Dna构建体以及其用途的制作方法

专利名称：Dna构建体以及其用途的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种能表达谷氨酰-tRNA合成酶(Glutamyl-tRNAsynthetase)的DNA建构体。此外，本发明是关于使用该DNA建构体生产转基因植物以及转基因植物组织的方法。
背景技术：
叶绿素(Chlorophyll)是吸收阳光并且利用其能量将二氧化碳和水合成碳水化合物的物质。此过程便是公知的光合作用，并且其是维持所有植物生命的基础。由于动物以及人类通过食用植物而获得食物供给，因此光合作用也可说是我们生命的来源。通过经由光合作用的过程，植物可生产大量的必需元素，如葡萄糖、蔗糖、果糖以及纤维素。进一步，我们的皮肤以及消化系统可通过摄取含有叶绿素的食物而得到改善。
对于人类的研究发现，补充叶绿酸(Chlorophyllin)，一种叶绿素的衍生物，可将由黄曲霉毒素(Aflatoxin)所引起的DNA损伤降低至55％。研究也发现叶绿素具有抗发炎、抗氧化以及创伤复原的特性，进一步，其也可保护细胞，使细胞不会暴露于致癌物质、突变剂以及辐射线之下。
在地球上，有一半的人口以稻米为主食。在部分非洲以及亚洲的地区，许多穷人通过稻米获得日常生活中所需要的大部分热量。随着世界人口的增加，未来30年的稻米产量必须增加至少70％才足够。若稻米中的养分能增加，人们可能仅需食用稻米就可以变得更健康。通过基因工程增加稻米中养分的一个成功范例，便是公知的“黄金米”。1999年瑞士以及德国科学家宣布研发了一种基因工程改良的稻米，用以生产β-胡萝卜素，而人体可将β-胡萝卜素转化成维生素A。该新品种稻米很快地被宣告为针对维生素A缺乏症(Vitamin A deficiency，VAD)的一种奇迹似的对策。在发展中国家中，维生素A缺乏症已经造成数百万人民的困扰，特别是小孩以及孕妇。并且，严重的VAD可能造成患者部分或全盲；较轻微的VAD则会减弱免疫系统，增加受到感染，如麻疹以及疟疾的危险。患有VAD的女性似乎更容易在生产期间或生产后死亡。每年，估计约有35万名学龄前儿童因为患VAD而失明，并且VAD也造成超过百万人死亡。因此，“黄金米”的研发对于拯救患VAD的患者来说是非常重要的。
马铃薯是世界上第四重要的粮食作物，并且是最重要的蔬菜。在美国，几乎每个州皆种植马铃薯作为经济作物。此外，美国马铃薯的年产量已经超过1千8百万吨，而全世界的马铃薯年产量则约有3亿吨。马铃薯的普及主要是因为其用途广泛以及营养价值。马铃薯可以被使用，以新鲜的、冷冻的或是干燥的方式，或者可被加工成马铃薯粉、淀粉或酒精。其具有多种碳水化合物，并且富含钙、烟碱酸以及维生素C。进一步，虽然洋芋片以及薯条已经在许多报导中表示含有大量的有毒物质，丙烯酰胺，但是这些马铃薯的食品加工产品仍然非常受到欢迎。
鉴于叶绿素对人体健康的价值以及稻米、马铃薯等作物的普及，若能研发可持续表达高含量叶绿素的稻米以及马铃薯等作物是有其需求。此外，不喜欢吃蔬菜的儿童也可通过食用这些作物而获得叶绿素的补充。

发明内容
因此，本发明提供生产转基因植物以及转基因植物组织的方法，并且该转基因植物以及植物组织中含有持续表达的高含量叶绿素。特别地，本发明提供通过特定的DNA建构体生产转基因植物以及转基因植物组织的方法。
本发明目的之一是提供一种DNA建构体，其包含一种可操作性地与核苷酸序列连接的特定启动子，其中该核苷酸序列编码包含选自SEQ IDNO2(细胞质型谷氨酰-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型谷氨酰-tRNA合成酶)及其组合的氨基酸序列。
本发明的另一目的是提供一种植物细胞，该植物细胞包含一DNA建构体，其中该DNA建构体包含一种可操作性地与核苷酸序列连接的特定启动子，其中该核苷酸序列编码包含选自SEQ ID NO2(细胞质型谷氨酰-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型谷氨酰-tRNA合成酶)及其组合的氨基酸序列。
本发明的再一目的是提供一种转基因植物组织，该转基因植物组织包含一DNA建构体，其中该DNA建构体包含一种可操作性地与核苷酸序列连接的特定启动子，其中该核苷酸序列编码包含选自SEQ ID NO2(细胞质型谷氨酰-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型谷氨酰-tRNA合成酶)及其组合的氨基酸序列。
此外，本发明的另一个目的是提供一种生产转基因植物的方法。该方法包括用DNA建构体转化植物细胞，该DNA建构体包含一种可操作性地与核苷酸序列连接的特定启动子，其中该核苷酸序列编码包含选自SEQ ID NO2(细胞质型谷氨酰-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型谷氨酰-tRNA合成酶)及其组合的氨基酸序列；以及从该转化的植物细胞产生完整的植物。
另外，本发明的另一个目的同样是提供一种生产转基因植物的方法。该方法包括用DNA建构体转化植物组织，该DNA建构体包含一种可操作性地与核苷酸序列连接的特定启动子，其中该核苷酸序列编码包含选自SEQ I D NO2(细胞质型谷氨酰-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型谷氨酰-tRNA合成酶)及其组合的氨基酸序列；以及从该转化的植物组织产生完整的植物。
关于本发明的优点与精神可以通过以下的发明详述及附图得到进一步的了解。
