专利名称：一种防治植物细菌病害的生物制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治植物细菌病害的生物制剂及其应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
植物细菌性病害是仅次于真菌性病害，危害大、损失重、分布较广的世界性植物病害之一，尤其是细菌性青枯病是一种世界性的土传病害，危害番茄、辣椒、烟草、马铃薯等400余种经济作物，目前尚无农药可防治。对于多种作物的软腐病、水稻白叶枯病、红掌细菌性疫病等，目前国内市场上只有大剂量的化学农药可以防治，但一些病原细菌对生产上常用的农用链霉素表现抗药性，因此，农用链霉素的防病效果较差，另外，由于化学农药使用和残留量超过国际标准，出口农产品纷纷遭到拒绝和退货。
随着我国人民生活水平的提高，蔬菜等农产品的数量问题已经不是大家考虑的主要问题，而其质量特别是农药残留问题已经引起了几乎全体国民的忧患意识。目前对于细菌性害国内外主要采取的保守控制措施为进行种薯(种子)消毒，拔除病株，加强检疫和采用卫生洁园等农业措施，控制进一步传播。因此，研究开发高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治植物细菌病害的生物制剂，已经是我国农业发展中迫在眉睫的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，通过抗生素溶杆菌(Lysobacterantibioticus)13-1的研究，开发出一种高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治植物细菌病害的生物制剂。
本发明采用的细菌是抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticu5)13-1，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2005年9月13日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.1456。
抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)13-1，系本发明人于2002年发现的一个国内外未见报道，可用于植物细菌病害生物防治的新菌株。
本发明的生产菌株13-1，分离自昆明市郊土壤，经形态学、培养性状、常规生理生化和Biolog全自动鉴定系统测定，以及16s rRNA和16S-23S rRNAITS序列分析，该生防细菌为抗生素溶杆菌Lysobacter antibioticus的一个新菌株。16s rRNA序列(Genebank No.DQ188260)分析与抗生素溶杆菌Lysobacter antibioticusDSM 2044菌株(Genebank No.AB019582)同源性达99％，但该菌株的16S-23S rRNA ITS序列(GenebankNo.DQ188259)分析在Genebank中未发现与溶杆菌属内不同种相似的同源性序列。该菌株具有以下特征(1)菌落圆形，不透明稀液状，培养初期为暗黄色，后期转为棕褐色菌落，菌体长杆状；(2)该菌株抑菌谱广、抑菌能力和作物根际定殖能力强，该菌株可在马铃薯、魔芋等作物的根际定殖。对重要作物的病原细菌Ralstonia Solanacearum，Pseudomonas syringae，Erwinia carotovora，Xanthomonas属中的X.oryzae pv.oryzae，X.axonopodis pv.diffenbachiae等均有显著抑制作用，抑菌圈直径平均为11.0-20.0mm，同时还对真菌(镰孢菌Fusarium spp.等)亦具有抑菌作用。(3)具有以下生理生化特征革兰氏染色阴性，氧化酶和过氧化氢酶阳性，硝酸盐不还原，明胶液化、淀粉和吐温80不水解，吲哚和精氨酸双水解酶和脲酶阴性。能利用葡萄糖产酸，可水解酪蛋白；常规和Biolog生理生化特征能利用N-乙酰-D-半乳糖、N-乙酰-D-葡糖胺、D-甘露糖、α-D-葡萄糖、D-海藻糖、柠檬酸、3-羟基乙酸、α-丁酮酸、α-酮戊二酸、丙酸、琥珀酸、溴琥珀酸、丙氨酰胺、L-脯氨酸、L-苏氨酸；不能利用L-丝氨酸、L-组氨酸、阿拉伯糖、麦芽糖、密二糖、组氨酸、纤维二糖等。该菌株在糖原、麦芽糖、α-D-葡萄糖、柠檬酸盐等项目上与Lysobacter antibioticus DSM 2044菌株具有差异。(4)本发明的生物制剂对多种重要细菌病害具有显著的防治效果，如Ralstonia solanacearum引起的植物青枯病，Erwinia carotovora supsp.carotovora等引起的作物(如魔芋、马蹄莲等)细菌性软腐病，Xanthomonas属病原细菌引起的作物细菌性病害如水稻白叶枯病等。同时具备了工业化生产的基本性状。
