替换、插入或删除氨基酸而衍生的序列，后者在氨基酸水平上与SEQ ID NO2序列至少有70％的同一性。
64.如权利要求63的遗传修饰的生物，所述生物的起始生物可天然产生或能够通过遗传互补产生类胡萝卜素。
65.如权利要求63或64的遗传修饰的生物，选自微生物或植物。
66.如权利要求65的遗传修饰的生物，其中微生物选自细菌、酵母、藻类或真菌。
67.如权利要求66的遗传修饰的生物，其中微生物选自埃希氏杆菌属、欧文氏菌属、农杆菌属、黄杆菌属、产碱菌属、副球菌属、念珠藻属、集胞藻属蓝细菌、假丝酵母属、酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、曲霉属、木霉属、阿舒囊霉属、脉孢菌属、布拉霉属、须霉属、镰孢霉属、红球藻属、三角褐指藻、团藻属或杜氏藻属。
68.如权利要求65的遗传修饰的生物，其中使用的植物选自苋科、石蒜科、夹竹桃科、紫菀科、凤仙花科、秋海棠科、小檗科、十字花科、大麻科、忍冬科、石竹科、藜科、菊科、葫芦科、十字花科、大戟属、豆科、龙胆科、牻牛儿苗科、禾本科、Illiaceae、唇形科、薄荷科、豆科、百合科、亚麻科、山梗菜属、锦葵科、木犀科、兰科、罂粟科、白花丹科、禾本科、花荵科、报春花科、毛茛科、蔷薇科、茜草科、玄参科、茄科、旱金莲科、伞状花科、毛蕊花科、葡萄科及紫罗兰科。
69.如权利要求68的遗传修饰的生物，其中使用的植物选自万寿菊属、万寿菊、孔雀草、金合欢属、乌头属、侧金盏花属、阿尼菊属、耧斗菜属、紫菀属、黄芪属、紫葳属、金盏花属、驴蹄草属、风铃草属、美人蕉属、矢车菊属、桂竹香属、茼蒿属、柑桔属、还阳参属、番红花属、南瓜属、金雀儿属、Delonia属、翠雀属、石竹属、康乃馨属、多榔菊属、花菱草属、连翘属、Fremontia属、勋章菊属、钩吻属、染料木属、龙胆属、老鹳草属、非洲菊属、路边青属、银桦属、堆心菊属、向日葵属、细辛属、独活属、木槿属、赛菊芋属、金丝桃属、黄金菊属、凤仙花属、鸢尾属、蓝花楹属、棣堂属、毒豆属、山黧豆属、猫耳草属、百合属、亚麻属、百脉根属、番茄属、珍珠菜属、Maratia、苜蓿属、沟酸浆属、水仙属、月见草属、木犀属、碧冬茄属、石楠属、酸浆属、牧根草属、委陵草属、火棘属、毛茛属、杜鹃花属、蔷薇属、金光菊属、千里光属、蝇子草属、松香草属、Sinapsis、花楸属、鹰爪豆属、黄钟花属、蝴蝶草属、婆罗们参属、金莲花属、旱金莲属、郁金香属、款冬属、荆豆属、堇菜属或百日草属植物。
70.如权利要求63至69中任一项的遗传修饰生物作为饲料或食品的用途。
71.如权利要求63至69中任一项的遗传修饰生物在生产含酮类胡萝卜素提取物或生产饲料添加剂或食品添加剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及通过培养遗传修饰的生物来制备酮类胡萝卜素的方法，所述遗传修饰的生物与野生型相比具有修饰的酮酶活性及修饰的β环化酶活性。本发明也涉及经过遗传修饰的生物和它们作为食品和饲料的用途，以及它们在生产酮类胡萝卜素提取物中的用途。
文档编号A23K1/00GK1863922SQ200480029068
公开日2006年11月15日 申请日期2004年7月31日 优先权日2003年8月18日
发明者R·弗拉赫曼, C·R·朔普费尔, K·赫伯斯, I·孔策, M·绍尔, M·克勒布萨特尔, T·卢克, D·弗斯特, A－M·皮菲弗尔 申请人:太阳基因有限公司