专利名称：：抗体在鸡中的组织特异性表达的制作方法抗体在鸡中的组织特异性表达本发明在政府资助下完成(USDASBIR2003-33610以及NIH2R44GM64261-01和2R44HD039583-02)。美国政府可拥有本发明的某些权利。
背景技术：
：遗传修饰动物在有价值的药物产品(如抗体)的可持续生产中提供了实现巨大进步的可能性。然而，遗传修饰动物的生产中还存在重大的技术障碍，这些障碍仅在少数物种中得以克服。将编码蛋白质的遗传修饰整合进物种DNA以实现特异性表达的能力需要若干特殊技术，这些技术必须针对每种遗传修饰而进行开发。改变动物的遗传和身体特征的一种方法是将细胞引入动物的受体胚胎。这些细胞能够对来自该受体胚胎的动物的組织有所贡献，并且能够对所得到的遗传修饰动物后代的基因组有所贡献。人们已将大量的时间和资源用于研究和开发细胞系、细胞基因组操作以及在培养中维持所述改造细胞的细胞培养技术。虽然已进行了很多尝试，但仅在少数物种(特别是小鼠)中实现了在培养中维持改造细胞多能性的能力。如果很容易获得可持续培养物，并在维持多能性的同时易于进行遗传改造的话，新技术将会有广泛的应用。因为培养细胞能对嵌合动物的组织有所贡献，所以可通过将这些细胞引入胚胎状态的受体动物而将产生胚胎干细胞的动物的生理特征转移至受体胚胎。这提供了两个主要的优点首先，可将产生胚胎干细胞的动物的表型选择性地转移至受体胚胎。其次，如上文所指出，当细胞培养物特别稳定时，则可以对所述细胞的基因组进行遗传修饰，从而在引入所述细胞的受体胚胎中引入遗传修饰。在某些情况下，所述细胞可以用编码抗体的转基因进行改造。转基因是一种遗传构建体，其包含作为产生抗体的蓝本的DNA，并包含足够的编码和调节元件，以使抗体能在将细胞插入受体胚胎所产生的动物的组织中表达。然而，从动物组织收集有价值的抗体一般需要将表达限制在某些特定的组织类型，所述组织类型便于收集表达蛋白质和传递期望的化学特性。例如，在奶牛中，蛋白质在奶中表达使蛋白质的收集简单易行，仅通过收集奶牛的奶并分离该外源蛋白即可。在鸡中，卵白中大量地产生抗体也为表达和收集抗体提供了有吸引力的载体。而且，当组织特异性表达特异性针对鸡的输卵管时，该表达产生具有某些特定的所期望化学特性的抗体，即用于人类患者的治疗时具有提高的抗体治疗效用。因此，研究和商业开发中一个特别吸SI人的领域即经遗传改造的鸡，其在卵中选择性表达抗体，以便于分离和收集具有所期望化学特性的蛋白质。在特别选定的动物细胞中选择性产生外源抗体的能力是特别有价值的，因为缺乏组织特异性只会导致抗体在动物的所有組织中表达。在这种情况下，不太可能从动物中分离数量有意义的抗体，外源抗体的普i4^达通常会对动物的总体健康和良好生存状态产生严重损害，并且未获得在鸡输卵管中表达时显示的所期望化学特性。如果细胞培养足够稳定，可允许转基因整合进细胞基因组，则可通过若干不同技术将编码抗体组织特异性表达的转基因传递到新的嵌合或转基因生物，所述技术取决于靶细胞和作为转基因的特定构建体。可以通过细胞杂交转移全基因组、通过微细胞转移完整的染色体、通过染色体介导的基因转移来转移亚染色体片段以及通过DNA介导的基因转移来转移千碱基范围的DNA片段(Klobutcher,L.A.和F.H.Ruddle，Annu.Rev.Biochem.，50:533-554，1981)。完整的染色体可以通过孩i细胞介导的染色体转移(MMCT)(Fournier，R.E.和RH.Ruddle,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74:319-323，1977)进行转移。转基因的具体设计也必须考虑编码抗体的DNA序列内含物、靼细胞系、表达所乾向的具体组织、发生表达的宿主生物以及待表达的抗体。为组织特异表达而设计的转基因必须满足若干要素，从而能够成功地整合进细胞基因组并确保在宿主生物体的选定组织中成功表达。如上所述，仅在极少数物种中证实了引入遗传修饰以产生转基因动物。就小鼠而言，为了产生嵌合和转基因后代，在单独利用同源重组之后再将染色体转移至胚胎干(ES)细胞是众所周知的。已经开发了位点特异性同源重组或基因打靶的强大技术(参阅Thomas,K.R.和M.R.Capecchi,Cell51:503-512，1987;综迷来自Waldman，A.S"Crit.Rev.Oncol.Hematol.12:49-64,1992)。克隆DNA的插入(Jakobovits,A.，Curr.Biol.4:761-763,1994)以及通过Cre-loxP系统技术操作和选择染色体片段(参阅Smith,A.J.等,Nat.Genet.9:376-385,1995;Ramirez画Solis,R.等，Nature378:720-724，1995;美国专利4,959,317;6,130,364;6,091,001;5,985,614)可用于将基因操作并转移进小鼠ES细胞，从而产生稳定的遗传嵌合体。如果有必需的长期细胞培养可供利用，并且如果将转基因设计成在特定组织中获得组织特异性表达以便于分离和收集外源蛋白，那么许多已在哺乳动物系统中证明可用的这些技术将可用于非哺乳动物系统。赋予组织特异性表达的转基因是复杂的，并且将转基因引入受体细胞系的必要遗传操作需要大量的操作，除非优化培养条件，否则上述操作会对细胞的多能性造成威胁。因此，适合在转基因发生中应用的细胞系必须既在培养中稳定，又必须在用遗传构建体转染细胞时保持多能性，所述遗传构建体足够大和复杂，可包含组织特异性表达所需的所有元件。在得到的动物中，所述转基因必须在设计表达转基因的特定单个组织类型中有效表达，并且不应该在其它组织中表达，以免损害动物的生存力或所得蛋白质的有利化学特性。就外源抗体的产生而言，鸟类生物系统提供了许多优点，包括高效的农场养殖、快速生长以及经济地生产。并且，鸟卵提供了理想的生物学设计，既可以大量地合成抗体，又易于分离和收集产物。另外，如下文的本
发明内容所述，与脊推动物、植物或细菌细胞系统相比，基于鸡的表达系统的优势是可以获得大量的抗体产物。发明概迷本发明包括在鸡中表达蛋白质以及实现以下技术，如遗传工程、转基因和用于得到嵌合和转基因鸡的细胞长期培养物。本发明还涉及在鸡中产生的抗体及其独有的化学特性。具体地，这些抗体具有在某些应用中提高其治疗效用的有利化学特性。在鸡中产生的抗体与在脊堆动物、植物或细菌细胞系统中产生的抗体相比具有独特的化学修饰模式，从而在以将毒素结合至靶组织(如肿瘤)为目的而向患者施用时，以提高的治疗效用治疗靶组织。在一个实施方案中，用特殊设计的遗传构建体改造胚胎干细胞的长期培养物，从而将遗传修饰引入嵌合鸟类中，包括插入获得外源抗体组织特异性表达的转基因。本发明的转基因鸟类在输卵管中表达转基因来源的抗体，并且在卵中累积大量抗体。在优选的实施方案中，外源抗体蛋白由人DNA序列编码，以使天然人抗体在鸡的输卵管中表达并可从卵中收集。本发明包括显示抗体组织特异性表达的鸟类种群、赋予外源抗体表达的转基因构建体、在鸡中产生且具有特定化学特性的分离的抗体组合物，以及产生所述鸟类的相关方法、抗体的产生及其在人类中的治疗用的嵌合或转基因鸟类，其中ES细胞的基因组具有稳定整合的表达外源蛋白的转基因，从而该培养细胞的后代含有该稳定整合的转基因。当通过下文所述方案引入宿主鸟类胚胎时，经修饰的供体细胞产生在所得动物中特别选定的体细胞组织中表达转基因的鸟类。这些鸟类显示来自供体细胞的表型，并在输卵管中表达抗体，以便于浓缩和收集卵白中的抗体。本发明还包括抗体组合物，所述抗体在鸡表达系统中表达，并且与脊堆动物、植物或细菌细胞系统相比具有某些期望的化学特性。具体地，所述抗体的岩藻糖、半乳糖、N-乙酰神经氨酸、N-羟乙酰神经氨酸浓度降低，而甘露糖浓度提高。施用于人时，具有一些或全部这些特性的抗体显示增强的治疗效用。特别地，这些抗体组合物显示增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。因此，本发明的方法包括通过在鸡中表达抗体来增强抗体组合物基于ADCC效应的治疗效用。在实际应用中，该方法包括施用本文所述的抗体组合物以及检测患者中的细胞毒性。本发明还包括鸡，其在输卵管组织中表达具有本文定义的有利化学特性的外源抗体，从而在卵白中浓缩确定量的外源抗体。在一个优选的实施方案中，所述外源蛋白质是由引入供体细胞系和后代基因组中的转基因构建体所编码的人序列单克隆抗体。该人单克隆抗体的编码多核普酸序列包含在转基因中，所述转基因为在输卵管中表达而特别构建，并包含适当的启动子和调节序列以便于组织特异性表达。在表达外源蛋白的转基因或嵌合鸟类的实施方案中，本发明包括对所述动物和所述蛋白质特异的组合物，如本文所述含有外源抗体的卵白蛋白。图1显示鸡ES细胞的特征形态，其中细胞单层生长，胞质^f艮少，核仁显著。图2显示鸡ES细胞的体外特性，特别是与抗体SSEA-1和EMA-1的反应以及碱性磷酸酶的表达。图3为已培养189天的鸡ES细胞的核型。细胞为二倍体，具有38对常染色体和一对Z染色体。