专利名称：产生单倍体和双单倍体植物胚的方法
产生单倍体和双单倍体植物胚的方法
技术领域：
本发明涉及产生单倍体和双单倍体植物胚的新方法。本发明进一步涉 及如此获得的植物胚和涉及由其再生的植物，以及涉及这些植物的子代、 细胞、组织和种子。
自从Guha & Maheshwari ( 〃由re 204: 497 )于1964发现植物可以 从单倍体孢子产生，已经进行了许多研究以获得类似的关于其他物种的知 识(参见，例如"In vitro Haploid production in Higher plants" Vol. 1， 2， 3， 4, 5， Eds: S. Jain, S. Sopory和R. Veilleux (1996) Ki羅r Academic Publishers)。
在现代化的当代植物育种中，双单倍体(doubled haploids， DHs ) 的使用已经成为一种十分有价值的工具以便加速遗传上纯的品系的产生以 及评价和监控困难的性状，例如由多个基因/等位基因编码的那些性状。
知的(参见例如Thomas W.等人(2003)， Doubled haploid production in crop plants. A Manual. Eds. M. Maluszynski， K. Kasha, B. Forster 和I. Szarejko. Kluwer Academic Publishers, pp 337-349 )。 一般地， 双单倍体可以从来自雄性器官的孢子获得。在这种情形中，所述孢子称为
"小孢子"，并且所述体外培养称为"小孢子培养"。双单倍体也可以从 雌性器官或"大孢子"获得。相应的体外培养通常称为"雌核发育"。
很长时间来，在芸莒属(Ara^ica)中完善建立了典型的小孢子培养 (参见例如Keller等人，(1984) K. Giles, S. Sen (eds.)， Plant Cell Cul ture in Crop Improvement pp 169-183. Plenum Pub. Corp., New York )。 典型的雌核发育培养对于甜菜来说是已知的(参见例如Hosemans D.和 Bossoutrot， Z. Pflanzenziichtg. 91:74-77 (1983))。此外，在黄瓜中， 雌核发育是十分完善建立的技术(参见EP 0 374 755 )。
获得雌核发育的方法基于利用经辐射的花粉通过孤雌生殖来诱导卵
细胞的胚胎发生。已经公开了关于甜瓜的一个众所周知的实例，并且其目
前在数个育种公司中常规应用(参见Sauton A和R. Dumas de Vaulx， j^r^咖/e 7:141-148 (1987))。在孤雌生殖中，新的植林从未受精的卵 发育而来。这种技术的成功率低。
尽管有大量可利用的技术并且有超过30年的研究经验，许多技术的 成功局限于易受影响的(amenable)基因型。这意味着，使用DH的巨大好 处还不能尽其最大程度利用。除了某些基因型的响应度不同外，几种作物 物种例如番茄和棉花仍然不能用于诱导DH。
因此，本发明的目标是提供用于产生单倍体或双单倍体植物胚的新方法。
在导致本发明的研究中，令人惊奇地发现，可通过用含有细胞分裂诱 导分子的花粉或小孢子对印细胞进行授粉来诱导其经历胚胎发生。然后引 发该卵细胞形成胚而无需受精。由于所述花粉没有实际使卵细胞受精，所 以没有形成二倍体合子并且得到的胚保持单倍性。在细胞分裂期间于授粉 后的某一阶段，可以发生自发的染色体加倍，导致形成胚，其为部分或完 全的DH。染色体加倍也可以例如通过已知的化学手段如秋水仙素来诱导。
因而，本发明涉及用于产生单倍体植物胚的方法，所述方法包括以下
步骤
a) 提供包含细胞分裂诱导分子的小孢子或花粉；
b) 对植物的胚嚢细胞特别是卵细胞进行授粉，所述植物的单倍体胚 待用所述小孢子或花粉来产生；