四

图1A-图1C是表示根据本发明的用于生产转基因水稻的DNA建构体。
图2A-图2C是表示根据本发明的用于生成转基因马铃薯的DNA建构体。
五、实施方式以下将详述本发明的优选具体实施例以及实际应用案例，用以充分说明本发明的特征、精神及优点。
本发明提供一种特定的DNA建构体，其包含一特定的启动子以及一或多个特定基因。此外，该(多个)特定基因可帮助增加植物中的叶绿素含量。
首先，氨酰-tRNA合成酶(Aminoacyl-tRNA synthetase，ARS)在蛋白质合成反应中扮演着重要的角色，其通过催化氨基酸附加到同源tRNA以促进蛋白质合成。氨酰-tRNA合成的特性配合适当的tRNAs以及氨基酸致使基因信息能准确传播。植物中的蛋白质合成是在细胞质、粒线体以及叶绿体中进行，并且在上述各分区中，蛋白质合成不需要由各别细胞核基因所编码的全部独特氨酰-tRNA合成酶的参与。一般而言，植物的氨酰-tRNA合成酶可根据其基质被分为两个族群细胞质型酶，其能最有效地氨酰化(Aminoacylate)植物或酵母菌的细胞质tRNAs；以及胞器型酶，其能氨酰化胞器或大肠杆菌(Escherichia coli)的tRNAs。
除了在蛋白质合成中扮演着重要的角色外，谷氨酰-tRNA合成酶，一种氨酰化-tRNA合成酶，也是与叶绿素合成有关的第一个酶。针对高等植物的相关研究已经报导，当胞器型谷氨酰-tRNA合成酶以及丝氨酰-tRNA合成酶(Seryl-tRNA synthetase)被去活性时，将导致叶绿体以及粒线体的发展停滞(Kim，Y.K.，et al.J.Biol.Chem.28037098-37106 (2005))。此外，胞器型谷氨酰-tRNA合成酶以及丝氨酰-tRNA合成酶的去活性也导致叶绿素的含量减少。根据这些研究，显而易见地，谷氨酰-tRNA合成酶在叶绿素含量以及叶绿体的分化中扮演着重要的角色。
因此，本发明欲将该细胞质型谷氨酰-tRNA合成酵素和/或该胞器型谷氨酰-tRNA合成酶转移到植物以及植物组织，如水稻种子、小麦种子、大麦种子、玉米种子以及马铃薯块茎等。
在本发明的一个优选的具体实施例中，提供一种DNA建构体。该DNA建构体包含第一特定的启动子，其可操作性地与核苷酸序列连接，其中该核苷酸序列编码包含SEQ ID NO2的氨基酸序列(细胞质型谷氨酰-tRNA合成酶)和/或SEQ ID NO4的氨基酸序列(胞器型谷氨酰-tRNA合成酶)。
在本发明的一个具体实施例中，该DNA建构体进一步包含第二特定的启动子，如CaMV35S启动子。此外，在该实施例中，该DNA建构体也包含一种标记基因，如编码磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannoseisomerase，PMI)的基因，可操作性地连接到该第二特定启动子上。因此，该第二特定的启动子可驱动该标记基因的表达。
参见图1A至图1C，图1A至图1C是表示根据本发明的供稻米转殖用的DNA建构体。在一具体的实施例中，第一特定的启动子是谷蛋白(glutelin)1启动子。此外，如图1A所示，DNA建构体也包含SEQ IDNO1的核苷酸序列，其中核苷酸序列编码细胞质型谷氨酰-tRNA合成酶，并且核苷酸序列由第一特定的启动子驱动。DNA建构体也包含CaMV35S启动子，以及由CaMV35S启动子驱动的标记基因。
如图1B所示，在一具体的实施例中，第一特定的启动子同样是谷蛋白1启动子。并且，DNA建构体包含SEQ ID NO3的核苷酸序列，其编码该胞器型谷氨酰-tRNA合成酶，并且核苷酸序列由第一特定的启动子驱动。该DNA建构体同样包含CaMV35S启动，以及由CaMV35S启动子驱动的标记基因。
进一步地，如图1C所示，在一具体的实施例中，DNA建构体可同时包含SEQ ID NO1的核苷酸序列以及SEQ ID NO3的核苷酸序列。在本发明的另一具体实施例中，第一特定的启动子可以是I型B33patatin启动子(图2A至图2C)。可利用图2A至图2C所示的DNA建构体转化马铃薯。应当注意的是，第一特定的启动子以及第二特定的启动子不限于上述的启动子，可以视情况需要而选择其它适当的启动子。
在本发明的另一个优选的具体实施例中，提供包含上述DNA建构体的植物细胞。进一步低，该植物细胞可以来自水稻、小麦、大麦、黑麦(Rye)、花生、谷物(Corn)、玉米(Maize)、马铃薯、甘薯、甜菜、萝卜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、胡萝卜、南瓜、小胡瓜(Zucchini)、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子(Raspberry)、菠萝、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗等植物。
在本发明的另一优选的具体实施例中，提供包含上述DNA建构体的转基因植物组织。在实际应用中，该植物组织可以是果实、茎、根、种子以及块茎等植物组织，如水稻种子、大麦种子、玉米种子以及马铃薯块茎。
此外，在本发明的一个优选的具体实施例中，提供生产转基因植物的方法，该方法包括二个主要步骤首先，用DNA建构体转化植物细胞，该DNA建构体包含一种可操作性地与核苷酸序列连接的特定启动子，其中该核苷酸序列编码包含选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其组合的氨基酸序列；接着从该转化的植物细胞产生完整的植物。