图4为两只BarredRock鸡和两只通过将BarredRock鸡的ES细胞注射进WhiteLeghorn受体胚胎而形成的嵌合体。所述嵌合体和BarredRock鸡无法区分，表明ES细胞对黑素细胞谱系的贡献相当广泛。图5为通过将BarredRock鸡的ES细胞注射进WhiteLeghorn受体得到的嵌合体。左图中的一对嵌合体显示对黑素细胞谱系的贡献较少，而左图中的一对嵌合体显示了更广泛的贡献。图6A和6B为提供在鸡输卵管的管状腺细胞中组织特异性表达的转基因构建体，生理特征也证实了该组织特异性表达。图6A是舍有名为Ov7.5MAbdns的转基因的简图。图6B是包含组织特异性表达转基因的嵌合鸡的输卵管膨大部(magnum)切片，显示单克隆抗体选择性地在管状腺细胞而非其它细胞类型中表达。图7A和7B为RT-PCR分析，分别显示单克隆抗体的轻链和重链均在嵌合体的输卵管而非脑、肠、胰腺和肌肉组织中表达。图8显示来自鸡和CHO细胞的MAbFl的热稳定性，来自于CHO细胞(左上)和鸡管状腺细胞(右上)的MAbFl的DSC数据。将数据去巻积(deconvoluted)以拟合双态转移(two画state-transition)模型，在两种情况下均有三个峰(用红色显示)，得到CHO细胞中表达的抗体Tm值为62.7、69.4和83.4°C，来自鸡的抗体1\值为63.8、68.5和83.1。C。各个Fc-去糖基化抗体的DSC数据(分别为左下和右下)也拟合成双态转移模型，但在每种情况下具有两个峰，得到CHO表达的抗体Tm值为61.2和84.0'C,来自鸡的抗体Tm值为62.6和84.0'C。图9显示在鸡管状腺细胞和CHO细胞中产生的MAbFl的寡糖镨。标出了CHO产生的MAb的已知多糖结构。甘露糖用黑色圆显示；半乳糖用空心圓显示；N-乙酰葡糖胺用黑色方块显示；岩藻糖用黑色三角显示。图10显示由卵白纯化MAbFl。1:起始材料；2:A蛋白上才羊；3:A蛋白流过；4:A蛋白洗脱。在非还原条件下进行考马斯染色和Western印迹。在Western印迹中使用HRP标记的山羊抗人IgG(SouthernBiotechnology)进行检测。图11显示鸡或CHO细胞产生的MAbFl与LNCaP细胞上表达的PSMA的结合。"324-卵，，和"741-卵"是分离自卵的两种不同的MAbFl制备物。Fl-CHO是CHO细胞产生的MAbFl。抗CTLA4是不识别LNCaP细胞上的抗原的人IgGl对照MAb。图12是在鸡管状腺细胞和CHO细胞中产生的MAbFl的内化测定。"570-卵"和"741-卵，，是分离自卵的两种MAbFl制备物。以300ng/孔将每种MAb与Hum-Zap(抗人IgG，皂草毒素蛋白缀合物)或与细胞培养基一起加入LNCaP细胞中。加入MAb和HumZap48小时后测定细胞活力。Y轴为"相对发光单位(RLU)，，。图13显示在鸡管状腺细胞(Fl-鸡)和CHO细胞(Fl-CHO)中产生的MAbFl的体内清除。用每种放射性标记的抗体制备物注射四只BALB/c小鼠。在350小时中使用全身计数器测量残留辐射。数据表示为注射剂量的剩余百分比。图14显示在鸡管状腺细胞(Fl鸡制备物I和II)和CHO细胞(Fl)中产生的MAbFl在人IL-2存在下的ADCC测定。用不识别LNCaP细胞上的抗原的人IgGl作为同种型对照。图15显示在鸡管状腺细胞(Fl鸡制备物I和II)和CHO细胞(Fl)中产生的MAbFl在不存在人IL-2时的ADCC测定。用不识别LNCaP细胞上的抗原的人IgGl作为同种型对照。图16显示用抗CD16抗体阻断ADCC。图17显示来自鸡(蓝色)和CHO(红色)的MAbFl与CD16-Phe(左图)和CD16-Val(右图)的平衡结合。解离常数(KD)的估计值在对应的曲线附近显示。发明详述根据本发明，鸡ES细胞系来自具有大细胞核并含有显著核仁(图1)的X期胚胎。根据长期培养后的形态，这些细胞被证实是鸡胚胎干(cES)细胞，并且在注射入受体胚胎时形成嵌合体。而且，如通过广泛的羽毛嵌合状态所确定的，该ES细胞能够对体细胞组织有很高程度的贡献。此外，还证实了这些胚胎干细胞被携带编码外源蛋白的DNA的转基因所转染。所述ES细胞稳定整合转基因并表达转基因，从而能挑选转化细胞。这些转化细胞能形成嵌合体，其中转基因编码的外源蛋白存在于嵌合体的选定组织中。衍生自嵌合体的细胞表达转基因编码的外源蛋白。在特别优选的实施方案中，转基因编码的外源抗体根据该转基因编码的抗体而在特定组织或组织类型中表达。胚胎干细胞后代是ES细胞的衍生物，所述ES细胞在被引入受体胚胎并形成嵌合体后分化成非-ES细胞表型。通过在胚胎外和体细胞组织中表达证明了转基因在体细胞组织中的广泛表达。转基因动物卵的蛋白质含量分析证明了使用本发明技术由转基因获得的该转基因所编码的外源蛋白在卵白中选择性表达。根据其基本上限制在一种器官、组织或细胞类型中表达，证实了组织特异性表达。实施例1-鸡胚胎干细胞(cES细胞)的衍生鸡ES细胞来自两种杂交之一BarredRockxBarredRock或者BarredRockxRhodeIslandRed。选择这些品种以获得测试cES细胞发育潜能时的羽毛标记。将所述cES细胞注射进在显性白色基因座为纯合显性的WhiteLeghorn胚胎。由注射这些ES细胞得到的嵌合鸡表现出来自cES细胞的黑色羽毛和来自受体胚胎的白色羽毛。cES细胞培养物的初始建立才艮据USP5，565，479中所述操作进4亍。在X期，胚是位于卵黄表面上的小圆盘，由约40,000-60,000个细胞组成。为了回收胚，将一个纸环放在卵黄膜上，使胚暴露在中间。沿着环切割卵黄膜，然后从卵黄上提起环。将附于环腹侧的胚置于显孩i镜下，并使用细环将明区与暗区分离。表1:CES-80培养基中在STO铜养细胞或聚酯插入物上衍生的cES细胞系。所述培养从单个胚和混合胚开始。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>将胚胎机械分散成单细胞悬液，并接种在浓度为3x1(^个细胞/cm2的有丝分裂失活STO细胞汇合饲养层上。cES培养基由补充了10%FCS、1%青霉素/链霉素、2mM谷胺酰胺、lmM丙酮酸、lx核苦、1x非必需氨基酸和0.1mMP-巯基乙醇的DMEM(20%新鲜培养基和80%条件培养基)组成。在4吏用前，该DMEM培养基在Buffalo大鼠肝(BRL)细胞上进行条件化调节(condition)。简言之，将BRL细胞培养至汇合后，加入含有5%血清的DMEM并进行3天条件化调节。移出培养基，将新一批培养基进行3天条件化并重复。将这三批培养基混合在一起，用于生成cES培养基。鸡ES细胞在接种囊胚层细胞3-7天后开始可见。这些cES细胞在形态上与mES细胞相似；细胞小且具有大细胞核和显著的核仁(见图1)。cES细胞的生长特征与mES细胞不同，mES细胞以边缘光滑的紧密圆形集落生长，难以区分单个细胞。鸡ES细胞呈单层集落生长，单个细胞清晰可见。紧密的集落常常是cES培养中分化的第一个标志。为了测试培养物中衍生的细胞的多能性标记，将所述细胞固定并用SSEA-11(Solter，D.和B.B.Knowles，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.75:5565-5569，1978)、识别小鼠和鸡原始生殖细胞上表位的EMA-1(Hahnel,A.C.和E.M.Eddy,GameteResearch15:25-34，1986)和也在多能细胞中表达的碱性磷酸酶(AP)染色。这些测试的结果示于图2，证明鸡ES细胞表达碱性磷酸酶和被SSEA-1和EMA-1识别的抗原。虽然cES细胞在使用以上操作后是可见的，但是这种培养不可能维持到几周以上。如下文讨论的，在培养条件中引入一些修饰，衍生出19个细胞系(表l)，通过注射入受体胚胎检测了其中14个细胞系的发育潜能。通过检测羽毛色素形成，发现14个细胞系中的ll个对受体胚有贡献(见下文表2)。这一操作获得了表现胚胎干细胞表型的多能细胞的持续培养物。可在任何时间点冷藏细胞，并且将细胞注射入受损(compromised)受体胚胎时具有对体细胞组织作出显著贡献的潜能(见以下实施例3和5)表2:来自单个或混合胚胎的胚胎干细胞系培养中的传代数和传代时间。将这些cES细胞注射进X期受体后体细胞嵌合状态的频率和程度。细胞系供体胚传代数~培养时间#注射#嵌合体数^嵌合体(天)胚胎数分析数百分比嵌合程度1_(%)31混合的04152728.51-5317混合的412292102025-6536混合的11324152015307混合的4152116175330单个的6331138255-5063b混合的117236421191-10671单个的345280150-单个的1065250150-009混合的206127090-329单个的31531817473-7532962530919473-9532962826112823329114910142560029混合的43340927335-8002993740415274-15328单个的656194113610-8032812诉33722325-50314混合的17523025405-6531415-175329142530314175537315303-80314166527211185-403141461250130-3141665323142110-603142061304804-50314216730211185-1531421718020-50混合的75335723304-655014106363211410-30嵌合程度通过黑色羽毛的比例来测定。