专利名称：牛内窥镜活体采卵方法
技术领域：
本发明涉及胚胎工程领域，特别是涉及牛内窥镜活体采卵方法。
背景技术：
牛活体采卵(OPU)是继牛体外受精、胚胎移植技术之后研究并推出的一项胚胎工程技术。牛活体采集卵母细胞技术是一项充分挖掘优良母牛繁殖潜能，获取种源明确的卵母细胞技术，它可结合体外受精技术为胚胎移植技术、胚胎干细胞的研究和建立、胚胎核移植、转基因技术、胚胎的性别鉴定等提供可用卵母细胞和胚胎。目前牛活体采卵的主要方法有内窥镜法和超声波法。采用内窥镜法采卵效率高于超声波法，但内窥镜法对供体牛的伤害较大。中国农业科学院畜牧研究所生物工程室朱裕鼎教授根据国外资料改进设计的我国第一台牛用内窥镜活体采卵仪进行牛活体采卵。常用内窥镜活体采卵法主要包括如下步骤1.采卵前准备内窥镜镜筒、组合套管针，采卵针及接卵离心管，用无水乙醇棉球擦净内窥镜前端进出光源的玻面；磷酸盐缓冲液(PBS)预热配制成冲卵液；用利多卡因(Lidocain)进行荐尾间隙硬膜外麻醉，根据牛体格大小肌肉注射静松灵，待尾根松驰麻醉成功后，再将CO2气体充入供体牛的腹腔。
2.穿刺操作者将钝套管针插入套管，旋转套管针固定卡使两者固定为一体，然后将钝套管针小心插入阴道，通过直肠把握的引导将套管导向阴道穹隆预定刺入的位置上，套管的方向与牛纵向长轴平行，然后撤出钝套针，插入有刃套针，并调整穿刺角度，使套针的方向与母牛的长轴略向右腹壁偏向10°的夹角，略向上用力刺穿阴道穹隆，到达腹腔。
3.采卵将采卵针穿入内窥镜的进针孔中，采卵针针尖与内窥镜光源截面平行，转动螺栓将针固定，注射器将冲卵液注入采卵针中，以润滑采卵针管壁，并给接卵管中注入吸卵液，将采卵针和负压泵管连接到接卵管的橡胶塞上。将二氧化碳充气管从套管拔掉，立即把准备好的内窥镜插入套管中调节固定卡将两者固定，连结好摄像机连线，把内窥镜接入冷光源。操作者一手在直肠隔肠壁握住欲采一侧卵巢，另一手握内窥镜柄不断调整内窥镜与卵巢的位置，在卵巢与内窥镜之间不能有肠壁等阻隔，操作者根据屏幕上的图像，改变卵巢的位置来展示卵巢上卵泡、黄体大小形态及其卵巢表面的情况，并确定要穿刺的卵泡，操作者让助手推进采卵针。拧紧螺栓将针的后端固定，操作者一手把握卵巢，一手把握内窥镜镜柄前后移动，并将针头的斜面贴近卵泡壁，在将要穿入卵泡时，脚踩真空泵开关，将卵泡液、卵母细胞吸出。
上述采卵方法的缺点是对牛阴道穹窿、卵巢的伤害均较大，从而影响卵母细胞的质量及牛的寿命。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷，提供一种牛内窥镜活体采卵方法，尽量减少对供体牛的伤害，同时使采卵工艺更加程序化，简单化，提高采卵效率。
牛内窥镜活体采卵方法，主要包括采卵前准备、穿刺和采卵三个步骤，其特征在于穿刺步骤中用细套简将穿刺棒送入阴道穹窿，穿刺成功后撤出穿刺棒，导入引导棒，再将细套筒撤出，导入粗套筒，将内窥镜插入粗套筒内开始采卵。与改进前相比，用细套筒将穿刺棒送入阴道穹窿，减小了对阴道穹窿损伤；穿刺后替换成粗套筒，加大了采卵视野面，可以更清晰的观察到卵巢上卵泡位置，减少了对卵巢的损坏。
所述采卵步骤中，采卵针、冲液口、内窥镜光源的位置在内窥镜显示屏上相对固定，即采卵针在内窥镜光源“5”点位置上。与改进前内窥镜光源与采卵针位置不固定相比，“5”点位置不但可以在显示器上标记出针位置，增加了采卵的准确性，而且可以试看针斜面，避免了出针划伤卵巢，从而可减少了对卵巢的伤害。