在一个具体的实施例中，该方法可进一步包括从该完整植物或繁殖的完整植物中收获植物组织，如，果实、茎、根、种子以及块茎的步骤。在实际应用中，该植物可以是，但不限于水稻、小麦、大麦、黑麦、花生、谷物、玉米、马铃薯、甘薯、甜菜、萝卜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、胡萝卜、南瓜、小胡瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠萝、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗等。
此外，在本发明的另一个优选的具体实施例中同样提供一种生产转基因植物的方法，该方法包括下列步骤首先，用DNA建构体转化植物组织，该DNA建构体包含一种可操作性地与核苷酸序列连接的特定启动子，其中该核苷酸序列编码包含选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其组合的氨基酸序列；接着从该转化的植物细胞产生完整的植物。
在实际应用中，该植物同样可以是，但不限于水稻、小麦、大麦、黑麦、花生、谷物、玉米、马铃薯、甘薯、甜菜、萝卜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、胡萝卜、南瓜、小胡瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠萝、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗。并且，在实际应用中，该植物组织可以是，但不限于果实、茎、根、种子以及块茎，如水稻种子、大麦种子、小麦种子以及马铃薯块茎。
在一个具体的实施例中，该方法可进一步包括从该完整植物或繁殖的完整植物中收获一特定的植物组织，如，果实、茎、根、种子以及块茎的步骤。
关于上述的方法将在以下几个实施例中进行更详细的阐述。应当注意的是，在实施例1中描述DNA建构体的构建；在实施例2中描述水稻的转基因；在实施例3中描述马铃薯的转基因。
具体实施例实施例1DNA建构体的构建分别自拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离出2760bp的DNA片段(SEQ ID NO1)，该片段编码细胞质型谷氨酰-tRNA合成酶(SEQ ID NO2)；以及2055bp的DNA片段(SEQ ID NO3)，该片段编码胞器型谷氨酰-tRNA合成酶(SEQ ID NO4)。(SEQ ID NO1-4的具体序列见序列表)拟南芥GluRS(谷氨酰-tRNA合成酶)基因选择GluRS是合成叶绿素的第一个基因，拟南芥有细胞质型和胞器型两种形式，利用拟南芥mRNA反转录的cDNA当模板(反转录的具体过程为在微量离心管中，加入阿拉伯芥total RNA 1μg、500μg/ml oligo(dT)1μl、10mM dNTPmix 1μl，用水补到12μl，65℃处理5分钟，然后冰入冰块中。再加入5μl缓冲液、2μl 0.1M DTT、1μl RNase inhibitor及1μl(200U)反转录酵素，42℃处理50分钟，即得到阿拉伯芥cDNA)，利用AtGluRScF(5’-gctctagaatggatgggatgaagct t-3’(含XbaI切位))与AtGluRScR(5’-tcccccgggtgagttagcggctcttcc-3’(含SmaI切位))、或AtGluRSoF(5’-gctctagaatggcgagccttgtctac-3’(含XbaI切位))与AtGluRSoR(5’-tcccccgggtcaggttgatactgtggc-3’(含SmaI切位))做引物，以PCR方式复制拟南芥GluRS基因，细胞质型GluRS全长2160bp(具体序列见序列表)，胞器型GluRS全长1713bp(具体序列见序列表)。(两个PCR反应的具体反应条件为利用上述的cDNA当模板，利用AtGluRScF与AtGluRScR或AtGluRSoF与AtGluRSoR当引子，35次PCR循环中，72℃反应时间2分10秒或1分45秒，其他PCR条件同下列质粒构建项目1所述，即得阿拉伯芥GluRS基因。)质粒构建1.pCambia1390-PMI以XhoI将pCambia1390载体(可以是市售)上的潮霉素抗性基因切除，换上PMI基因(基因的来源为抽取大肠杆菌genomic DNA，利用PMI5’390引子5’-ccatggtcatgcaaaaactcattaac-3’(含NcoI切位)与PMI3’1574引子5'-taagctcttacagcttgttg-3’，以PCR方式复制大肠杆菌PMI基因全共1176bp，以TA cloning插入pPICT-1质体，定序确定序列无错误。PCR条件如下在薄壁微量离心管中，加入最浓度dNTP 0.2mM、Mg2+2mM、正反引子各0.2μM、Taq DNApolymerase 1U、1倍PCR反应缓冲液、大肠杆菌genomic DNA当模版，用 菌水补至总体积50μl，整个管子先94℃处理5分钟，再做94℃ 30秒、52℃ 30秒、72℃ 70秒共35次循环，最后72℃ 8分钟结束，跑0.8％ agarose电泳确定大小无误。利用限制酵素酶XhoI将PMI基因片段从pPICT-1质体中切出，然后接入pCambia1390中的XhoI site，以取代原先该位置上的抗生素基因)。
