专利名称：海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋生物技术领域，是涉及一种大型经济藻类—海带种质保存技术。
背景技术：
海带(Laminaria japonica Aresch)是中国重要的经济藻类，养殖产量和规模连续多年居世界首位，丰富的种质资源是渔业生产的重要物质基础，保护和利用好海带种质资源将为提高海带品种水平、实现海带良种化生产提供重要保证，海带生活史分两个明显的世代阶段孢子体世代和配子体世代，配子体世代是海带的单倍体阶段，游孢子是配子体世代的开始阶段，种海带成熟后，放散游孢子，游孢子经2小时左右的游动，或附着或悬浮形成胚孢子，胚孢子逐渐萌发成配子体。传统的保种技术就是在该阶段将雌配子体(female gametophyte)和雄配子体(male gametophyte)单个分离培养，形成无性繁殖系(clone)，通过继代培养无性系的方法保存种质。但是，这种传统保存技术具有明显的不足(1)液体培养是唯一的保存途径，手段单一，限制了保存的规模和效率；(2)液体培养保存一般需要在半月内更新一次培养液，工作量大，操作繁琐，频繁操作也增加了种质污染及混杂的机会；(3)采孢子前无法对种海带进行无菌处理，整个保存过程都在有菌条件下，不能彻底杜绝微生物尤其杂藻的污染；(4)培养中细胞形态异常、单性生殖等现象时有发生，培养因子有待进一步优化。因此，目前的保种技术还不能作到种质永久保存，无法完全排除混杂、污染、变异的可能性。
藻类种质超低温保存的研究开始于20世纪60年代，80年代以后发展速度较快，从淡水藻类到海水藻类，从微藻类到大型藻类，从非经济藻类到经济藻类都给予了较多的关注。藻类超低温冷冻保存的方法主要是两步冷冻法(two-step freezing)，该方法首先在保存材料中加入抗冻保护剂，进行预冻，再将预冻过的材料投入液氮中快速冷冻，目前已成为藻类种质冷冻保存的常规方法；超低温冷冻保存技术的应用受到限制的主要原因在于冷冻操作程序的建立主要靠经验性的实验结果，适合一种藻类的保存技术对另一种藻类可能完全不适用。超低温两步法冻存在大型经济藻类中使用的种类有紫菜和裙带菜，有关海带游(胚)孢子超低温保存的方法目前仍为一个空白。
发明内容
本发明的目的在于改进已有的继代培养保存无性系技术的不足，而提供一种用于海带孢子保存、简便易行、可大量保存种质材料、成活率较高的海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法。
本发明的目的是这样实现的，海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法，其特点是该方法包括以下步骤材料处理、平衡、快速冻存和复苏。
材料处理是选择孢子囊色泽呈墨绿色、表面有白色的薄膜开始脱落的海带，剪取带有孢子囊的叶片，用脱纸棉和消毒海水反复搽洗十余遍，置于烧杯中，倒入5-10℃低温消毒海水，放散孢子，孢子浓度达到50/160×以上时，用300目筛绢滤出杂质和黏液获得孢子悬液。
平衡是将孢子悬液与消毒海水配制的20％DMSO按1∶1比例混合，在0-4℃冰箱中平衡15min。
快速降温冻存是将平衡后的孢子混合液装入1.5ml冻存管中，冻存管直接投入液氮。
复苏是超低温冷冻后，将冻存管从液氮中取出，迅速移到39℃恒温水浴中快速震荡，至最后一粒冰晶消失倒入培养液中培养。
本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果本发明采用超低温快速冷冻保存海带游(胚)孢子，改变了一个器皿只能保存一个株系的传统方法，可以在一个器皿中保存一个品(种)系中的多个株系，提高了效率；海带游(胚)孢子在超低温(-196℃)状态下代谢完全停止，生命以静止的形式可以在这种状态下长期保存，解冻后又可恢复其原有的生物活性和遗传特性。海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法简单易行，有效地解决了海带种质保存中污染、混杂、变异的问题而保持遗传稳定，可望实现海带种质的永久保存。本发明方法的最大特点一是可以保持品种的遗传稳定，二是简便易行，三是可大量保存种质材料与传统保存方法相比，遗传稳定；与游(胚)孢子逐级冷冻保存法相比简便易行，冷冻操作只有一步，即投入液氮，没有中间环节；与无性系超低温冻存相比可大量保存种质材料，一次操作可保存一个品(种)系中的多个株系，无性系超低温保存一次操作只能保存一个株系。本发明材料的获得受季节限制，只有在海带成熟季节才能获得。因此海带游(胚)孢子超低温快速冷冻保存法、海带游(胚)孢子超低温逐级冷冻保存法、海带丝状体程序降温冷冻保存法以及海带丝状体逐级冷冻保存法四种保存方法各有价值、有同时存在的必要。