本发明按常规方法制备。即将抗生素溶杆菌13-1菌株，通过液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过液体发酵生产，加入润湿剂、展着剂，或与吸附载体按一定比例混合后，经过滤、浓缩、粉碎和凉干，制备成液剂或可湿性粉剂。
本发明的生物制剂的具体制备过程如下一.液体发酵制剂生产1.供试菌株抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)13-1菌株，由云南农业大学云南省植物病理重点实验室提供。
2.试管种培养(以下均为重量百分比)将13-1菌株接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为1000毫升NA培养基蛋白胨5g，蔗糖10克，酵母粉1g，牛肉浸膏3g，琼脂17-20g(培养基用)，蒸馏水(补足1000ml)。22-26℃下培养24-48h，获得试管种。
3.菌种摇床扩大培养将斜面种子接种茄瓶斜面培养基上，培养基为NA培养基，配方前述试管种培养2相同。24-28℃下培养24-48h，获得茄瓶种子，供发酵生产用。
4.中试液体发酵生产工艺流程如下试管菌种→茄瓶种子→孢子悬浮液→发酵罐(无菌空气，培养液)→发酵液→填充罐(轻质碳酸钙)→板框压滤机(弃去滤液)→滤饼→调浆→加入润湿剂、展着剂等→60℃烘干→粉碎→菌粉→质量检查。
具体发酵生产过程如下(1)茄瓶斜面种子液的制备将已培养好的茄瓶斜面上的菌苔，用灭菌水洗下，制备细菌悬浮液。
(2).接种采用茄瓶种子，将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐，操作严格，避免污染。升压时罐压不能超过1.5/平方厘米。
(3)液体发酵生产a.发酵罐培养基黄豆粉2％，葡萄糖0.3％，蛋白胨0.2％，淀粉3％、碳酸钙0.2％，鱼粉0.5％，花生油0.1％，硫酸铵0.05％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，磷酸氢二钾0.03％，消泡剂0.01％，NaOH 600g。灭菌前pH8.5。
b.灭菌锅炉的总蒸汽压应在4-5公斤/平方厘米，以保证各管道的蒸汽压力。管道、空气过滤器、发酵罐及培养基的灭菌，均按生产工艺标准进行。
C.发酵条件的控制罐温发酵罐的罐温均控制在29±1℃，通过插入培养基的温度计测量，以夹层内通入冷却水或热水的方法进行调节。
罐压发酵罐的罐压控制在0.06MPa，通过无菌空气入口和废气排放口进行调节。
搅拌发酵罐的搅拌速度为200转/分钟。
通风量8至15m3/h(根据细菌不同培养时期产气泡量进行调节)。
抽样检查每2小时自取样管取样1次，测定pH，并涂片以结晶紫染色镜检菌体形态、有无杂菌的污染等，发酵罐放罐时镜检计数，并用培养基平板方法进行活菌的计数。
培养周期发酵罐的培养周期约为36-48小时，当培养基中的菌数不再增加时即可停止培养，立即放罐。
液体发酵制剂经平板计数测定含菌量，含菌量达180亿CFU/ml，供田间防治病害用。
2.固体生物制剂的生产首先进行细菌的液体发酵生产(同前述一相同)。然后经加入填充剂、板框过滤、打浆、干燥、粉碎，制成可湿性粉剂，供实验用。具体过程如下具体加入填充剂将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入硅藻土(轻质碳酸钙)作为填充剂，加入后搅拌30分钟。
填充剂硅藻土(轻质碳酸钙)的加入量(公斤)＝〖发酵液菌数(亿/毫升)×放罐体积(升)×收率〗/成品菌数—发酵液中的残存物(公斤)。
板框过滤用2公斤/平方厘米的压力，将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤，压力应随时调节，使滤液中的含菌量不超过0.2亿/毫升。
打浆将滤饼卸入打浆罐，按加入碳酸钙量的8％加入浓乳100号，或按3％加入SDS，加入适量的滤液均匀搅拌30分钟。
干燥在温度60℃以下的烘干房内通风干燥至含水量5％-8％。
粉碎粉碎时出料温度不能超过60℃，以防止菌体失活。
成品质量指标测定含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(Q/KWL02-2003)进行，含菌量18亿/克，其余各项指标均符合标准。