像小鼠一样，鸟类胚胎干细胞在多种饲养层上衍生，包括STO、STO-snl以及其它可方便获得的细胞。这些词养细胞产生的白血病抑制因子(LIF)以及添加的胎牛血清有助于将ES细胞维持在未分化状态。在本发明的优选实施方案中，鸡ES细胞培养在STO饲养层上起始。将STO细胞培养至汇合，用10ng/ml丝裂霉素处理3-4小时，洗涤，用胰蛋白酶处理，并以4xl(^个细胞/cm2接种在明胶包被的皿上。cES细胞看来在STO饲养细胞稀疏时生长较为迅速。将STO饲养细胞的浓度降低至103-105个细胞/112，优选低于10"个细胞/cm2,可促进cES细胞的衍生和增殖。然而，当使用鸡胚胎成纤维细胞和小鼠原代成纤维细胞作为饲养细胞时，cES细胞均不衍生。同样，将预先建立的cES细胞铺在这些祠养细胞上时，所有细胞均在一周内分化。在不存在饲养细胞时在合成插入物如聚合物膜(Costar，Transwell型)上培养cES细胞避免了注射ES细胞时饲养细胞污染受体胚胎。如表3和4所示，在插入物而不是STO饲养细胞上培养有利于cES细胞的衍生，并且插入物可以用于初始衍生。然而，ES细胞在插入物上开始快速生长后，其有丝分裂活性在培养4-6周后下降。为了延长培养，需要将细胞转移到STO饲养细胞上。表3.在插入物或STO饲养细胞(10000个细胞/cm2)上从单个胚胎建立cES细胞。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表4.在STO祠养细胞或合成插入物上从混合胚胎建立cES细胞。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>STO饲养细胞737(9.5%)插入物172(12%)10表3和4的数据显示鸡胚胎饲养细胞和小鼠原代胚胎成纤维细胞不支持cES细胞的衍生或培养。STO饲养细胞支持衍生和生长，但只是在103至105个STO细胞/cm2之间的有限浓度内，但在本实施方案中，优选浓度低于或约为104个细胞/112。密集的STO饲养层损害cES细胞的生长，而指定浓度的STO细胞提供了ES细胞增殖所必需的西子。当所述细胞维持在较长的培养期、继续表现胚胎干细胞的表型并且在体内分化成非胚胎干细胞表型时，则将这些细胞称为"ES细胞后代"。所述cES细胞培养基由80%条件培养基组成，并且优选包含某些含有cES细胞衍生和生长所必需的因子的BRL条件培养基。在50%的浓度下，cES细胞的生长不如在80%条件培养基中可靠(reliable)。当条件培养基的百分比减少到50%以下时，发生分化的细胞增加，证明cES细胞的生长受到影响，在30%或更低的浓度下，cES细胞在一周内发生分化。这种已发现为cES细胞的衍生和维持所必需的条件培养基不维持mES,而是引起其分化。胎牛血清是本发明ES细胞培养基的优选组分，含有维持cES细胞为未分化状态的因子。然而，血清中也已知包含诱导分化的因子。对于市售的血清批次，使用者对其维持ES细胞为未分化状态的潜能进行常规测试。已知用于cES细胞培养的血清与用于小鼠ES细胞培养的血清不同。例如，用于小鼠ES细胞培养的血清含有低浓度的细胞毒素和血红蛋白(已知其维持小鼠ES细胞处于未分化状态)，不支持鸡ES细胞的持续生长。因此，用于鸡ES细胞的血清不应在小鼠ES细胞上进行测试而确定其作为培养基组分的适用性，而应该在鸡ES细胞上进行测试。为此，将鸡ES细胞培养物分成两份并用于测试每个新批次的血清。进行经验性测试时，所测试的新批次必须明显地支持鸡ES细胞的生长。鸡染色体涂布(chromosomalspread)需要不同于小鼠的特殊评估技术，因为其复杂的核型由IO个大染色体、66个小染色体以及一对性染色体(雄性为ZZ,雌性为ZW)组成。图3显示的本发明长期cES细胞在培养189天并两次冷藏后用于分析。参照图3，它们表现10个大染色体、两个Z-染色体和66个小染色体的正常核型。将鸡ES细胞冷藏在含有10%DMSO的培养基中。在融化并将某些细胞系注射进受体胚胎后获得了体细胞嵌合体，表明cES细胞在冷藏过程中维持其发育潜能。实施例2-将鸡的胚胎干细胞注射进受体胚胎。为了进入新产的卵中的胚胎，必须破坏壳，这不可避免地会导致在21天孵化期结束时孵化率的降低。常规是在卵的侧面切开一个小洞(直径小于10mm)，并通过该小洞操作胚胎，再用胶带、玻璃盖玻片、壳膜或一片壳将其重新密封。虽然相对易于实施，但这种"开窗"法会造成70%至100%之间的胚胎死亡。可以通过使用两种不同的壳和一种方法(改进自Callebaut)(Callebaut,Poult.Sci60:723-725，1981)和(Rowlett，K.andK.Simkiss,J.Exp.Biol.143:529-536,1989)将胚胎转移到代用卵壳中孵育孵化，来实现改进胚胎进入方式以及提高存活和孵化率，平均孵化率约为41%(范围为23-70%)，从469个注射了cES细胞的胚胎中孵化了191只鸡，其中所述文献作为该技术的参考特别并入本文。将供体ES细胞注射进受体胚胎后的胚胎孵育可以分为两部分，包括下述的系统A和系统B:系统A涵盖产卵后发育的前三天。将包含受体胚胎的受精卵与比其重3至5克的卵匹配。在尖端切开一个32mm直径的窗，移出内含物，将卵黄上的受体胚胎与周围的卵白一起小心地转移到代用壳中。用无菌的细锥形玻璃移液管吸取细胞，所述移液管与装配2pm滤器的口形抽吸器相连。移液管开口的直径可以从50至120fim，并具有30。的锥形斜角。在低倍放大下用蓝光使胚胎显影。将鸡ES细胞用胰蛋白酶处理成单细胞悬液，并将约2，000至26,000个细胞、优选约20,000个细胞注射进胚胎中。轻轻地将所述细胞推到胚胎以下或以上的空间，即进入胚下腔(sub-embryoniccavity)或明区顶面(apicalsurface)与卵周层(卵黄膜)之间。加入从新鲜受精卵收集的额外的卵白，并用SaranWrap塑料膜将壳密封。系统B涵盖从第三天至孵化的阶段。在孵育的第三天，胚胎已达到17期左右(H&H)。水已从卵白转移至胚下腔，导致卵黄扩大并变得非常脆弱。非常小心地将系统A壳的内含物转移至另一个代用壳(通常为火鸡卵)，此代用壳比最初的卵重30至35克。加入青霉素和链霉素以防止细菌污染，并用塑料膜密封钝端38至42mm的窗口。这个更大的壳容许有人工气室。在孵育的第18至19天，将所述胚胎培养物转移至桌面孵化器以进行密切观察。因为肺通气已经建立，因此周期性地在塑料薄膜中制造小洞从而使周围的空气进入气室。孵化前约6-12个小时，用小培养皿代替薄膜，小鸡可以在孵化时容易地将所述培养皿推开。孵育中维持代用壳中胚胎的常规温度(37.5至38°C)和相对湿度(50%至60%)，然而，需要对定期的卵摇动(通常是每小时一次，90度)加以改进，以确保存活良好。在系统A中，每4至5分钟摇动90。；在系统B中，每40至45分钟摇动40-60°。在两个系统中，摇动速度均维持在每分钟15至20。。如果按以下方法制备受体胚胎，则cES细胞对嵌合体的贡献将会提高在注射cES细胞前(1)通过暴露于660radY射线进行照射(2)通过从胚胎中心机械移除约1000个细胞进行改变，或组合上述(1)和(2)。参照表5，通过从受体胚胎中心移除细胞或通过暴露于辐射而使受体胚胎受损时，cES细胞对体细胞组织的贡献都显著提高。通过辐射和机械移除细胞的组合使受体胚胎细胞受损时，即使cES细胞已经过更长时间的培养，其贡献也会进一步提高。一些得到的嵌合小鸡与纯种BarredRock小鸡无法区分(图4)。如表5中的数据所示，每个胚胎的嵌合率和嵌合程度均在使受体胚胎受损后提高。表5:将cES细胞注射进通过不同方法损害的受体胚胎后的体细胞嵌合频率。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>也可以以ES细胞作为供体，使用显著早于X期的受体胚胎产生嵌合体。早期受体胚胎通过向母鸡注射催产素引发早产卵而获得，在VII至IX期获得受精卵。或者，从输卵管的膨大部区域回收胚胎可以得到由约4-250个细胞组成的I期至VI期胚胎，这使得能够由所有胚胎时期作为潜在受体胚胎而发育成嵌合体。实施例3-来自鸡胚胎干细胞(cES)的体细胞嵌合体。将鸡ES细胞注射进WhiteLeghorn受体胚胎。在第一轮实验中，在28个实验中将总计14个细胞系注射进X期受体胚胎(见表2)。所述cES细胞已在培养中增殖4至106天之间，并且一些细胞系已被冷藏。用胰蛋白酶对鸡ES细胞稍加处理，得到cES细胞小团，并重悬在补充了25mMHEPES+10%胎牛血清的DMEM中。