c) 让所述小孢子或花粉将所述细胞分裂诱导分子释放在胚嚢细胞特 别是卵细胞中或其附近，以引发其分裂从而获得单倍体植物胚。
在一个备选的实施方案中，本发涉及用于产生双单倍体植物胚的方 法，所述方法包括以下步骤
a) 提供包含细胞分裂诱导分子的小孢子或花粉；
b) 对植物的胚嚢细胞特别是卵细胞进行授粉，所述植物的双单倍体 胚待用所述小孢子或花粉来产生；
c) 让所述小孢子或花粉将所述细胞分裂诱导分子释放在胚嚢细胞特
6别是卵细胞中或其附近，以引发其分裂从而获得单倍体植物胚，
其中在授粉后的某一阶段，特别是在细胞分裂过程中或在获得所述胚 后，发生染色体数目的加倍。
因而，本发明涉及花粉或小孢子作为载体来在胚嚢细胞或卵细胞中引 发细胞分裂的用途。
在第一个实施方案中，所述细胞分裂诱导分子瞬时地在花粉中表达， 例如从存在于质粒上的核酸表达。所述细胞分裂诱导分子(其可以是核酸 或蛋白质)通过从所述质粒的组成型表达而在花粉或小孢子中产生。在授 粉后，如此产生的细胞分裂诱导分子被释放入卵细胞中。
在第二个实施方案中，所述细胞分裂诱导分子从稳定地整合入花粉基
因组中的核酸表达。所述细胞分裂诱导分子(其可以是核酸或蛋白质)通 过组成型表达而在花粉或小孢子中产生。在授粉后，如此产生的细胞分裂 诱导分子被释放入胚嚢细胞或卵细胞中。
在第三个实施方案中，所述细胞分裂诱导分子通过从处于胚嚢细胞或
述核酸借助于用含有该核酸的花粉或小孢子进行授粉而被引入胚嚢细胞或 卵细胞中。在所述胚嚢细胞或卵细胞中，开启所述组织特异性启动子，因 而导致产生细胞分裂诱导分子。
在第四个实施方案中，花粉或小孢子不是直接转化的，而是在转基因 植物上形成，所述转基因植物携带编码所述细胞分裂诱导分子的核酸。此 类转基因花粉或小孢子可以处于组成型启动子或者花粉或小孢子特异性启 动子或者胚嚢细胞或卵细胞特异性启动子的控制下。在第一种情形中，优 选的是该转录产物对植物无害。在第二种情形中，所述转基因仅在花粉或 小孢子中表达，并且所述细胞分裂诱导分子仅在花粉或小孢子中产生。在 第三种情形中，当在受精后所述核酸进入卵细胞或胚嚢细胞时，所迷转基 因才得以表达。
在所有这些实施方案中，必须避免通过花粉对卵细胞真正受精。这可 以借助于辐射或通过对于花粉和卵细胞使用不同物种来获得。辐射特别适 合于其中蛋白质在花粉中产生的实施方案，因为蛋白质不会或几乎不会受
辐射损害。在要将核酸从花粉或小孢子转移至胚嚢或卵细胞中的情形之中， 优选将另一物种用作卵细胞供体。
根据本发明的一个特别的实施方案，含有细胞分裂诱导分子的小孢子 或花粉可通过用核酸进行转化来获得。转化可以以任何合适的方式进行，
例如借助于根瘤土壤杆菌(Jgro6flcfer/zM f咖e尸ac/e;^)或借助于氺立子轰 击(生物射弹)。
这些转化技术是众所周知的。借助于根瘤土壤杆菌来转化植物细胞是 被完善建立的，并且例如在De la Riva等人，i575 Vol. 1 (3) (1998)和 Bent, Plant Physiol. 124:1540-1547 (2000)中综述。
最近，发现植物的遗传转化并不只局限于土壤杆菌(々ro&WeW咖)， 而是其他细菌也具有转化植物的能力(Broothaerts等人，Ai3,zyre 433， 629-633 (2005)，将其引入本文作为参考)。通过获得去攻击性的 (disarmed) Ti质粒和合适的二元载体两者，可将这些植物相关的共生细 菌变得有能力用于基因转移。此类转化系统也适合用于本发明。
生物射弹转化对于本领域技术人员来说也是众所周知的，并且用于此 类应用的工具多年前已可商业获得(Ralph Bock， QiagenNews， Issue No. 5， 1997 )。
适合用于本发明的技术例如还由Barinova等人(/ Jo" 53 (371) :1119-29 (2002))描述，其中显示了 DM在小孢子水平上的递送 及其在金鱼草(^J〃rr力/刀咖边aj'iAy)中的瞬时表达，或者由Ramaiah等人 (73: 674-682 (1997))描述用于苜蓿(腐/c，w〃m L.)。