具体实施例方式本发明的制剂主要防治对象为作物青枯病、魔芋软腐病、水稻白叶枯病等。本制剂可通过常规的灌根、浸种、喷雾等方式施用。本发明的制剂已在云南昆明市郊、曲靖富源和红河州蒙自等地的温室和田间小区防效试验，证明该生防制剂防效显著、稳定，可以有效地解决长期困扰青枯病、细菌性软腐病等防治难题。对青枯病的防效达94.3％～95.0％，细菌性软腐病防效达67.64-79.00％，对水稻白叶枯病的防治效果达到69.41-78.33％。
本生防制剂可以与其他的杀细菌农药、植物生长调节剂混合使用，但必须保证所混药剂对本发明采用的抗生素溶杆菌无副作用。
本发明的细菌生防制剂一般在作物播种或病害始发期施用。方法是播种前，采用发酵制剂与种球或种子浸(拌)种后，凉干施入土壤中，或在病害始发期将本制剂通过灌根施入作物根际周围或喷雾施用。对植物细菌病害发生严重地区可在作物生长过程中追施1至2次。
本发明的生防制剂具有明显稳定的防治效果，综合性状好，易于工业化生产。
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实例一生防制剂对马铃薯青枯病的药效试验1、试验用药剂按液体发酵方法制备；以未接种的培养基3600转离心20分钟后过滤作为对照。
2、青枯病菌菌悬液体制备青枯病菌菌株Tb23由中国农科院植物保护研究所何礼远教授提供。采用TTC培养基进行培养，28℃培养48-72h，接种是将病菌从固体培养基上用无菌水洗下制成菌悬液，在摇床上摇匀。接种时的浓度用分光光度计测定吸收值，OD(600nm)＝0.1，浓度相当于108CFU/ml。
3、试验方法和结果分析分为预防和治疗两组试验。预防控病试验方案为将马铃薯于2003年3月1日播种。每处理3次重复。在马铃薯成株期用发酵液体菌剂，生长期使用时，对水100、250、500倍灌根处理(2003.4.25)，3d后再用青枯病菌悬液灌根(2003.4.29)。并设清水对照处理和病原菌(Tb23)处理。观察马铃薯的发病情况，在用病原菌灌根后14d、25d分别进行调查，记载各个处理的病情指数、发病率，并计算防效。治疗控病试验方法同上。不同之处是先用病原菌对马铃薯进行灌根处理，3d后再用生防菌剂的菌悬液进行灌根。在用病原菌灌根后14d、25d分别进行调查。所设对照、观察记载方法同上，每处理重复三次。
发病率％＝发病株(叶)数×100/调查总株(叶)数病情指数＝∑(各级病株(叶)数×该病级值)×100/调查总株(叶)数×最高级值防效％＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数马铃薯青枯病病情调查分级标准(病情分为6级)0级没有症状；I级1-2个叶片萎蔫；II级3片至全株1/3叶片萎蔫；III级全株1/2叶片萎蔫；IV级全株3/4叶片萎蔫；V级整株植物萎蔫或死亡。
4、试验结果结果表明液体发酵制剂对马铃薯青枯病具有较好的防治效果，其中预防控病效果好于治疗控病效果(表1)。预防控制试验中14d测定的结果可知，病原菌处理的病株率达100％，病情指数最高为70.0；液体菌剂处理的病情指数为0，发病率为0；25d调查结果显示液体菌剂处理的马铃薯病情指数在5.0左右，植株发病率为14.3％至25.0％，防效为94.3％-95.0％。治疗控病试验中，14d测定的结果可知，对照的病情指数为70.0，发病率为100％，液体菌剂处理的平均病情指数18.3，最低病情指数为10.0，平均防效为73.8％，最高防效为85.7％。25d调查结果显示，液体菌剂处理平均防效仍达到52.5％，最高防效为62.5％。
表1液体发酵制剂对马铃薯青枯病的防治效果
注同一栏中不同小写英文字母表示差异显著水平达0.05。
实例二生防制剂对魔芋软腐病田间药效试验1、实验地点及时间试验地点富源县竹园镇新街村委会补陆村试验时间2005年7月6日至2005年8月15日2.试验材料及方法2.1、供试药剂生防菌13-1可湿性粉剂(固体制剂)，对照杀菌剂为百菌清2.2、供试作物魔芋2.3、防治对象魔芋细菌性软腐病2.4、试验方法试验设5个处理，3次重复，共15个小区。小区面积不小于60平方米，随机排列。施药方法采用浇根法。每株魔芋根部浇药液50毫升，发病初期施第一次药，共施药2次，间隔7天。
2.5、调查方法在魔芋发病后期，对试验小区进行病害调查.根据魔芋软腐病地上部分症状特点及病情发展趋势，我们将病斑分为环绕型和纵向型，前者病斑环绕叶柄，病情发展快.会很快引起复叶倒伏，危害性大；后者病斑只在叶柄一侧，多沿维管束纵向扩展，后期向横向扩展后导致整个叶柄腐烂。
魔芋软腐病的分级标准(病情分为5级)
0级无症状；1级叶柄一侧有2cm以下小型水浸状病斑，或病斑长占叶柄总长度的1/10以下，同侧叶片轻度黄化；2级叶柄一侧有2cm以上病斑，或病斑长占叶柄总长度的1/10--5/10，同侧叶片黄化；3级病斑呈环绕型，或纵向型病斑长度占叶柄总长的5/10以上，叶片大部分黄化或部分枯死；4级全叶枯黄或倒伏腐烂。