将含有2000-5000个细胞的3至5nl细胞悬液注射进受体胚胎的胚盘下腔中。对所有发育出羽毛的胚胎进行分析，通过羽毛颜色检测，其中24%(83/347)的胚胎是嵌合的。从11/14个细胞系获得了羽毛嵌合体。嵌合程度在1%至95%之间变化，平均程度为25.9%(SD=20.4)。表2展示了在进行的实验之间，体细胞嵌合在细胞系之内以及细胞系之间的变化。ES细胞对嵌合体贡献的实例示于图4和图5。在图4中，两只小鸡是嵌合体，两只是BarredRock;这些小鸡之间显然没有表型差异，表明ES细胞对嵌合体的贡献是广泛的，尤其是在来自外胚层的谱系中。在图5中，左边的嵌合体中来自ES细胞的贡献水平相对低，而右边的那些具有中等水平的贡献。实施例4-通过脂质体法和和电穿孔法转染cES细胞参照表6，将与被转染孔大d、一致的适量DNA在不含血清或抗生素的培养基中稀释。加入适当体积的Superfect(Stratagene)并与DNA混合，反应可以进行5-10分钟。除去培养基，并用不含Ca/Mg的盐溶液洗涤待转染的孔。向DNA/superfect混合物中加入适当体积的培养基，所述培养基中可以含有血清和抗生素。培养板在37'C孵育2-3小时。孵育完成时，通过洗涤细胞1-2次除去Superfect,并加入新鲜培养基。表6:使用Superfect转染鸡ES细胞的条件。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>使用petri脉冲发生器电穿孔cES细胞，所述细胞附着在平板的直径35mm孔中。除去培养基，并用不含Ca++和Mg++的盐溶液洗涤小孔。向孔中加入1ml电穿孔液。加入DNA，并轻柔地混合培养基。将petri脉冲发生器降低至孔底上，〗吏电流通过。(电压优选在100-500V/cm之间变化，脉冲长度可以为12-16ms)。移开petri脉冲发生器，将已电穿孔的孔在室温下静置IO分钟。IO分钟后，加入2ml培养基，并将皿放回培养箱。为了转染悬液中的细胞，除去培养基并用不含Ca/Mg的盐溶液洗涤细胞。加入含有EDTA的胰蛋白酶，以获得单细胞悬液。在已修正的电穿孔緩冲液如PBS中洗涤、离心并重悬细胞。将ES细胞悬液置于无菌小杯中，并将DNA(最低浓度为1mg/ml)加入细胞悬液并利用移液管吹吸混合。对细胞进行电穿孔并室温静置10分钟。将细胞从小杯中移出并分配在预先制备的孔/皿中。将细胞置于培养箱中，并在电穿孔后24-48小时进行评估或瞬时转染。还可以通过在培养基中包含抗生素如嘌呤霉素开始选择抗生素抗性细胞。在优选的实施方案中，以滴定杀死曲线计算选择转染细胞所需的噪呤霉素的浓度。鸡胚胎干细胞的滴定杀死曲线通过使培养中的细胞接触浓度为0.0至1.0pg/ml的嘌呤霉素10天(表7)以及浓度在0.0至200pg/ml之间的新霉素(表8)来建立。每2天更换培养基并加入新的嘌呤霉素或新霉素。接触浓度为0.3|ag/ml的噤呤霉素时，在6天中更换含有新嘌呤霉素的培养基3次后，ES细胞在从所有的孔中消失(见表7)。使用0.3-1.0pg/ml的嘌呤霉素浓度选择经转染的培养物。高于40ng/ml的新霉素浓度在7天内清除所有cES细胞(表8)。选择10天后，可看见cES细胞集落，并能挑取用于进一步扩增。表7:cES细胞在接触不同的嘌呤霉素浓度和经历不同时间长度(加入嘌呤霉素后的天数)后的形态。嘌呤霉素浓度选择时间(天)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>ES:存在ES细胞。diff:ES细胞发生分化。gone:不存在形态可识别的细胞表8:cES细胞在接触不同的新霉素浓度和经历不同时间长度(加入新霉素后的天数)后的形态。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例5.组织特异性抗体表达取决于转基因的设计，将编码外源抗体的DNA设计成只在选定的组织中表达显著水平的抗体。转基因构建体可以包含遗传元件，所述遗传元件来自宿主生物的基因組，并基于抗体在选定组织中的已知表达或表达模式来选择。为了在特定组织中表达，选择编码在所选组织中正常表达、通常高表达的蛋白质的基因，选择该基因的调节元件驱动外源抗体的表达。与编码外源抗体序列的DNA組合时，可以将其它调节元件如卵清蛋白、卵转铁蛋白(ovotransferrin)、卵类黏蛋白、卵黏蛋白、溶菌酶、卵球蛋白、卵抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、卵糖蛋白、卵黄素蛋白、卵巨球蛋白或抗生物素蛋白启动子与编码选择标记的基因组合和/或与IRES组合使用。所述转基因在选定组织(优选卵白)中获得抗体的偏好表达。在特定组织类型中的偏好表达可以定义为在选定组织中的表达比非选定組织中高3至4个数量级。对于在转基因鸟类中的组织特异性抗体表达，组织特异性表达优选针对输卵管区域，包括膨大部、峡部、壳腺或漏斗。膨大部含有表达卵白主要蛋白质的管状腺细胞，而峡部含有表达壳膜的细胞。通过选择来自表达卵白蛋白质的基因的调节序列(通常包含启动子)，可以使可溶性蛋白质的表达优先针对输卵管膨大部的管状腺细胞，所述卵白蛋白质优选为卵清蛋白，但也包括卵转铁蛋白、卵类祐蛋白、溶菌酶、卵球蛋白G2、卵球蛋白G3、卵抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、卵糖蛋白、卵黄素蛋白、卵巨球蛋白和抗生物素蛋白。下文证实了在管状腺细胞中而不在上皮细胞中表达的选择性表达，称为区分两种细胞类型选择性的偏好表达。在以下的实施例中，构建含有内源卵白调节序列的转基因，以获得在输卵管管状腺细胞中的组织特异性抗体表达，该调节序列包含启动子和外源免疫球蛋白基因座。其后，这样表达的抗体分子沉积在转基因鸡的卵白中。在该实施方案中，任何重排免疫球蛋白基因所编码的抗体在包含输卵管膨大部区域管状腺细胞的组织中特异性表达，并且可以从卵白中分离。编码单克隆抗体的重排免疫球蛋白基因在输卵管中偏好表达，基本不在其它组织中表达，虽然在其它组织中的表达可能高于可检测水平。在该实施方案中，在卵清蛋白调节序列控制下的单克隆抗体盒包括至少3.4kb、优选至少约7.5kb的5，调节序列，并且可以包括15kb或更长的3，调节序列。优选地，构建体在外源抗体编码区的5，和3，端两侧包含卵清蛋白基因区，尽管5，侧翼区中足够大的内源启动子序列区段可以不需要3，侧翼区。抗体的重链和轻链编码区在转基因中提供，包括选定同种型的可变区、多变区、连接区和恒定区。在优选的实施方案中，抗体由特征为人、并至少含有人重链的免疫球蛋白基因编码。同样地，所述同种型优选为IgG,最优选为IgGl。图6A给出了用于来自卵清蛋白的单克隆抗体构建体的优选转基因构建体。该转基因构建体称为Ov7.5，具有位于MAb编码区域5，末端序列侧翼约7.5kb的卵白调节序列(包含启动子，在该特定实施方案中为卵清蛋白启动子)和编码区3'末端15kb的启动子序列。所述编码区包含轻链和重链可变区、J-C内含子序列、K轻链的恒定区、IRES序列和yl同种型重链恒定区。构建体的3，端包含GFP基因和选择标记，在该情况下为本文所述cx启动子驱动的噤呤霉素抗性基因。单克隆抗体编码区3，和5，的卵清蛋白启动子序列长度仅为举例，类似的构建体可以包括25-100kb或更长的5，序列以及不同长度的3，序列。本领域的普通技术人员会理解，GFP标记的存在仅是为了用于生理样本的检测，可以将其去除而不破坏转基因的效用。可以用能选择已成功转化转基因的胚胎干细胞的任何标记代替嘌呤霉素抗性标记。若干类型的类似选择标记是本领域众所周知的，并基本上可以与本实施方案的噪呤霉素抗性基因互换使用。如上所述，该单克隆抗体只是可以使用本发明转基因构建体表达的数种类型单克隆抗体产物中的一个实例。而且，作为蛋白质的一个类别，的许多蛋白质产物类别中的一个实例。参照图6B，通过注射雌激素诱导Ov7.5转基因表达的两周龄嵌合体输卵管膨大部切片显示了产生抗丹酰单克隆抗体的细胞的组织特异性表达，证实了已转化Ov7.5转基因的胚胎干细胞的贡献，其中所述细胞来自表达GFP的转化胚胎干细胞，在图6B的左上图中显示为绿色。参照图6B的左下图，在管状腺细胞中单克隆抗体染成红色，而同样来自供体胚胎干细胞的上皮细胞则染成绿色而非红色。这种染色差异证明构建体的表达是组织特异性的，并且通过转基因的内含物对特定组织类型进行选择。尽管下文的实施例证明了输卵管管状腺细胞中的组织特异性表达，但在所有细胞和组织类型中的表达证明，每一种组织类型均可选用于组织或细胞特异性表达，这是通过相应地选择转基因构建体的组分和例如启动子或其它调节元件来实现。在图6B的右上图中，所有的细胞类型均通过DAPI染色显示。在右下图中，将染色重叠，以证明只有来自供体的管状腺细胞表达单克隆抗体，而来自受体的细胞和来自供体的上皮细胞不表达单克隆抗体。图7C和7D为RT-PCR分析，分别显示抗丹酰单克隆抗体的重链和轻链只在3或5个嵌合体的输卵管组织中选择性表达，而不在这些嵌合体的脑、肠、胰腺或肌肉中以高于RT-PCR可检测的水平表达。