2.pBluescript II SK(pBS)中的基因盒将大小约0.3kb NOS终止子以BamHI/EcoRI从pPZPY122载体中切下，接入pBS中；将水稻glutelin 1基因启动子从TA cloning pPICT-1质体以NotI/XbaI切下，接入pBS中；拟南芥GluRS基因从TA cloning pPICT-1质体以XbaI/SmaI切下，接入pBS中，此质粒即分含有GluRS启动子、基因与终止子。3.以NotI/ApaI切下pBS质粒整个基因盒，用Klenow酶补平；用SmaI切pCambia1390-PMI，两者进行连接反应，即可得到可将拟南芥细胞质型与胞器型GluRS基因大量表达的转基因质粒。
4.以NotI/ApaI切下pBS质粒含有整个细胞质型GluRS基因盒，用Klenow酶补平；用PmlI切已接入胞器型GluRS的pCambia1390-PMI质粒，两者进行连接反应，即可得到可同时表达拟南芥细胞质型与胞器型GluRS的转基因质粒。
请参阅图1以及图2，以了解于此所建立的DNA建构体的部分实例。这些DNA建构体包含上述的DNA片段中的至少一DNA片段。这些DNA建构体并且进一步包含至少一第一特定启动子，如glutelin 1启动子以及class I B33 patatin启动子，以及一第二特定启动子，如CaMV35S启动子。并且，这些DNA建构体可包含一标记基因，如一磷酸甘露糖异构酶基因。此外，这些DNA建构体以农杆菌(Agrobacterium)为媒介分别传递进入稻米或马铃薯的基因组，分别如实施例2以及实施例3所描述。
实施例2转基因水稻发芽将约50粒台农67号的水稻种子(市售产品)，以30％的漂白溶液(次氯酸钠)消毒7分钟，用灭菌水洗涤后，将经过消毒的水稻种子散布于MS培养基(MS+维生素为基础培养基；30g/L的蔗糖；0.7％的洋菜；pH 5.8)上。在黑暗中使上述的水稻种子在30℃生长约3-5天。
愈合组织的诱导将发芽的水稻种子转移至CIM培养基(N6+维生素为基础培养基；0.3g/L酪蛋白氨基酸(Casamino acid)；2.8g/L raline；2mg/L 2，4-D；100mg/L肌醇；30g/L蔗糖；0.7％洋菜；pH 5.7)，进行愈合组织的诱导，接着在30℃持续光照培养，每隔2周进行传代培养(Subculture)。
感染1周后，用含有上述DNA建构体的农杆菌GV3101(指的是图1A、1B与1C的DNA建构体)悬浮液感染传代培养的愈合组织细胞。将农杆菌悬浮液用AAM培养液稀释至OD600nm＝0.6-0.8，并将该农杆菌悬浮液倾注至含有愈合组织细胞的培养皿，培养15分钟。其中AAM培养溶的配方为CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、KH2PO4170mg/L、Fe-EDTA 37.5mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.02mg/L；维生素(盐酸胸腺嘧啶1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟碱酸10mg/L)；氨基酸(甘氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺877mg/L、L-天门冬氨酸266mg/L、L-精氨酸228mg/L)；蔗糖68.5g/L、酪蛋白氨基酸500mg/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(Acetosyringone)100μM；pH 5.2)。
共培养将接种的愈合组织细胞取出并以吸水纸移除过剩的农杆菌，接着将愈合组织细胞在2N6I-AS培养基(N6+维生素为基础的培养基；酪蛋白胺基酸1g/L；2，4-D 2mg/L；菜豆醣100mg/L；乙酰丁香酮100M；30g/L的蔗糖；葡萄糖10g/L；洋菜0.7％；pH 5.2)上，在28℃在黑暗中培养3天。
筛选在共培养后，用AA2培养液洗涤愈合组织细胞30分钟，重复该洗涤步骤2次，并且移除过剩的培养溶液，其中AA2培养液的配方为CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、KH2PO4170mg/L、Fe-EDTA37.5mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.02mg/L；维生素(盐酸胸腺嘧啶1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟碱酸10mg/L)；氨基酸(甘氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺877mg/L、L-天门冬氨酸266mg/L、L-精氨酸228mg/L；蔗糖30g/L、2，4-D 2mg/L；pH 5.7)。接着将愈合组织细胞转移到筛选培养基2N6I-CH(N6+维生素为基础的培养基；酪蛋白胺基酸1g/L；2，4-D 2mg/L；菜豆醣100mg/L；蔗糖30g/L；0.7％洋菜；pH 5.2)上，在30℃持续光照的环境下进行筛选。