用于在烟草中用生物射弹轰击进行小孢子或花粉转化的方法可以在 Baubak Bajoghli (Matrikel number: 9802743， University of Vienna, Experimentelle Genetic III. Plant Biotechnology by Alisher Touraev， July— 2001 )中4戈至'j。 Van der Leede—Plegt等人,rr5/2i^eaic' Aesesrc力 4 (2): 77-86 (1995)描述了借助于微粒轰击将DNA直接递送入烟草(心叶烟 (治'co〃a"a Wi7〃/Josa))的花粉中。这些和其他技术可以用于转化用于 本发明的花粉或小孢子。
在一个具体的实施方案中，花粉和小孢子因而依靠核酸的存在而包含 细胞分裂诱导分子。所引入的核酸可以是细胞分裂诱导分子本身，或者可 以编码细胞分裂诱导分子。在后一种情形中，所述诱导分子是蛋白质或肽。 在第一种情形中，所述诱导分子是核酸。所述核酸本身可以是可诱导的，
或者其可以阻断其他核酸被表达。例如，所述核酸可以是或编码对抗Kip-相关蛋白家族的成员或成视网膜细胞瘤的RNAi (参见例如Park J等人， 户/a/^/卯/7 <2/ 42: 153-163 (2005))。成视网膜细胞瘤蛋白调控植物中的 细胞增殖、分化和核内再复制。
备选地，所述核酸可以编码细胞分裂诱导分子的前体或产生细胞分裂 诱导分子的酶。当所述核酸编码酶时，这种酶可以是或直接产生所述诱导 分子的酶，或者是作为最终导致形成所述诱导分子的途径的一部分的酶。 此处所使用的"细胞分裂诱导分子"旨在包括直接或间接引发细胞分裂的 所有分子。
本发明基于这样的原理细胞分裂诱导分子借助于转化的花粉或小孢 子而被递送至胚嚢或卵细胞。能够开启细胞分裂的基因构建体或分子本身 是已知的，并且可用于本发明的新方法中。
可以根据本发明使用的基因的实例描述于Stone等人(尸W51 98， 11806-11811 (2001))中，其公开了，被程序化而继续营养生长的体细胞 (营养细胞)易于通过用编码转录因子的基因转化它们而转变至胚胎生长。 另外的实例是Baby Boom ( Bouti 1 ier等人，r力e户7a/2f 14， 1737-1749 (2002))或leafy cotyledon (Stone S等人，25:11806-11811 (2001))。这些以及其他基因可用于编码本发明的细胞分裂诱导分子。
Zuo等人(r力e /a/2f /owr加/ 30: 1-12 (2002))描述了 ，发现通 过过表达所谓的Wuschel基因，可以在拟南芥(^ra6/f/o/7S")的所有組织 中诱导体细胞胚胎发生而无需植物激素。该技术也描述于US2003/0082813 中。与本发明的不同是，在US2003/0082813中植物细胞是用Wuschel DNA 序列稳定转化的而不是瞬时转化的。这种稳定引入的Wuschel基因随后在 其中稳定整合了该基因的组织中过表达，并且在该组织中诱导细胞分裂和 胚形成。
根据本发明，编码细胞分裂诱导分子(其可以是Wuschel基因的表达 产物)的核酸没有稳定整合入应当进行细胞分裂的细胞的基因组中。编码
正在分裂的细胞中瞬时表达，或者在花粉中表达，其后所编码的细胞分裂 诱导分子被释放入要经引发以开始细胞分裂的细胞(卵细胞或胚嚢细胞) 中。因此，所述花粉或小孢子是将所述分子本身(Wuschel基因表达产物， 而不是编码序列)引入要经引发以开始细胞分裂的细胞中的载体。
卵细胞诱导基因的应用不限于基因的异位和瞬时表达例如上面提及 的那些，而通过使用编码可以产生激素如iaaM和iaaH的酶的基因(参见 Thomashow等人，(1986) 5W認e 231， 616-618 )和编码细胞细胞周期蛋 白的基因，也可以获得类似的结果。