为了证明人IgG同种型单克隆抗体可以选择性表达，并且所述蛋白质在卵白中累积，通过注射携带Ov7.5构建体的cES细胞产生总计18只雌性嵌合体。使用该组中6只嵌合体通过早期雌激素诱导检测转基因的表达。将其余12只雌性嵌合体祠养至性成熟用于收集卵。9只雌性嵌合体在17-22周龄时开始产卵，其中一只为偶发性产卵。3只雌性嵌合体在35周龄时仍未产卵，尸检发现其生殖腺由于存在来自雄性ES细胞的组织而明显雄性化。收集来自9只产卵嵌合体的卵，通过疏酸铵沉淀法制备代表性的卵白样品，并通过ELISA进行分析。用山羊抗人IgG抗体包被」微孔板，并通过针对重链的标记山羊抗人IgG(y链特异性)抗体和/或针对轻链的标记山羊抗人k(k链特异性)抗体显示卵白样品中人IgGMAb的存在情况。利用纯化的人Igyl、k蛋白建立标准曲线。ELISA的灵敏度为0.8ng/ml。使用来自非转基因WhiteLeghorn母鸡的卵白样品作为阴性对照。在来自非转基因WhiteLeghorn母鸡(4个卵)或来自6只嵌合母鸡(#OVll-17母鸡的8个卵，#OVll-53母鸡的8个卵，#OVll-73母鸡的6个卵，#OVll-88母鸡的6个卵，#OV12-97母鸡的4个卵以及#OV13-13母鸡的5个卵)的卵中没有检测到人IgGMAb的累积。在来自3只不同嵌合母鸡的卵检测到了人IgGMAb的累积(弁OVll-13母鸡的卵为~1.4-6.3ng/ml，弁OVll-37母鸡的卵为~2.0-2.9ng/ml,#OVll-43母鸡的卵为~2.9-10.8ng/ml，通过针对IgH的ELISA测定)。代表性卵中人IgGMAb的浓度总结于表9。在卵中通过针对IgL的ELISA测定的人IgGMAb浓度始终低于通过针对IgH的ELISA测定的浓度。一般而言，通过IgL测定的浓度是通过IgH测定的浓度的60%(比较表9中的第3和第5列)。所述差异也存在于由纯化的人IgYl、k蛋白制成的掺标样品(spikedsample)中。表9.嵌合体的卵中人IgGMAb的累积<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>*多次制备并测定了一些印白样品并取平均值。""使用掺入已知量纯化人IgGl、K蛋白的阴性对照印白4羊品估计;阵品制备的回收率为50-70%,第4列给出的IgG值是基于70%的+羊品制备回收率进行校正，以提供对卵白中人Ig浓度的保守估计。来自弁OVll-13、#OVll-37母鸡(它们在卵中累积人IgG)和WhiteLeghorn的血样中人IgGMAb蛋白的浓度低于测定灵敏度(0.8ng/ml)。这些数据与使用RT-PCR评估人Ig转录物在雌激素诱导的嵌合鸡的肠、脑、胰腺和肌肉中的存在情况时(图7C和D)观察到的不存在人Ig异位表达的结果一致。因此，Ov7.5构建体看来在转基因嵌合母鸡中传递组织特异性、受激素诱导并且受发育调节的基因表达。而且，所述蛋白质似乎从输卵管膨大部的管状腺细胞中输出，并在卵白中累积。来自卵清蛋白的组织特异性蛋白质表达转基因构建如下筛选鸡基因组BAC文库(Crooijmans,R.P.等，Mamm.Genome11:360-363,2000)，(TaxasA&MBACCenter)，以分离卵清蛋白基因座中46Kb的区域。构建在MAb编码区5'含有卵清蛋白启动子不同片段的两种不同载体(1)Ov7.5MAb-dns:包含来自卵清蛋白基因的9.2Kb5'序列(包括7.5Kb启动子)和15.5Kb3，侧翼序列的42Kb表达载体(图10A)。该42Kb表达载体包含来自卵清蛋白基因的9.2Kb5，序列(包括7.5Kb启动子)和15.5Kb的3，侧翼序列。双顺反子单克隆抗体盒编码抗丹酰抗体的轻链、IRES和重链。(2)Ovl5MAb-dns:包含来自卵清蛋白基因的16.8Kb5，序列(包括15Kb启动子)和15.5Kb3，侧翼序列的49Kb表达载体(未显示)。该49kb表达载体包含来自卵清蛋白基因的16.8Kb5'序列(包括15Kb启动子)和15.5Kb3，侧翼序列。所述单克隆抗体盒在两种构建体中是相同的。如上文所述，将在两种载体表达的基因的一个实例是小鼠-人杂合抗丹酰单克隆抗体(MAbdns)。将CxEGFP/CxPuro盒克隆在3，最末端，以允许使用噤呤霉素筛选cES细胞中的稳定转染并且容易地鉴别嵌合体中的转染细胞。在转染进cES细胞之前将两种构建体线性化并纯化。使用SuperFect(Stratagene)或petri國脉沖发生器电穿孑L,用Ov7.5MAbdns和Ovl5MAb进行cES细胞转染。使用嘌呤霉素选择后，挑选出6个抗性克隆进行分子分析。通过PCR证实转基因的存在，其中使用位于MAbdns盒、GFP基因和Puro基因中的引物。待表达抗体的另一实例是全人抗人PSMA单克隆抗体(MAbFl)。MAbFl的相应V基因通过PCR获得，并用于替换Ovl5MAb-dns中的V基因。将该转基因稳定整合进雌性ES细胞中，并将稳定转染的细胞注射进X期受体胚胎。将得到的嵌合体培养至性成熟，通过ELISA评估卵中人单克隆抗体的浓度。30只母鸡中的4只以高于lmg/卵的浓度在其卵中累积抗体(表9A)。MAb/卵的平均值(mg)母鸡数卵中[MAb]的范围(□g/ml)MAb/卯的范围(mg)>1.0434.6447.90.7-3.4>0.5至1.069.0-61.60.2-1.4>0.1至0.573.3-23,20.1-0.6>0,01至0.1130.2-5.40,01-0.1每只母鸡的MAb/卵平均值为2至10个卵的平均值。表9AOvl5MAbFl嵌合体的卵中人IgGMAb的浓度实施例6—抗体产物的表征在若干测定中对鸡中产生的MAbFl与常规CHO细胞培养中产生的MAbFl进4亍比较。1.抗体的SEC-HPLC分析使用4.6x300mmBioSepSECS3000柱(Phenomenex),在Waters2795HPLC上分析约10py的IgG样品。色镨分析在0.1M磷酸钠、0.15MNaCl和0.1M石危酸钠，pH7.2中以0.4ml/分钟的流速进行20分钟。在A28。监测分离情况。使用分子量标准品(Bio-Rad)确定近似分子量。SEC-HPLC分析显示两者的IgG单体都超过90%(表10)。表10MAbFl的SEC-HPLC分析<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>2.蛋白质的NanoLCESIMS/MS分析使两种MAb制备物还原并烷基化、透析过夜并在25mM碳酸氢铵(PH8)中在37。C用胰酶消化4小时。在与以阳离子模式操作的QSTAR脉冲质i普仪(MDSSciex,Concord,Ontario,Canada)相连接的NanoHPLC系统(Dionex,Sunnyvale,CA)上测定两种胰酶消化物的串联质谱，使用碰撞诱导解离(CID)获得串联质谱。每个样品注射pllml的等分试样，并使用75mm直径的nmPepmapC18柱以250nl/分钟的流速进行分离。流动相为溶剂A(95%水、5°/。乙腈、0.5°/。甲酸)和溶剂B(20。/。水、80%乙腈、0.5%甲酸)。所述仪器以信息依赖性采集(informationdependentacquisition)模式操作，操作循环为7s，记录完整波谱2s,然后选择强度最高的离子以记录接下来5s的CID波谱。使用Mascot(MatrixScience,London,UK)分才斤波i普。通过所描述方法分析两种MAb制备物，显示无序列差异。表11.通过质详对鸡产生的和CHO产生的MAbFl进行序列分析肽位置理论质量CHOHuMAb中观察到的质量(Da)鸡HuMAb中观察到的质量(Da)序列(SEQIDNO.)Tl1-121227.681227.69*1227.68*AVQLVQSLGAEVK(1)Tl1-191967.101967.121966.90AVQLVQSLGAEVKKPGESLK(2)T424-381720.791720.671721.08GSGYSFTS兩GWAR(3)T4-T524-432262.022262.782259.9GSGYSFTSFWIGWARQMPGK(4)T644-591808.841808.741808.73PGKGLE丽GIIYPGDSDTR(5)T760-741626.781626.701626.69YSPSFQGQVTISADK(6)T875-871482.771482.931482.77sistaylqwsslk:(7)T10112-1231149.621149.57*1149.54GTLVTVSSASTK(8)Tll124-135U85.631185.60*1185.60*GPSVFPLAPSSK(9)T12136-1491263.64—1263.5*STSGGTAALGCLVK(10)T15-17216-2241060.55—1060.4RVEPKSCDK(11)T16217-220470.21—471.22VEPK(12)T17221-224508.