再生将小于3mm的新生愈合组织转移至筛选培养基RM中，在26.5℃持续光照条件下继续培养，其中RM培养基的配方是KH2PO4400mg/L；KNO32830mg/L；(NH4)2SO4463mg/L；MgSO4·7H2O 185mg/L；CaCl2·2H2O 166mg/L；FeSO4·7H2O 27.85mg/L；Na-EDTA 37.25mg/L；ZnSO4·7H2O 1.8mg/L；MnSO4·4H2O 2.5mg/L；H3BO31.6mg/L；KI 0.83mg/L；N6维生素(商品化的化学制剂，包含甘氨酸、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素)；NAA 0.5mg/L；细胞分裂素5mg/L；蔗糖30g/L；葡萄糖5g/L；菜豆醣100mg/L；0.7％洋菜；pH 5.7)。
生根诱导将3-5厘米的幼芽转移至筛选培养基MS+2，4-D，进一步培养至10-15厘米，并将其转移至土壤中，使其进一步生长。
实施例3转基因马铃薯幼苗消毒将马铃薯块根以30％的漂白溶液(次氯酸钠)消毒，并且以灭菌水洗涤后，将其在MS培养基中培养，使其发芽。
预培养使用消毒后幼苗的幼叶进行预培养。将幼叶剪成5mm宽度的片段，将带有幼叶上表面的片段转移至HH培养基(MS+维生素为基础的培养基；3％蔗糖；NAA 10mg/L；玉米素核苷10mg/L；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)中进行预培养，接着在20-22℃，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，光强度为60μE/m2s下培养。
感染用COD培养液(MS+维生素为基础的培养基；3％的蔗糖；200μM的乙酰丁香酮)将含有上述DNA建构体的农杆菌细胞悬浮液稀释至OD600nm＝0.6-0.8，将稀释后的农杆菌细胞悬浮液与上述预培养幼叶片段共同培养10分钟。
共培养将感染后带有幼叶上表面的片段转移至LSR1培养基(含有乙酰丁香酮200μM；MS+维生素为基础之培养基；3％蔗糖；NAA 0.2mg/L；玉米素核苷2mg/L；GA30.02mg/L；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)中，在20-22℃，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，光强度为60μE/m2s的条件下共同培养。
愈合组织诱导将上述共同培养的幼叶片段转移至LSR1T筛选培养基(LSR1培养基+200mg/L Timentin)，在20-22℃，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，光强度为100μE/m2s的条件下培养。
再生诱导将带有包含上述DNA建构体的愈合组织的幼叶片段转移至LSR2培养基(MS+维生素为基础的培养基；3％蔗糖；玉米素核苷2mg/L；GA30.02mg/L；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)上，供外殖体诱导，每2周更换新鲜培养基。当外殖体生长到1-2厘米时，将外殖体转移至CM培养基(MS+维生素为基础的培养基；2％蔗糖；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)，该培养基也可包含乙烯基抑制剂(1mg/L硫代硫酸银)，以抑制过度发芽。
生根诱导将幼芽转移至RT培养基(MS+维生素为基础的培养基；2.5％蔗糖；0.2mg/L吲哚乙酸；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)上，进行生根诱导。
以上优选具体实施例的详述，是希望能更加清楚描述本发明的特征与精神，而并非用上述所公开的优选具体实施例来对本发明的范围加以限制。相反地，其目的是希望能在本发明所申请的权利要求的范畴内涵盖各种改变及具相等性的安排。
初步实验结果水稻与马铃薯的转植正在进行中，第一期计获得10个水稻转植品系与15个马铃薯转植品系，经PCR分析发现有6水稻转植品系具有转植基因的表现，而马铃薯则有10个转植品系具有转植基因的表现。
序列表<160>NUMBER OF SEQ ID NOS4<210>SEQ ID NO 1<211>LENGTH2760<212>TYPEDNA<213>ORGANISMArabidopsis thaliana<400>SEQUENCE1agggttctgt ttctcgtctc tctctcaaac ccacattgca caatccattt ctcgtttctc 60tgatttagat ccaaagatgg atgggatgaa gctttcgttc ccaccggaaa gtccaccact120ttcagtcatc gttgctcttt ctctctcagc ttctccggtg acgattgatt cttccgccgc180tgcaacaacc gtcccttctt ttgtcttctc cgacgggagg aaattgaatg gagccaccgt240tcttcttcgc tatgttggtc gatcagcgaa aaagcttcct gatttctatg gcaacaatgc300ttttgattct tctcagattg atgagtgggt agattacgca tctgtcttct cttctggttc360agagtttgag aatgcttgtg gtcgtgttga taagtatctc gagagtagca cgtttcttgt420tggccattct ctttccattg ctgatgtcgc tatttggtca gctcttgctg gaactggtca480aagatgggaa agtttgagga aatctaaaaa gtatcagagt cttgttagat