所述采卵前准备中供体牛采用饥饿法，使其瘤胃内容物减少，瘤胃前移，增加了穿刺的安全性，避免误伤瘤胃；与改进前相比，牛只腹腔不注入CO2气体，节约了CO2气体。
所述内窥镜上安装有冲液口。在采卵过程中，血黏液的出现会造成视野模糊，在内窥镜上加装有冲液口，用生理盐水冲洗血黏液，可以清晰视野；同时可以通过冲液口注入双抗消炎。与改进前相比，窥镜上的血黏液不再用直肠内的手清除，这样不但操作简便，而且减少了供体牛直肠的损伤。
所述套筒配有套筒刷。采卵步骤中，套筒内若溅有血沫，在不撤出套筒的情况下，撤出内窥镜探头，用套筒刷刷拭套筒。这样就改变了以往需要撤出套筒才能刷拭，减少了反复插入套筒造成对牛只阴道穹隆的损伤。
所述采卵步骤中，增加有消毒器械槽，对采卵所用的器械进行清洗消毒，保证采卵过程的无菌操作。
本发明牛内窥镜活体采卵方法，采卵工艺更加程序化，简单化，减少了对供体牛的瘤胃、阴道穹窿及卵巢的伤害，减小了在操作过程中供体牛的损伤，同时提高了采卵效率。
图1采卵时位置示意图①术者 ②助手 ③采卵仪 ④抽气泵 ⑤静松灵、利多卡因、采卵液及注射器 ⑥0.1％新洁而灭、0.9％生理盐水 ⑦酒精棉球、碘酒、石蜡油 ⑧器械槽具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例11采卵前准备1.1采卵器材内窥镜采卵仪、套筒(粗、细各一个)、穿刺棒、导管、集卵管、采卵针、引导棒、套筒刷1.2物品、药剂1)、物品25ml采卵液/头 酒精棉球 碘酒棉球 灭菌生理盐水 10ml一次性注射器五个剪毛剪一把 直剪一把镊子一把20ml玻璃注射器一个 器械车2)、药剂2％盐酸利多卡因(按10ml/头牛准备) 5％静松灵一盒 1支青霉素/头 1支链霉素/头 苏醒灵一盒 1210消毒液 0.1％新洁而灭消毒液(20ml/头准备)1.3牛只的准备1.3.1供体牛采卵前绝食24小时。
1.3.2将牛牵到保定架内保定坚实、牢固。
1.3.3 5％静松灵小剂量镇静，根据个体差异、敏感程度选择适宜剂量，一般为0.3-1.0ml肌注。
1.3.4 2％盐酸利多卡因荐尾间隙硬膜外传导麻醉1.3.4.1找到荐尾间隙并剪毛；1.3.4.2 5％碘酊棉球涂布消毒，而后用75％酒精脱碘；1.3.43利多卡因剂量4ml--10ml，视牛对麻醉效果而定；1.3.4.4荐尾间隙硬膜外局部传导麻醉选用灭菌9#长针，注射器可选用5ml或10ml一次性注射器；1.3.4.5先用针头对准荐尾间隙，找好下针位置穿刺，针头与水平面呈45-60度角，刺到硬膜外腔内；1.3.4.6然后将针管接到针头上，先回抽注射器芯，观察有无回血，无回血时将麻醉剂推入。判断麻醉效果是否确实，以牛尾部完全松弛、肛门及会阴部轻触不收缩为准；1.3.5麻醉前先清除直肠内粪便。
1.3.6按要求麻醉。
1.3.7要求接通电源(220v)，调好抽气泵压力55mmHg。
1.3.8清洗外阴1.3.8.1先用清水洗；1.3.8.2 0.1％新洁而灭消毒及冲洗，停滞2MIN；1.3.8.3灭菌0.9％生理盐水冲洗；1.3.8.4吸水纸擦干。