20_—508.23SCDK(13)T19251-257834.33834.43*834.31DTLMISR(14)T1925卜257850.31850.42*—DTLM(ox)ISR(15)T20258-2762080.992080.992081.78TPEVTCVYVDVSHEDPEVK(16)T21277－2901676.791676.651676.74FNWYVDGVEVHNAK(17)T22-t23291-3031670.80—一1670.83TKPREEQYNSTYR(18)T24304-3191806.991807.211806.97VVSVLTVLHQDWLNGK(19)T27-t28325-3361265.731265.70*1265.61VSNKALPAP正K(20)T28329-336837.49837.49*837.49*ALPAPIEK(21)T29337-3461084.631084.42—TISKAKGQPR(22)T32347-3571285.66—1285.67*EPQVYTLPPSR(23)T32-33347-3621871.98—1871.97EPQVYTLPPSRDELTK(24)T34363-3721103.60—-1103.49*NQVSLTCLVK(25)T34363-372837.49訓.62*1160.62*NQVSLTC(carb)LVK(26)T35373-3942543.12—2543.15GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK(27)T36395-4111872.911872.771872.65TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK(28)T37412416574.30574.33—LTVDK(29)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>3.LC-MS分析通过在60。C孵育样品卯分钟将4M盐酸胍中的IgG样品(50hy)在25mMDTT中还原。接着在黑暗中以室温在45mM碘乙酸中使样品烷基化15分钟，用22mMDTT终止反应。在LC-MS之前，用1L25mM碳酸氢铵透析样品，并使用装备MicromassZQ质镨仪的Waters2795HPLC将50pl每种样品注射进PorosR1/102.1x100mm柱(AppliedBiosystems),以阳离子模式进4亍分才斤。流动相为(A)0.1%甲酸和0.01%三氟乙酸(TFA),以及(B)含0.1%甲酸和0.01%TFA的100%CH3CN。洗脱(0.25ml/min)的线性梯度为(A)与(B)的比率在100分钟内从10%变化到60%。L链的分析显示两种MAb制备物具有相同的质量(+/-3Da.)(表12)表12MAb轻链的LC-MS分才斤<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>4,通过差示扫描量热法测定热稳定性在鸡和CHO表达系统中产生的MAbFl的热稳定性通过使用差示扫描量热法(DSC)获得，并与其在Fc结构域中去糖基化的相应形式进行比较。熔解温度(Tm)量热法测量在VP-毛细管DSC差示扫描测微量热计平台上进行，该平台与自动取样器(MicroCalLLC,Northampton,MA,USA)联合使用。样品室体积为0.144mL。抗体的糖基化和去糖基化形式的变性数据通过加热浓度为2.3nM的样品获得(以rC/min的速率从30X:升至95"C)。所述蛋白质样品置于pH7.4的磷酸緩冲盐水(PBS)中。在参考室中使用同样的緩沖液以通过比较获得摩尔热容量。观察到的热解曲线已用基线校正，使用Originv7.0分析归一化的数据。CHO和鸡来源的抗体的解折叠i普(unfoldingprofile)大不相同，而Fc-去糖基化抗体的解折叠镨则几乎相同(图8)。这些数据提示，与CHO细胞中产生的MAbFl附着的碳水化合物残基相比，鸡管状腺细胞中产生的MAbFl的糖基化赋予了更高的热稳定性。5.通过CE-LIF进行MAb的寡糖表征通过使样品与12.5mUPNGaseF(Prozyme)—起在40"C孵育过夜从IgG样品(100^)中释放寡糖。在所使用的条件下，N-连接聚糖从CHO细胞和鸡中表达的HuMAbFlFc部分上释放。乙醇沉淀除去MAb蛋白之后，通过真空离心使含有聚糖的上清液干燥，并重悬于溶于15%乙酸中的19mMAPTS(Beckman)和溶于THF(Sigma)中的1M氰基硼氢化钠中。使聚糖标记的反应在40。C持续过夜，其后用水将样品稀释25倍。在具有相反极性的P/ACEMDQCE系统(Beckman)上，对APTS标记的聚糖进行使用激光诱导荧光的毛细管电泳，其中使用50内径的N-CHO包被毛细管(Beckman),该毛细管的有效长度为50cm。将样品加压注入(8秒)，并在20tM吏用CarbohydrateSeparationGelBuffer(Beckman)以25kV进行20分钟的分离。使用激光诱导的荧光检测系统(Beckman)监测分离，其中使用3mW氩离子激光、488nm激发波长和520nm发射波长。如图9所示，发现鸡产生的MAbFl的寡糖i普与CHO细胞产生的MAbFl大不相同。6.利用MALDIQ画TOFMS进行MAb的寡糖表征。纯化的抗体(每种1001.0mg/ml)用4plPNGaseF(Prozyme)处理，PNGaseF是切割N-连接碳水化合物的内切糖苷酶。所述样品在37r孵育过夜，其后用50mM碳酸氢铵(pH8)透析过夜。通过乙醇沉淀除去蛋白质。基本上遵照商家的方案在GlygenCorp.(Columbia,MD)的微碳柱上使释放的碳水化合物脱盐，只是洗脱体积减少至5|Lil。将每个聚糖样品的1^等分试样与基质溶液(a-氰基-4-羟基肉桂酸或2,5-二羟基苯甲酸(AppliedBiosystems))1:1(体积/体积)混合，点样在MALDI耙平板上并风干。使用MALDI-Q-TOF串联分析进行完整糖缀合物的分析。在装备o-MALDIsource2(MDSSciex，Concord,Ontario,Canada)的QSTARpulsari质i普仪上记录所有的质镨，从而获得碳7JC化合物种类的质量(组成)。在完成两种MAb的聚糖谱后，研究每个聚糖中可能的糖苷键。在带有TOF/TOF光学元件的4700蛋白组学分析仪(AppliedBiosystems,ForsterCity,CA)上记录高CID质谱。对于高CIDMS/MS实验，碰撞能量设置为1kV。在碰撞室内部，选定的寡糖离子与氩在2xi(^Torr压力下碰撞。通过MALDITOF质谱分析法分析，来自鸡的MAbFl中11个主要聚糖的碳水化合物组成和可能的糖苷键总结在表13中。发现所述寡糖结构包含高甘露糖型、复合型和杂合型的N-聚糖。表13通过质谱对鸡产生的MAbFl进行碳水化合物分析(见附件)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>7.以HPAE-DAD方法利用HPLC进行单糖分析。表14鸡产生的和CHO产生的MAbFl的单糖分析<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>用2NTFA(用于估计中性糖)或6NHCl(用于估计氨基糖)在100。C使IgG样品(20(Hig)加酸水解4小时。在环境温度下通过真空离心千燥样品，并在进行HPAE-PAD(Dionex)分析之前在200pl水中重建。用带有AminoTrap和BorateTrap(Dionex)预柱的CarboPacPA104x250mm柱分离单糖。方案根据DionexTechnicalNote53进行。使用单糖标准品(Dionex)测定单糖峰特征和相对丰度。表14中总结的鸡和CHO产生的MAbFl的单糖分析显示了在碳水化合物组成上的差异，并显示在鸡产生的MAbFl中存在N-乙酰葡糖胺残基、甘露糖残基和含量极低的半乳糖残基。8.化学特性总结概括来说，N-连接的寡糖谱中最显著的差异是在鸡产生的抗体中存在高水平的甘露糖型N-多糖、不存在岩藻糖以及半乳糖残基含量极低。这些特性由于若干原因而非常重要。首先，没有证据显示存在已知具有抗原性的al-3Gal键。半乳糖浓度的降低(一般降低至低于约2%的水平)显著降低了由含有半乳糖的键所产生的抗原性。其次，没有证据显示存在已知也具有抗原性的N-乙醇酰基神经氨酸残基。第三，鸡管状腺细胞中产生的抗体基本不含增加抗体ADCC活性的岩藻糖残基。在此情形中，基本不含定义为少于0.1%。第四，鸡产生的抗体具有高甘露糖含量，一般高于40%,这在使用CHO细胞中产生的抗体作为标准品在Balb/c小鼠中评估清除时提高了该抗体的清除率。除了这些有利的化学特性以外，抗体在卵白中存在的浓度是在使用随机整合进鸡基因组或不以组织特异性方式表达的转基因时所观察不到的。