此外，基因的组合可用于进一步优化对卯细胞的分裂和胚胎发生的诱 导。细胞周期基因的瞬时表达也可以引起卵细胞的分裂(关于细胞周期基 因的综述，参见MurrayA ( Ce// 116: 221-234 (2004))。特别地，细胞 周期蛋白E和D单独地或组合地瞬时表达可以用于引发卵细胞分裂。
根据本发明，所述核酸或者在小孢子或花粉中表达，或者瞬时或在稳 定整合入基因组中后表达，或者在卵细胞中从卵细胞特异性启动子瞬时表 达。通过这种方式避免了在得到的胚中的组成型表达。
瞬时表达可以以组织或细胞特异性的方式出现。在一个备选的实施方
时表达。组织特异性启动子合适地是花粉或小孢子特异性启动子。花粉特 异性启动子是众所周知的，并且在单子叶植物和双子叶植物中都已显示了 瞬时表达。这些类型的启动子的实例例如描述于Twell， D等人， Z ,7"細"09 (3): 705-713 (1990); Hami 1 ton, D等人，尸/a"f #。7. 18:211-218 (1992)中。
因此，根据本发明，通过使用转化小孢子(例如通过土壤杆菌转化或 生物射弹转化)或花粉粒的常规方法，这些方法导致基因例如Baby Boom、 Wuschel、 leafy cotyledon、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 、 E2F (高等真核生物中的转录因子家族的成员；Zheng, N等人， Genes Dev. 13: 666 (1999) )、DP (Magyar Z等人，FEBS Lett. 486 (1) : 79-87 (2000))等的瞬时表达，有可能在当用经转化的小孢子或花粉粒对雌性受 体进行授粉时诱导卵细胞的分裂。
优选地，所述花粉或小孢子的生殖核被失活或破坏。通过这种方式， 肯定避免了卵细胞的受精。生殖核的失活或破坏优选在花粉或小孢子的转 化之前进行，以便不会不必要地损害所述诱导分子。失活或破坏合适地借 助于辐射来实现。
对花粉细胞核进行辐射是众所周知的降解生殖核的方法，但取决于辐 射的剂量，这种方法不妨碍花粉管形成并释放进卵细胞中。Grant等人( Zea/s/^ /o固a/ 射,18， 339-341 (1980))描述了这种技术。
然后，将经辐射并随后经转化的花粉/小孢子细胞转移到植物的雌蔬 上，所述植物来自相同物种或其中可发生所述花粉/小孢子细胞的花粉释放 的物种。异源授粉的实例是将属于茄科(^/a/ "eae)的物种用作花粉供 体，而将番茄作为受体。其他实例描述于de Martinis等人，户/a/ " 214(5): 806-812 (2002)和Dore C等人，/VaW Ce// Ae/7or" 15: 758-761 (1996) 中。 一般地，适合用于异源授粉的物种属于相同的科。
取决于物种，可以收获源自从卵细胞或子房分裂的种子。备选地，胚 珠培养可能对于救援(rescue)正在发育的胚是必要的。
因此，基本上，失活的花粉粒以瞬时的方式携带能诱导卵细胞分裂和 胚胎形成的信号分子。由于所述分子的瞬时性质，印细胞DM不被稳定转 化。
因此，在一个特别的实施方案中本发明涉及细胞分裂分子(蛋白质、 DNA、 RNA)的利用，所述细胞分裂分子在通过辐射进行失活以便使生殖核 失活的小孢子或花粉粒中瞬时存在并表达，由此当通过花粉管释放入卵细 胞或其附近时所述细胞分裂分子发挥它们的作用。
在另一个实施方案中，即使花粉或小孢子的供体植物用编码细胞分裂 诱导分子的基因稳定转化，卵细胞诱导分子的表达也是瞬时的。在这个特 定的实施方案，稳定转化提供花粉或小孢子的植物从而使得其基因组DNA 携带编码细胞分裂分子的基因或基因构建体，所述基因或基因构建体优选
地处于胚嚢细胞或卵细胞特异性启动子的控制下。当在胚嚢细胞特别是卵 细胞中或其附近释放时，所迷基因或基因构建体得以表达。得到的细胞分 裂诱导分子引发细胞分裂。