2穿刺2.1一只手带好长臂手套，涂布润滑剂伸入直肠；2.2穿刺棒在细套筒中送入阴道穹窿；2.3控制套筒的手与直肠内的手配合，使其前端顶住子宫颈口正上方(阴道穹窿)，然后直肠内的手抬起，穿刺方向偏右上方(避开瘤胃)，将穿刺棒推出套管，一次用力穿刺，撤出穿刺棒(可听到“呋呋”进气声)；2.4将细引导棒穿入细套筒直肠内的手隔直肠握住引导棒，拔出细套筒然后将粗套筒导入，最后拔出引导棒至此穿刺完毕。
2.5将窥镜管插入粗套筒推入。
3采卵3.1集卵管、采卵针内吸入少量采卵液，将采卵针送入针道，集卵管放入术者下衣口袋中等待扎针。
3.2术者直肠内手握卵巢，靠近套筒端轻轻转动通过显示器寻找适宜卵泡(直径2毫米至8毫米)。
3.3术者将适宜的卵泡转到时钟“5点”位置，助手先踩踏板随后将针尖刺入卵泡内吸引(针尖斜口向下)。
3.4采卵过程中，术者直肠内的手轻轻转动卵巢，助手轻轻转动采卵针以达到多方位吸引。
3.5吸引完毕后，助手先撤针再抬脚。
3.6吸采卵液使卵母细胞进入采卵管，至此一个卵泡采完，或每吸一针拔出后用吸有采卵液的注射器缓慢将卵泡液反冲集卵管中。
3.7以同样的方法采集两侧卵巢上的适宜卵泡。
3.8每采完一头牛应由冲液孔推入100万单位青霉素及160万单位链霉素各一只(0.9％生理盐水稀释20毫升)。
4采卵后的工作4.1采卵结束，将牛牵走；如有必要注射与静松灵同等剂量的苏醒灵。
4.2所用采卵针、导管用酒精冲洗三遍，再用蒸馏水冲洗三遍，凉干等待气体灭菌，金属采卵针高压灭菌备用。
4.3内窥镜套管，穿刺棒流水冲净酒精消毒凉干备用。
4.4针道刷净，进液孔蒸馏水冲净(禁止用生理盐水以防止结晶堵塞)备用。
5采卵过程中遇到的情况及处理方法。
5.1如穿刺不彻底(有膜)，必须进行第二次穿刺。
5.2如视野模糊不清，还可以用生理盐水由冲液口孔冲洗。
5.3如视野仍有血沫影响视野时可将窥镜撤出，用套筒刷刷拭套筒内壁。
权利要求
1.牛内窥镜活体采卵方法，主要包括采卵前准备、穿刺和采卵三个步骤，其特征在于穿刺步骤中用细套筒旋转固定穿刺棒送入阴道穹窿正上方，穿刺成功后将穿刺棒撤出，导入引导棒，再将细套筒撤出，导入粗套筒，将内窥镜插入粗套筒内。
2.权利要求1所述的牛内窥镜活体采卵方法，所述采卵步骤中将采卵针、冲液口、内窥镜光源在内窥镜显示屏上相对固定，采卵针在内窥镜光源“5”点位置上。
3.权利要求2所述的牛内窥镜活体采卵方法，所述采卵前准备步骤中让供体牛饥饿24小时。
4.权利要求1所述的牛内窥镜活体采卵方法，所述内窥镜上安装有冲液口。
5.权利要求1所述的牛内窥镜活体采卵方法，所述粗套筒配有套筒刷。
6.权利要求1所述的牛内窥镜活体采卵方法，所述采卵步骤中还增加有消毒器械槽。
全文摘要
牛内窥镜活体采卵方法，主要包括采卵前准备、穿刺和采卵三个步骤，其特征在于穿刺步骤中用细套筒将穿刺棒送入阴道穹窿，穿刺成功后撤出穿刺棒，导入引导棒，再将细套筒撤出，导入粗套筒，将内窥镜插入粗套筒内开始采卵。本发明牛内窥镜活体采卵方法，采卵工艺更加程序化，简单化，减少了对供体牛的瘤胃、阴道穹窿及卵巢的伤害，减小了在操作过程中供体牛的损伤，同时提高了采卵效率。
文档编号A61D19/00GK1759815SQ20051008694
公开日2006年4月19日 申请日期2005年11月21日 优先权日2005年11月21日
发明者李继成, 吴亦芳, 张红霞, 张向利 申请人:北京锦绣大地农业股份有限公司