优选浓度为高于lmg抗体/卵、高于2mg抗体/卵、高于3mg抗体/卵，并可高至6mg抗体/印。由于每个卵包含约25ml卵白，因此优选浓度为高于40ng/ml、高于80iug/ml、高于120pg/ml，并可高至240pg/ml。实施例7-从卵白中提取和纯化抗体首先以低剪切率将卵白在室温下混合30分钟，然后通过前述改良方法沉淀卵勦蛋白。将1体积的匀浆卵白悬液加入3体积的反渗透水并搅拌30分钟。使用0.5M磷酸将稀释的悬液调整至pH6.0，然后以12,100g离心20分钟。通过所述方法将主要含有卵黏蛋白的约3%的卵白蛋白质去除。使用0.5M磷酸氢二钠和含有结晶盐的150mM氯化钠浓缩液将上清液调整至pH7.4。以120cm/小时线性流速在A蛋白-琼脂糖FF柱(AmershamBiosciences)上纯化人IgG。用5倍柱体积的上样緩沖液(PBS,pH7.4)洗涤吸附的人IgG，然后用3mM磷酸洗脱。使用含230mMNaCl的60mM磷酸钠(pH7.5)将洗脱的人IgG级分调整至pH7.5,以得到40mM磷酸钠和150mMNaCl的终浓度。然后，通过0.2mm注射器式滤器(Pall)过滤样品。如图IO所示，多数纯化物质是装配完全的H2L2，纯度高于90%(通过ELISA和A280测定，数据未显示)。实施例8—结合亲和力测定使用LNCaP细胞(ATCC)上的PSMA作为抗原测定结合。将二十万个细胞/孔一式两份与标明浓度的50pi抗体等分试样孵育30分钟。洗涤细胞两次，其后在4°C下用30分钟以50[Al/孔加入1:200稀释的山羊抗人IgGPE标记抗体(JacksonImmunoResearch)。细胞在含有1。/oBSA的PBS中洗涤两次并通过FACS测定。使用GraphPadPrism3.0(GraphPadSoftware)由结合曲线确定MAb与LNCaP细胞上PSMA结合的ECso值。细胞在补充了10%FBS、lOmMHEPES、2mML-谷胺酰胺和1mM丙酮酸钠的RPMI1640培养基中培养。将鸡管状腺细胞中产生的MAbFl的抗原结合特性与CHO细胞中产生的MAbFl的抗原结合特性进行比较。两种抗体制备物产生几乎一致的与LNCaP细胞上表达的PSMA的结合曲线以及相似的ECs。值(图11)。该数据证明，虽然来自鸡的和来自CHO的抗体在糖基化上存在差异，但是它们在抗原识别和结合上是等价的。实施例9-抗体内化测定MAbFl与PSMA的结合导致抗体内化。在一个可能的应用中，MAb可以与细胞毒素缀合，从而耙向并破坏表达PSMA的肿瘤细胞。与LNCaP细胞上PSMA结合的抗体的内化通过与将细胞与MAb和Hum-Zap(AdvancedTargetingSystems)—起孵育来测定。HumZap是与核糖体失活蛋白皂苷缀合的山羊抗人IgG抗体。当MAbFl/Hum-Zap复合物与细胞表面上的PSMA结合并发生内化时，细胞被杀死，而仅有抗体或Hum-Zap时则对LNCaP细胞没有毒性。在37C下将LNCaP细胞(10,000个/孔)一式三份在150pi培养基中孵育48小时，所述培养基含有300ngHum-Zap以及300ngFlMAb或对照MAb。用CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay(Promega)测定细胞增殖和存活。还通过将稀释抗体在含有10,000个贴壁LNCaP细胞/孔的细胞培养基中4。C孵育2小时来进行内化测定。轻轻地移除抗体溶液，并替换成150pi含有200ngHumZap的培养基。37'C孵育48小时后测定细胞的生存力。使用Prism3.0(GraphPadSoftware)通过作图测定抗体内化的ECs。值。如图12所示，两种抗体制备物以相似的效率内化。当采用一系列抗体的浓度进行测试时，鸡来源和CHO来源的MAbFl的内化EQ。值均为0.49nM。实施例10-BALB/c小鼠中MAb的清除通过静脉内注射放射性标记抗体在BALB/c小鼠中与CHO产生的抗体一起对鸡产生的MAbFl的体内半衰期进行平行分析。使用Iodobead法(Pierce)用125I轻微硪化10MAb蛋白(每个抗体中少于一个捵)。实验前，在饮用水中对六周龄雌性BALB/c小鼠(TaconicFarms,Germantown，NY)艰0.1mg/ml缺化钾一周。将约600,000cpm标记MAb注射进尾静脉，每种蛋白质注射四只小鼠，在选定的时间使用全身y计数器(带有Ludmlum定标器的Wm.B.JohnsonNal晶体检测器)测量全身放射性。通过残余放射性的指数回归分析计算半衰期。如图13所示，鸡管状腺细胞产生的MAbFl的清除半衰期(t^)为102.4±0.9小时，而CHO细胞产生的MAbFl的清除较慢，半衰期为207.5±18.3小时。实施例11-ADCC测定在改良的51CrADCC测定中测试LNCaP-C42B细胞。通过标准Ficoll-paque分离法从肝素化的全血中纯化人外周血单核细胞。所述细胞重悬于含有10%FBS和10U/ml人IL-2的RPMI1640培养基(1x10E6个细胞/mL)中，并在37。C下孵育过夜。第二天，收集细胞并用培养基洗涤一次，并以2x1(^个细胞/ml重悬。在lml总体积中，将两百万个靶LNCaP-C42b细胞与200uCi51Cr—起在37。C下孵育1小时。洗涤靶细胞一次，重悬于1ml培养基中，并在37。C再孵育30分钟。最终孵育之后，洗涤耙细胞一次并使终体积为lxl()S个细胞/ml。就最后的ADCC实验而言，将100pl标记的LNCaP细胞与50pl效应细胞和50pl抗体一起孵育。最终靶细胞与效应细胞的比例选择1:100。在所有的研究中都使用人IgGl同种型对照并与来自CHO的抗PSMAMAbFl抗体进行比较。包括的其它对照为a)耙细胞和效应细胞，但没有抗体，b)乾细胞，没有效应细胞以及c)在3Q/。TritonX-100存在下的耙细胞和效应细胞。37。C孵育4小时后，收集上清液并在Y计数器(CobraIIauto-gamma，来自PackardInstruments)上计数，其中读数窗为240-400keV。将每分钟的计数作为抗体浓度的函数作图，数据使用Prism软件(SanDiego，CA)通过非线性回归、S型曲线剂量应答(可变斜率)进行分析。裂解百分比通过下式确定裂解百分比(％)=(样品CPM-无抗体CPM)/TritonXCPM-无抗体CPM)xl00我们发现，在所有研究中同时监测ECs。值和裂解百分比是很重要的。例如，当比较两种抗体时，有可能改变ECs。或裂解百分比或两者同时改变。通过以下改良用抗CD16抗体阻断ADCC。在不存在或存在5口g/ml抗CD16抗体3G8或同种型对照抗体的情况下，将细胞与l或O.Ol口g/mlCHO产生或鸡产生的MAbFl抗体一起將育。图14显示来自CHO的MAb诱导剂量依赖性细胞裂解，使用IL-2刺激的效应细胞时在38。/。裂解时到达平台，EC5。为0.11jig/ml。相反，来自鸡卵的MAb更强、更有效。使用该抗体的两种不同制备物时，来自鸡卵的MAb的最高裂解百分比为60%。该材料的ECs。为0.018pg/ml，也证明了强于来自CHO的MAb的效力。最后，与预期一致的是，同种型对照抗体不诱导细胞裂解。使用未刺激的效应细胞(新鲜的PBMC)的ADCC显示EC50值的差异更大，但总体细胞杀伤更低(图15)。CD16(FCgRIII)是介导ADCC的关鍵受体。通过使用针对CD16的单克隆抗体阻断靶细胞与效应细胞的相互作用来显示ADCC应答的特异性。在该研究中，使用两种MAbFl抗体剂量，即饱和剂量(1ng/ml)和次优剂量(0.01|ig/ml)。不存在抗CD16抗体时，使用来自CHO和来自鸡的抗体时1ng/mlMAbFl抗体分别i秀导约15%和38%的裂解。裂解百分比在抗CD16抗体存在时降低到~4%，而同种型对照抗体则没有影响(图16)。实施例12CD16结合使用Biacore提供的胺偶联试剂盒，将来自CHO和鸡的MAbFl通过伯胺固定在Biacore传感器芯片(CM5)的羧甲基葡聚糖基质表面。包被两种抗体至密度约为10,000RU。通过使若干浓度的蛋白质流过固定化抗体表面来实施两种抗体与CD16-苯丙氨酸和CD16-缬氨酸的结合。通过考虑空白表面和空白緩沖液的结合循环来补偿非特异性结合效应。将HBS-EP緩冲液用于稀释并作为电泳緩沖液。在25'C下在Biacore-3000仪器上进行实验。使用GraphPadPrism软件分析数据，并将数据拟合成单结合位点模型以估计平衡解离常数。解离常数的估计是基于平衡结合实验而非速率常数，因为快速动力学是FcRs与抗体结合的特征性质。用于估计Ku的曲线拟合示于图17。与相应来自CHO的抗体相比，对于两种FcRs而言，来自鸡的抗体的解禹常数Kd均低約10倍。来自鸡的抗体的较高亲和力可能归功于Fc区域的糖基化差异，尤其是由于不存在岩藻糖，而岩藻糖存在于来自CHO的抗体中。实施例13治疗效用本发明提供的抗体具有特殊限定的糖基化模式和其它化学特性，并使用上文所述经遗传修饰的鸡产生。当对患者施用以用于与乾组织中的抗原特异性靶标结合时，这些特性使得治疗特性有所改善。