ggttcaattc540gatattagac gagtacagtg aggtgcttaa caaggttcta gcaacttatg ttaagaaagg600atcagggaag cctgttgctg cacctaagtc taaagatagc caacaagctg tgaaaggaga660tggtcaggat aaaggtaagc ctgaagtgga cttgccggaa gcggagattg gaaaggttaa720actccggttt gctccagagc caagtggtta tcttcacata ggacatgcta aggctgcgtt780gctgaacaag tatttcgctg agcgttacca aggggaagtg attgtgcgtt ttgatgatac840taaccctgct aaagaaagca atgagtttgt ggataatctt gtgaaggata ttgggacctt900ggggatcaag tatgagaaag tgacatacac ttcggactat tttcctgaat tgatggatat960ggcggaaaaa ctgatgcgtg agggtaaggc atatgttgat gacacaccga gggagcagat1020gcagaaagag aggatggatg ggattgattc gaaatgtagg aatcatagcg tcgaggagaa1080
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<210>SEQ ID NO 2<211>LENGTH719<212>TYPEPRT<213>ORGANISMArabidopsis thaliana<400>SEQUENCE2Met Asp Gly Met Lys Leu Ser Phe Pro Pro Glu Ser Pro Pro Leu Ser1510 15Val Ile Val Ala Leu Ser Leu Ser Ala Ser Pro Val Thr Ile Asp Ser20 25 30Ser Ala Ala Ala Thr Thr Val Pro Ser Phe Val Phe Ser Asp Gly Arg35 40 45Lys Leu Asn Gly Ala Thr Val Leu Leu Arg Tyr Val Gly Arg Ser Ala50 55 60Lys Lys Leu Pro Asp Phe Tyr Gly Asn Asn Ala Phe Asp Ser Ser Gln65 70 75 80Ile Asp Glu Trp Val Asp Tyr Ala Ser Val Phe Ser Ser Gly Ser Glu85 90 95Phe Glu Asn Ala Cys Gly Arg Val Asp Lys Tyr Leu Glu Ser Ser Thr100 105 110Phe Leu Val Gly His Ser Leu Ser Ile Ala Asp Val Ala Ile Trp Ser115 120 125Ala Leu Ala Gly Thr Gly Gln Arg Trp Glu Ser Leu Arg Lys Ser Lys130 135 140Lys Tyr Gln Ser Leu Val Arg Trp Phe Asr Ser Ile Leu Asp Glu Tyr145 150 155 160Ser Glu Val Leu Asn Lys Val Leu Ala Thr Tyr Val Lys Lys Gly Ser165 170 175
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Asp Ser Leu Glu Gly Ile Thr His Ala Leu Arg Ser Ser Glu Tyr His405 410 415Asp Arg Asn Ala Gln Tyr Phe Lys Val Leu Glu Asp Met Gly Leu Arg420 425 430Gln Val Gln Leu Tyr Glu Phe Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Thr Leu435 440 445Leu Ser Lys Arg Lys Leu Leu Trp Phe Val Gln Thr Gly Leu Val Asp450 455 460Gly Trp Asp Asp Pro Arg Phe Pro Thr Val Gln Gly Ile Val Arg Arg465 470 475 480Gly Leu Lys Ile Glu Ala Leu Ile Gln Phe Ile Leu Glu Gln Gly Ala485 490 495Ser Lys Asn Leu Asn Leu Met Glu Trp Asp Lys Leu Trp Ser Ile Asn500 505 510Lys Arg Ile Ile Asp Pro Val Cys Pro Arg His Thr Ala Val Val Ala515 520 525Glu Arg Arg Val Leu Phe Thr Leu Thr Asp Gly Pro Asp Glu Pro Phe530 535 540Val Arg Met Ile Pro Lys His Lys Lys Phe Glu Gly Ala Gly Glu Lys545 550 555 560Ala Thr Thr Phe Thr Lys Ser Ile Trp Leu Glu Glu Ala Asp Ala Ser565 570 575Ala Ile Ser Val Gly Glu Glu Val Thr Leu Met Asp Trp Gly Asn Ala580 585 590Ile Val Lys Glu Ile Thr Lys Asp Glu Glu Gly Arg Val Thr Ala Leu595 600 605Ser Gly Val Leu Asn Leu Gln Gly Ser Val Lys Thr Thr Lys Leu Lys610 615 620