四、具体实施方案下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例，海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法，是通过材料处理、平衡、快速降温冷冻和复苏来实现的，材料处理是选择孢子囊色泽呈墨绿色、表面有白色的薄膜开始脱落的海带，剪取5×5cm带有孢子囊的叶片，用脱纸棉和消毒海水反复搽洗十余遍，置于500ml烧杯中，倒入8℃低温消毒海水，放散孢子。孢子浓度达到80-100/160×时，用300目筛绢滤出杂质和黏液获得孢子悬液；平衡是将孢子悬液与消毒海水配制的20％DMSO按1∶1比例混合，在0-4℃冰箱中平衡15min；冻存是将平衡后的孢子与保护剂混合液装入1.5ml冻存管(cryotubes)中，冻存管直接投入液氮；复苏是超低温冷冻后，将冻存管从液氮中取出，迅速移到39℃恒温水浴中快速震荡，至最后一粒冰晶消失倒入培养液中培养，超低温冻存的时间可以根据具体情况选取，在需要复苏的时候结束冻存即可，没有一定的限制。
采用本发明方法保存的海带游(胚)孢子，荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，FDA)活性染色法测定成活率，存活率达到30％左右。
权利要求
1.海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法，其特征是该方法包括以下步骤材料处理、平衡、快速冻存和复苏。
2.根据权利要求1所述的海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法，其特征材料处理是选择孢子囊色泽呈墨绿色、表面有白色的薄膜开始脱落的海带，剪取带有孢子囊的叶片，用脱纸棉和消毒海水反复搽洗十余遍，置于烧杯中，倒入5-10℃低温消毒海水，放散孢子，孢子浓度达到50/160×以上时，用300目筛绢滤出杂质和黏液获得孢子悬液。
3.根据权利要求1所述的海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法，其特征平衡是将孢子悬液与消毒海水配制的20％DMSO按1∶1比例混合，在0-4℃冰箱中平衡15min。
4.根据权利要求1所述的海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法，其特征快速降温冻存是将平衡后的孢子混合液装入1.5ml冻存管中，冻存管直接投入液氮。
5.根据权利要求1所述的海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法，其特征复苏是超低温冷冻后，将冻存管从液氮中取出，迅速移到39℃恒温水浴中快速震荡，至最后一粒冰晶消失倒入培养液中培养。
全文摘要
本发明公开了一种海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法，该方法包括以下步骤材料处理、平衡、快速冻存和复苏，本发明改进已有的继代培养保存无性系技术的不足，提供了一种用于海带孢子保存、简便易行、可大量保存种质材料、成活率较高的海带游(胚)孢子的超低温快速冷冻保存法。
文档编号A01H13/00GK1742553SQ20051004420
公开日2006年3月8日 申请日期2005年8月4日 优先权日2005年8月4日
发明者车轼, 张全胜, 王国文, 曲善村, 杨丽娜 申请人:山东东方海洋科技股份有限公司, 烟台大学