在授粉前，对花粉或小孢子进行辐射以使生殖核失活。备选地，将花 粉或小孢子转移至另一物种的雌蕊上，在所述另一物种中可以发生所述花 粉/小孢子细胞的花粉释放。这种方法的优点是，编码细胞分裂诱导分子的 核酸被携带在生殖核中，并最终结束于精细胞中。优选地，多个拷贝的细 胞分裂诱导分子存在于供体植物中，并因而存在于精细胞中。为了避免所 述基因构建体的存在干扰花粉或小孢子的发育，使用了可诱导的或特异性 的启动子，优选胚嚢细胞或卵细胞特异性启动子，这使得所述基因或基因 构建体仅在它们转移至胚嚢细胞特别是卵细胞中时才表达。
本发明进一步涉及可通过本发明的方法获得的单倍体胚和双单倍体 胚，以及涉及从此类单倍体胚或双单倍体胚再生的植物、此类植物的子代， 并且涉及来自此类植物或其子代的种子、细胞、组织、小孢子和卵细胞。
在本申请中，卵细胞这个词有时为了易读性而单独使用，但仍旨在理 解为"胚嚢细胞，特别是卵细胞"。
本发明将在后面的实施例中进一 步阐明，所述实施例仅希望用于举例 说明目的而不应该理解为以任何方式限制了本发明。
实施例
实施例1
通过粒子轰击转化拟南芥
将DM质粒pCAMBIA 1301和pExo70:: GFP: GUS用于包被1 iim金颗粒。 pCAMBIA 1301是一种二元载体，其舍有受800个核苷酸的CaMV 35S启动 子调控的GUS( Roberts等人，pCAMBIA Vector release manual version 3. 05 (1998) ) 。 pExo70:: GFP: GUS含有3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS )和绿色荧光蛋 白(GFP )(图6 )。
将拟南芥p35S:AP2mut的三枚花序置于培养皿的中间(
图1)。将培 养皿置于粒子枪中并发射三枪包被的金颗粒。轰击后两天研究表达。图2 显示了如此获得的GUS阳性花粉。
在粒子枪中在第3水平上用培养皿重复相同的实验。在2200 psi的 压力下发射两枪。图3A-D显示了该实验的代表性结果。
从该实验可以得出结论，粒子轰击可用于转化花粉。
实施例2
粒子轰击后的体外花粉发芽
成熟的花粉是休眠的。在将花粉粒置于雌林的柱头上后，开始花粉发 芽的过程，这伴随着通过从柱头转移水份而进行再水化。在本实施例中， 在粒子轰击后使花粉体外发芽。
图4显示了番茄的15个不同的开花阶段。阶段l、 5和14的花粉用 于本试验。阶段1的花粉是完全成熟的，和阶段5的花粉也是成熟的。阶 段14是后期单核/早期双核阶段。
在200 pi NLN13培养基(NLN培养基(Lichter R. ， Z户/7si3ze"^iec力f 105:427-437 (1982))，补充有13%蔗糖)中分离阶段1、 5和14中的花 的花粉。将这20f) pl点样在基因筛选(genescreen)膜上并干燥5分钟。 然后将该膜置于^MS琼脂平板上并用经Exo70::GFP:GUS包被的1 pm金颗 粒在2200 psi下轰击。轰击后，将膜置于6孔滴定板中。将阶段1和5 的花粉在1.5ml发芽培养基A(Clarke) (20mMMES、 0. 07% Ca (N03) 2. H20、 0.02% MgS04.7H20、 0.01% KN03、 0.01% H3B03、 2%蔗糖和15% PEG4000 )中 孵育。将阶段14的小孢子在NLN13培养基中孵育。孵育三小时后，加入 1.5ml 2xGUS染色緩冲液，并将样品在37'C下放置过夜。图5显示了GUS 阳性花粉管的代表性实例。显然，在转化后花粉仍能形成花粉管。
实施例3
制备用于在用这些花粉授粉后诱导卵细胞的细胞分裂的、携带细胞分裂刺 激因子的花粉
实施例1和2证明，花粉可以在具有GUS的模式系统中转化。在此描