Leu Thr Trp Leu Pro Asp Thr Asn Glu Leu Val Asn Leu Thr Leu Thr625 630 635 640Glu Phe Asp Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Asp Asp Glu645 650 655Val Ala Asp Phe Val Asn Pro Asn Thr Lys Lys Glu Thr Leu Ala Leu660 665 670Gly Asp Ser Asn Met Arg Asn Leu Lys Cys Gly Asp Val Ile Gln Leu675 680 685Glu Arg Lys Gly Tyr Phe Arg Cys Asp Val Pro Phe Val Lys Ser Ser690 695 700Lys Pro Ile Val Leu Phe Ser Ile Pro Asp Gly Arg Ala Ala Lys705 710 715<210>SEQ ID NO 3<211>LENGTH2055<212>TYPEDNA<213>ORGANISMArabidopsis thaliaha<400>SEQUENCE3agttatgagg ctttaatcga atttgttgct ttgctttgcg actttcatct ttccgattaa 60tcaaatcctt ttatcctctg aaaaatctca actttcgaag aaaacgaaaa tggcgagcct120tgtctacggg acgccgtggc ttagggttag atctttaccg gagcttgctc cagcttttct180cagacggcgt caatcttctt tattttactg ttctcggcga agcttcgcgg tggttgcgtg240ttccactcca gtcaacaatg gtgggtctgt cagagttcgt ttcgcgcctt ctcctactgg300taatctccat gtaggtggag caaggactgc tcttttcaac tacttgttcg cgaggtctaa360aggagggaaa tttgtgctga gaattgaaga tacagatttg gagagatcaa cacgtgaatc420tgaagcagct gttcttcagg atctctcatg gcttggtctt gattgggatg aaggtcctgg480ggttagtgga gactttggtc cttatcggca atctgaaaga aatgctttgt ataaacaata540tgcagagaag cttttagagt caggtcatgt ctatcgatgc ttttgctcaa gtgaggaact600
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<210>SEQIDNO4<211>LENGTH570<212>TYPEPRT<213>ORGANISMArabidopsis thaliana<400>SEQUENCE4Met Ala Ser Leu Val Tyr Gly Thr Pro Trp Leu Arg Val Arg Ser Leu1510 15Pro Glu Leu Ala Pro Ala Phe Leu Arg Arg Arg Gln Ser Ser Leu Phe20 25 30Tyr Cys Ser Arg Arg Ser Phe Ala Val Val Ala Cys Ser Thr Pro Val3540 45Asn Asn Gly Gly Ser Val Arg Val Arg Phe Ala Pro Ser Pro Thr Gly50 55 60Asn Leu His Val Gly Gly Ala Arg Thr Ala Leu Phe Asn Tyr Leu Phe65 70 75 80Ala Arg Ser Lys Gly Gly Lys Phe Val Leu Arg Ile Glu Asp Thr Asp85 90 95Leu Glu Arg Ser Thr Arg Glu Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Asp Leu100 105 110Ser Trp Leu Gly Leu Asp Trp Asp Glu Gly Pro Gly Val Ser Gly Asp115 120 125Phe Gly Pro Tyr Arg Gln Ser Glu Arg Asn Ala Leu Tyr Lys Gln Tyr130 135 140Ala Glu Lys Leu Leu Glu Ser Gly His Val Tyr Arg Cys Phe Cys Ser145 150 155 160Ser Glu Glu Leu Val Lys Met Lys Glu Asn Ala Lys Leu Lys Gln Leu165 170 175