具体地，如上文所述，就某些临床适应症而言该抗体显示增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并且该效应在某些临床适应症中具有重要的优势。用于治疗一些癌症类型的非缀合单克隆抗体(mAbs)临床试验已经得到了鼓舞人心的结果。Dillman，1997，CancerBiother.&Radiopharm.12:223-225;Deo等,1997，ImmunologyToday18:127。已经批准将嵌合的非缀合IgGl用于低分级或滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤(Dilhnan,1997,同上)，而另一种非缀合mAb——乾向实体乳腺肺瘤的人源化IgGl——也已在III期临床试验中显示了很有前途的结果。Deo等，1997，同上。这两种MAb的抗原在其各自的靶组织中高度表达。对于这样的应用，尤其是在抗体通过ADCC介导有效的肿瘤破坏的肿瘤细胞中，本发明抗体在施用于患者时具有治疗优势。就治疗用途而言，本发明抗体也可以与一个或多个其它分子实体功能性连接(如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它)，所述分子实体如另一抗体(例如用于产生双特异性或多特异性抗体)、细胞毒素、细胞配体或抗原(例如用于产生免疫缀合物，如免疫毒素)。本发明抗体可以与其它治疗性结构连接，例如放射性同位素、小分子抗癌药、抗炎剂、细胞毒素或免疫抑制剂。因此，本发明包括抗体组合物，其具有可通过鸡表达系统实现的化学特性，并与基本上所有已知的抗体缀合、连接和用于治疗用途的相关技术结合。因此，本发明抗体可以用于治疗和/或预防多种疾病，所述疾病涉及对治疗敏感的靶组织中表达抗原的细胞，尤其是在靼组织中存在ADCC机制时。可以治疗(例如改善)或预防的示例性疾病包括但不仅限于实体瘤、淋巴瘤、弥散性肿瘤和所有类型的癌性组织。在本发明的治疗实施方案中，对患者施用本发明的抗体，特别是根据通过表现出ADCC特性的方式而对待治疗病况的诊断。在这样的临床情况下，施用本发明抗体，并在治疗后测定该治疗的细胞毒效应，以测定乾组织中的ADCC效应。除了本发明的治疗组合物外，还可以通过化学治疗剂、放射或调节(例如增强或抑制)Fc受体(如细胞因子)的表达或活性的药剂对患者进行治疗。在治疗中施用的细胞因子一般包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-Y(IFN-Y)和肿瘤坏死因子(TNF)。典型的治疗剂包括抗致瘤剂如阿霉素、顺铂、博来霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥以及环磷酰胺等。在另一方面中，本发明提供含有本发明鸡表达抗体的一种或组合的组合物，例如药物组合物。本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。本领域技术人员会理解，取决于所期望的结果，给药途径和/或模式可以有所不同。可药用载体包括无菌水溶液或分散剂，这些介质和试剂用于药物活性物质的用途为本领域已知。可以通过以下方法制备无菌注射液在适当溶剂中混合所需量的活性化合物和一种成分或成分组合，其后灭菌和/或微过滤。一般通过将活性化合物掺入无菌载体来制备分散剂，所述载体中含有基础分散介质和任何其它成分。调整给药方案以提供期望的最佳ADCC效应。例如，可以使用单次推注，可以在一段时间内分几次给药剂量或者根据治疗情况的紧迫性按比例地降低或提高剂量。特别有利的是配制剂量单位形式的肠胃外组合物，以便于给药和保持剂量一致性。本文使用的剂量单位形式指物理分开的单位，其适于作为待治疗受试者的单剂量；每个单位中包含经计算以产生期望疗效的预定量的活性化合物以及所需的药物栽体。本发明剂量单位形式的规格由以下因素确定，并直接依赖于以下因素(a)活性化合物的独有特征以及需要实现的特定疗效，和(b)这种活性化合物配制领域中内在的对于个体中治疗敏感性的限制。可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，从而获得活性成分的量，所述量有效地对特定的患者、组合物和给药^=莫式实现实现期望的治疗反应，而不对患者产生毒性。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明特定组合物的活性、给药途径、给药时间、所使用的特定化合物的排泄率、治疗的持续时间、与所用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料以及受治患者的年龄、性别、体重、病症、总体健康和既往病史以及医疗领域众所周知的类似因素。因为本发明的抗体的施用效果可在靶组织如肿瘤中客观观察到，因此本发明的治疗方法包括诊断需要治疗(特别是使用ADCC的治疗)的患者、鉴定期望产生效果的靶组织、对有此需要的患者施用本发明的组合物以及测定患者中的疗效，如通过测定患者耙组织中的ADCC效力。疗效的测定可以通过分析靶组织特性随时间的变化而实现，如细胞死亡、耙组织的收缩、肿瘤尺寸的减小以及医疗领域已知的任何其它诊断技术。还可以在本领域技术人员可用的多种已知ADCC模型中的任何一种中测试本发明抗体的ADCC活性。为了测定本发明抗体在治疗或诊断用途中的效用，ADCC的测量可以独立进行或与其它哺乳动物、非哺乳动物、植物或细菌细胞表达系统进行比较。因此，本发明的方法包括测定与上文所述系统中产生的另一抗体直接或间接相比，使用本发明抗体在实现ADCC效用上的差异。具体地，该方法包括比较在上述鸡表达系统中产生的抗体的ADCC效应以鉴定增强的ADCC，从而鉴定用于鸡表达系统的理想抗体候选者。如上文所述，为了增强治疗效用，本发明的抗体可以与一种或多种其他治疗剂共同施用，如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂。抗体可以与所述药剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与该药剂分别施用。在后一种情况(分别施用)下，抗体可以在所述药剂之前、之后或同时施用，或者可以与其它已知的治疗共同施用，例如抗癌治疗，如辐射。这些治疗剂包括抗肿瘤剂如阿霉素、顺铂、博来霉素、卡氮、苯丁酸氮芥和环磷酰胺等。本发明抗体与化疗治疗剂共同施用提供了两种抗癌剂，所述抗癌剂通过对人肺瘤细胞产生细胞毒效应的不同机制起作用。这样的共同施用可以解决由于发展出药物抗性或肿瘤细胞的抗原性发生变化而产生的问题，这些问题会使其对该抗体无反应性。本文所公开的发明的多种润饰、改进和应用是本领域技术人员显而易见的，本申请以法律允许的程度包括这些实施方案。虽然本发明已在某些优选实施方案中得到描述，但本发明的完整范围并不局限于此，而与以下权利要求的范围一致。所有的参考文献、专利或其它公开内容通过参考方式特别地并入本文。权利要求1.包含单克隆抗体的组合物，所述抗体由外源多核苷酸编码、在经遗传修饰的鸡的管状腺细胞中选择性表达、并从所述鸡产的卵中收集，其中所述抗体以至少40μg/ml的浓度存在于卵白中。2.根据权利要求l所述的组合物，其中包含在卵中的单克隆抗体基本不含岩藻糖残基。3.根据权利要求l所述的组合物，其中甘露糖浓度高于约40%。4.根据权利要求l所述的组合物，其中半乳糖浓度低于约2%。5.基本不含岩藻糖残基的单克隆抗体的制造方法，包括在经遗传《务饰的鸡的管状腺细胞中表达所述抗体；所述鸡具有已整合进其基因组的外源多核苷酸，和从所述鸡产的卵中收集抗体，其中所述抗体以至少40ng/ml的浓度存在于卵白中。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体中的甘露糖浓度高于约40%。7.根据权利要求5所述的方法，其中半乳糖浓度低于约2%。8.经遗传修饰的鸡，其在管状腺细胞中表达由外源多核苷酸编码的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体以至少40ng/ml的浓度存在于卵白中。9.根据权利要求8所述的鸡，其中所述抗体基本不含岩藻糖残基。10.根据权利要求8所述的鸡，其中甘露糖浓度高于约40%。11.根据权利要求8所述的鸡，其中半乳糖浓度低于约2%。全文摘要将编码外源抗体的转基因稳定整合进供体细胞，并呈现在嵌合鸟类的体细胞组织中。所述转基因编码外源抗体，并优选在输卵管中表达，以在卵中进行收集。相应地，通过选择转基因内含物来获得组织特异性。基因组中包含来自转基因的外源抗体编码DNA的鸟类表达外源抗体，所述抗体具有期望的化学特性，与来自细菌表达系统的抗体相比具有提高的治疗效用。文档编号A01K67/027GK101160045SQ200680012841公开日2008年4月9日申请日期2006年2月21日优先权日2005年2月18日发明者文周,雷朱,罗伯特·J·埃切斯申请人:奥瑞根治疗有限公司