述了如何用细胞分裂诱导分子BabyBooffl (BBM)转化番茄花粉(Boutilier 等人，2002，同上)。
使用了来自携带CaMV 35S启动子GFP构建体的稳定转化的植物的 花粉。该构建体用作可见的非破坏性标记以区分源于有性事件的胚和胚乳 与源于本发明方法的胚。CaMV 35S启动子在胚和胚乳中具有活性，但在胚 珠中不具有活性，因而仅标记有性来源的胚。用作花粉供体的植物对于这 种CaMV 35S启动子GFP构建体来说是纯合的。
辐射花粉，并且以这样的方式选择辐射剂量，即仍有少数花粉能够使 卵细胞受精并在授粉后诱导正常的合子胚形成。这也刺激了子房长出为果 实，该果实含有少于10。/。的正常数目的种子，这表明有性繁殖过程没有完 全被废除，但受到严重影响。
转化按实施例2中所描述的用粒子轰击来进行，其中使用由拟南芥 Exo70基因的启动子序列(Atg28640 )驱动的BBM基因。该构建体含有融 合至BBM的EX070启动子序列(pExo70)。
实施例4
用经转化的花粉进行授粉和胚胎发生
对番茄花去雄并用实施例3中获得的经转化的花粉授粉。授粉后，子 房膨大并形成果实样的实体。将幼小的果实样结构保持在植物上2-4周。 植物在人工气候条件下生长(白天22°C，晚上18°C)。收获果实，并就 GFP表达(CaMV-35S:: GFP)进行成像以除去有性来源的胚。
一部分胚珠起始根椐本发明的孤雌生殖发育，并产生胚样的结构而没 有显示GFP荧光。将被救援的胚进一步在如Neal， CA和Topoleski， LD (/. j迈er.紋5W. 108 (3): 434-438 (1983))所描述的培养基上孵育。 25% - 50%的未成熟胚能够再生成为有生活力的小植林。这些小植林都不是 转基因的，着证明了所述胚的母体起源。
此外，还用雄性特异性分子标记(Vos P.等人，Wuc/e/c i^e"c力,23:4407-4414 (1995))检查了所述胚的起源。
为了区分单倍体和二倍体胚，根据De Laat， A等人，户/a力t Aree^///^ 99:303-307 (1987)中所描述的方法，通过流式细胞术对DNA-倍性水平进 行测量。大部分所获得的小植林显示为双单倍体。
实施例5
卵细胞特异性启动子驱动的表达
如实施例1中所描述的，用pES4::ES4:GFP构建体(图7)转化来自 拟南芥的花粉，所述构建体包含处于来自玉米的pES4启动子(Cordts， S 等人，77 e尸/a^ /. 25:103-114 (2001))控制下的报道基因GFP。在经 转化的花粉中没有观察到荧光。
在用经转化的花粉对拟南芥植抹进行授粉后，在卵细胞中可特异性地 检测到荧光。该试验证明，在卵细胞中pES4启动子是有活性的，并且可用 于开启细胞分裂诱导分子的表达。
权利要求
1.用于产生单倍体植物胚的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含细胞分裂诱导分子的小孢子或花粉；b)对植物的胚囊细胞特别是卵细胞进行授粉，所述植物的单倍体胚待用所述小孢子或花粉来产生；c)让所述小孢子或花粉将所述细胞分裂诱导分子释放在胚囊细胞特别是卵细胞中或其附近，以引发其分裂从而获得单倍体植物胚。
2. 用于产生双单倍体植物胚的方法，所述方法包括以下步骤a) 提供包含细胞分裂诱导分子的小孢子或花粉；b) 对植物的胚嚢细胞特别是卵细胞进行授粉，所述植物的双单倍体 胚待用所述小孢子或花粉来产生；c) 让所述小孢子或花粉将所述细胞分裂诱导分子释放在胚嚢细胞特 别是卵细胞中或其附近，以引发其分裂从而获得单倍体植物胚，其中在授粉后的某一阶段，特别是在细胞分裂过程中或在获得所述胚 后，发生染色体数目的加倍。
3. 权利要求2的方法，其中染色体数目的加倍自发发生。
4. 权利要求2的方法，其中染色体数目的加倍借助于化学处理，特别 是借助于秋水仙素来实现。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述含有细胞分裂诱导分子的 小孢子或花粉可通过用核酸转化小孢子或花粉而获得。
6. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述含有细胞分裂诱导分子的
7. 权利要求5或6的方法，其中所述转化借助于根瘤土壤杆菌或生物 射弹来进行。
8. 权利要求5、 6或7的方法，其中所述核酸是细胞分裂诱导分子， 或者编码细胞分裂诱导分子、细胞分裂诱导分子的前体或产生细胞分裂诱 导分子的酶。
9. 权利要求5、 6或7的方法，其中为细胞分裂诱导分子的核酸是 MAi，所述MAi阻断能够抑制或停止细胞分裂的基因的表达。
10. 权利要求9所述的方法，其中所述抑制或停止细胞分裂的基因是 成视网膜细胞瘤(Rb)或Kip-相关蛋白(KRP)家族的成员。
11. 权利要求5、 6或7的方法，其中所述细胞分裂诱导分子选自Baby Boom、 Leafy cotyledon、 WUSCHEL、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性 激酶(CDK) 、 E2F、 DP。
12. 权利要求5、 6或7的方法，其中所述核酸在所述小孢子或花粉中 瞬时表达。
13. 权利要求12的方法，其中通过让所述核酸处于组织特异性或可诱 导启动子的调控下来获得瞬时表达。
14. 权利要求13的方法，其中所述组织特异性启动子是花粉或小孢子 特异性启动子。
15. 权利要求5、 6或7的方法，其中所述核酸稳定地整合入所述小孢 子或花粉中，但在胚嚢细胞或卵细胞中瞬时表达。
16. 权利要求15的方法，其中通过让所述核酸处于组织特异性或可诱 导启动子的调控下来获得瞬时表达，所述启动子在所述花粉或小孢子中不 具有活性。
17. 权利要求13或16的方法，其中所述组织特异性启动子是胚嚢或 卵细胞特异性启动子。
18. 权利要求1-17中任一项的方法，其中小孢子或花粉来自属于不同 于提供胚嚢细胞或卵细胞的受体植物的另一物种的供体植物，在所述小孢 子或花粉中稳定地整合或瞬时表达编码细胞分裂诱导分子的核酸。
19. 权利要求1-17中任一项的方法，其中将所述花粉或小孢子的生殖 核失活或^f皮坏。
20. 权利要求19的方法，其中生殖核的失活或破坏在所述花粉或小孢子的转化前进行。
21. 权利要求19"或20的方法，其中生殖核的失活或破坏借助于辐射 来实现。
22. 单倍体植物胚，其可通过权利要求l和5-21中任一项的方法获得。
23. 双单倍体植物胚，其可通过权利要求2-20中任一项的方法获得。
24. 从权利要求22或23的植物胚再生的植物。
25. 权利要求24的植物的子代。
26. 权利要求24或25的植物的种子。
27. 来自权利要求24或25的植物的细胞。
28. 权利要求27的细胞，所述细胞选自花粉、小孢子、胚囊细胞和卵 细胞。
29. 来自权利要求24或25的植物的组织。
30. 权利要求29的组织，所述组织是胚嚢组织。
全文摘要
本发明涉及用于产生单倍体植物胚的方法，该方法包括提供包含细胞分裂诱导分子的小孢子或花粉；对植物的胚囊细胞特别是卵细胞进行授粉，所述植物的单倍体胚待用所述小孢子或花粉来产生；让所述小孢子或花粉将所述细胞分裂诱导分子释放在胚囊细胞特别是卵细胞中或其附近，以引发其分裂从而获得单倍体植物胚。当要产生双单倍体植物胚时，在授粉后的某一阶段，特别是在细胞分裂过程中或在获得所述胚后，发生染色体数目的加倍。本发明进一步涉及如此获得的胚、从该胚再生的植物或其子代。
文档编号A01H1/08GK101179928SQ200680017510
公开日2008年5月14日 申请日期2006年5月31日 优先权日2005年5月31日
发明者C·L·C·莱利维尔特, G·C·安格嫩特, J·B·M·卡斯特斯, R·H·G·德克斯 申请人:瑞克斯旺种苗集团公司