若整个复叶从顶端开始黄化，叶柄与块茎连接处有软腐症状，为块茎发病，病情归入3级。
3、实验结果及分析从表2可以看出生防菌13-1可湿性粉剂对魔芋软腐病防治效果明显，其中稀释250倍处理防治效果最好，达到79％.灌根500倍和1000倍的处理，对魔芋软腐病控制效果分别为70.57％和67.64％。与稀释500倍百菌清相比，施用生防菌13-1的各个处理(250倍，500倍，1000倍，)的病株率分别比其低1.64％，2.01％，1.55％，病情指数比百菌清低4.22、3.53、3.29，防治效果比其高52.75％，44.32％，41.39％，显示了该生防制剂具有较好的防效，具备了生产上大量推广的基本条件。
本次施药方法采用浇根法。研究中发现，处理的魔芋植株，病原菌从茎基部侵入的机率显著降低，但仍发现一些田间地上部分腐烂植株，主要从叶片等地上部位侵入。因此，今后在施药方法上应用浇根法和叶面喷雾法结合使用，达到有效控制魔芋软腐病的目的。
表213-1可湿性粉剂对魔芋软腐病田间防治效果
实施例三生防制剂对水稻白叶枯病的药效试验1、实验材料与方法1.1、供试药剂生防菌13-1液剂1.2、供试作物水稻1.3、防治对象水稻白叶枯病1.4.实验地点云南省红河州农业科学研究所(蒙自)水稻实验田，肥力中等，栽种感白叶枯病品种黄壳糯，小区为单行区，面积33平方米，每处理设3个重复，随机排列，共9个小区，四周设保护行，按优质水稻栽培措施规范化管理。
1.5病原菌和生防菌剂的制备水稻白叶枯病菌株53的制备菌株在固体培养基上培养36-48h(28℃-30℃)接种是将病菌从固体培养基上用无菌水洗下制成菌悬液，在摇床上摇匀。接种时的浓度用分光光度计测定吸收值，OD(600nm)＝0.5，浓度相当于108-109CFU/ml。1.6接种方法先将生防菌13-1液剂喷雾接种在水稻叶片上(孕穗期)，3个重复，早、晚各喷一次并保温、保湿2天。4天后，将配好的水稻白叶枯病菌53喷雾接种到喷过生防菌13-1的水稻上，早、晚各喷一次并保温、保湿2天。同时设只喷白叶枯病菌株53的对照(CK)。21天后调查，调查病叶数，病叶级值、总叶数，计算发病率、病情指数。调查记载和分级标准如表3表3喷雾接种的病级标准
发病率％＝发病株(叶)数×100/调查总株(叶)数病情指数＝∑(各级病株(叶)数×该病级值)×100/调查总株(叶)数×最高级值防效％＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数。
2.试验结果与分析试验结果详见表4，结果表明该发明制剂对水稻白叶枯病有良好的防治效果，施用药剂三个重复病叶率和病情指数与对照相比，均有显著的降低，对水稻白叶枯病的防治效果达到69.41-78.33％。显示其潜在的应用开发前景。
表4可湿性粉剂剂对水稻白叶枯病的防治效果
权利要求
1.一种防治多种植物细菌病害的生物制剂，由生产菌株和辅料按液体发酵或固体发酵生产方法制备，其特征在于该菌剂的生产菌株为抗生素溶杆菌(Lysobacterantibioticus)13-1，该菌株已于2005年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO1456。
2.权利要求1所述的生物制剂，其特征在于该生物制剂对多种作物细菌性害如马铃薯青枯病、魔芋软腐病、水稻白叶枯病具有广谱控病作用，可用于多种作物病害生物防治。
全文摘要
本发明涉及一种防治植物细菌病害的生物制剂及其应用，属生物农药技术领域。该生物制剂按常规方法制备。其生产菌株为抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)13－1，已于2005年9月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No1456。发明的菌株具有以下显著特点(1)菌落圆形，培养后期为棕褐色；(2)该菌株抑菌谱广、抑菌能力强，能在马铃薯、魔芋等作物的根际定殖。本发明将该菌株，通过液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过液体发酵生产，加入润湿剂、展着剂等制备成液剂，或与吸附载体按一定比例混合后，经过滤、浓缩、粉碎和晾干，制备成可湿性粉剂。本发明对多种作物细菌病害具有明显稳定的防治效果，综合性状好，易于工业化生产。
文档编号A01P3/00GK1771810SQ200510011078
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者姬广海, 张世光, 魏兰芳, 何月秋, 李成云, 吴亚鹏 申请人:云南农业大学