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权利要求
1.一种DNA建构体，其包含一种可操作性地与核苷酸序列相连的第一特定启动子，其中该核苷酸序列编码选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其组合的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的DNA建构体，进一步包含第二特定的启动子。
3.权利要求2所述的DNA建构体，其中该第二特定的启动子是CaMV35S启动子。
4.权利要求3所述的DNA建构体，进一步包含一种标记基因，该标记基因是可操作性地与第二特定的启动子相连。
5.权利要求4所述的DNA建构体，其中该标记基因编码磷酸甘露糖异构酶。
6.如权利要求1所述的DNA建构体，其中第一特定的启动子是谷蛋白1启动子。
7.权利要求1所述的DNA建构体，其中第一特定的启动子是I型B33patatin启动子。
8.一种植物细胞，包含一DNA建构体，该DNA建构体包含一种可操作性与核苷酸序列相连的特定启动子，其中该核苷酸序列编码选自SEQ IDNO2、SEQ ID NO4及其组合的氨基酸序列。
9.权利要求8所述的植物细胞，其中该植物选自水稻、小麦、大麦、黑麦、花生、谷物、玉米、马铃薯、甘薯、甜菜、萝卜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、胡萝卜、南瓜、小胡瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠萝、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗。
10.权利要求9所述的植物细胞，其中该植物是水稻。
11.权利要求9所述的植物细胞，其中该植物是马铃薯。
12.一种转基因植物组织，其包含一DNA建构体，该DNA建构体包含一种可操作性地与核苷酸序列相连的特定启动子，其中该核苷酸序列编码选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其组合的氨基酸序列。
13.权利要求12所述的转基因植物组织，其中该植物组织选自果实、茎、根、种子以及块茎。
14.权利要求13所述的转基因植物组织，其中该植物组织是水稻种子或马铃薯块茎。
15.一种生产转基因植物的方法，包括下列步骤用DNA建构体转化植物细胞，该DNA建构体包含可操作性地与核苷酸序列相连的特定的启动子，其中该核苷酸序列编码选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其组合的氨基酸序列；以及从该转基因植物细胞中产生完整的植物。
16.权利要求15所述的方法，其中该植物选自水稻、小麦、大麦、黑麦、花生、谷物、玉米、马铃薯、甘薯、甜菜、萝卜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、胡萝卜、南瓜、小胡瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠萝、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗。
17.权利要求15所述的方法，进一步包括下列步骤从该完整植物或繁殖的完整植物中收获植物组织。
18.权利要求17所述的方法，其中该植物组织选自果实、茎、根、种子以及块茎。
19.一种生产转基因植物的方法，包括下列步骤用DNA建构体转化植物组织，该DNA建构体包含一种可操作性地与核苷酸序列相连的特定启动子，其中该核苷酸序列编码选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其组合的氨基酸序列；以及从该转基因植物组织产生完整的植物。
20.权利要求19所述的方法，其中该植物选自水稻、小麦、大麦、黑麦、花生、谷物、玉米、马铃薯、甘薯、甜菜、萝卜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、胡萝卜、南瓜、小胡瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠萝、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗。
21.权利要求19所述的方法，进一步包括下列步骤自从该完整的植物或繁殖的完整植物中收获特定的植物组织。
22.权利要求19或21所述的方法，其中该特定植物组织选自果实、茎、根、种子以及块茎。
全文摘要
本发明公开了一种DNA构建体以及其用途，包含一种可操作性地与核苷酸序列相连的第一特定启动子，其中该核苷酸序列编码选自SEQ IDNO2、SEQ ID NO4及其组合的氨基酸序列。该转基因植物以及植物组织中含有持续表达的高含量叶绿素。
文档编号A01H5/00GK1884548SQ20061008731
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月7日 优先权日2006年6月7日
发明者谢旭亮, 文日升 申请人:谢旭亮, 文日升