专利名称：一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法
技术领域：
本发明涉及一种基因分子标记方法，特别是涉及一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法，和脱氧核糖核酸(DNA)片段的序列以及作为检测葡萄抗黑痘病基因探针的寡聚核苷酸序列，属于植物基因工程领域。
背景技术：
葡萄是一种世界性水果，其面积和产量均居各类水果的第二位，葡萄黑痘病是一种严重危害葡萄的真菌病害，尤其是在葡萄生长季节雨水较多、湿度较大的地区，危害严重，常造成葡萄落花落果，叶片穿孔脱落，果粒上有鸟眼状黑斑等，严重影响葡萄的生长与产量。传统防治葡萄黑痘病的方法是对葡萄进行多次喷药防病，但化学防治会造成果实残毒、污染环境，不利于人们的身体健康。利用葡萄资源自身的抗病性，通过杂交育种是培育抗黑痘病葡萄新品种的根本途径，但通过杂交育种的方法，选育出抗黑痘病新品种的周期较长，一般鉴定杂种抗黑痘病性能需3-5年，这种人力、物力、时间耗费多而效率低的育种方法远远不能满足生产的实际需要。
随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)是一项分子标记技术，具有快速、简便、成本低、多态性检测丰富、不需同位素示踪和安全可靠的特点。该技术1990年首先被应用于菌属、菌种和种内差异的鉴别，随后在分子生物学研究领域及农作物育种方面得到广泛的应用，并取得明显成效，但一直没有应用于葡萄抗黑痘病育种。
发明内容
本发明的目的是解决传统杂交育种中，葡萄抗黑痘病育种周期长、效率低的难题，而公开一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法。
本发明采用的技术及操作步骤是a.以葡萄抗黑痘病育种的种间杂交组合白河-35-1×佳利酿的双亲及F1代、F2代为试材，提取、分离、纯化脱氧核糖核酸(DNA)b.用脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行RAPD扩增c.获得与葡萄抗黑痘病基因连锁的脱氧核糖核酸(DNA)的片段d.用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取纯化该脱氧核糖核酸(DNA)片段e.以pGEM-T载体连接脱氧核糖核酸片段f.转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA进行酶切g.将鉴定为阳性克隆的菌液测定该DNA片段的碱基构成及其序列h.获得1365碱基对的DNA片段的全部碱基组成及其序列i.进一步依据1365碱基对的全部碱基组成及其序列j.人工合成4个寡聚核苷酸，其中之一(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)可用作引物，对脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行PCR扩增k.对原杂交组合双亲及其F1代、F2代，中国野生葡萄，欧洲葡萄，美洲野生葡萄，以及杂交组合广西-1×京可晶的亲本及其F1代分别进行扩增l.获得特异性脱氧核糖核酸(DNA)片段m.用上述方法回收、克隆、测序该DNA片断n.获得了另一个检测葡萄抗黑痘病性状的脱氧核糖核酸(DNA)序列，其大小为1110碱基对o.确定获得的寡聚核苷酸序列(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作为检测葡萄抗黑痘病基因的探针。
本发明葡萄抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1354对抗黑痘病育种杂交组合广西-1×京可晶F1代339株检测与田间植株抗病表现的符合率为98.53％，对组合白河-35-1×佳利酿F2代207株检测与田间植株抗病表现的符合率为96.17％；寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作为检测葡萄抗黑痘病基因的探针对杂交组合广西-1×京可晶F1代339株检测与田间植株抗病表现的符合率为83.57％，对组合白河-35-1×佳利酿F2代207株检测与田间植株抗病表现的符合率为87％。
具体实施例方式
本发明用脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行RAPD扩增的具体步骤为b.1采用聚合酶链反应(PCR)b.1.1混合液体积为25微升b.1.2含有10×PCR缓冲液2.5微升b.1.3氯化镁1.5毫摩尔/升b.1.4 dNTP 200微摩尔/升b.1.5 Taq DNA聚合酶1个单位b.1.6随机引物1微升b.1.7 45毫微克的模板脱氧核糖核酸(DNA)；b.2用25微升的矿物油覆盖反应液b.2.1 PCR仪为Eppendorf-AG22331型b.2.2聚合酶链反应94℃下解链5分钟；b.3进行45个循环b.3.1每一个循环包括94℃下解链1分钟b.3.2 36℃下引物附着模板脱氧核糖核酸2分钟b.3.3 72℃下脱氧核糖核酸(DNA)聚合链的伸长2分钟b.3.4最后一个循环是72℃下延伸10分钟；b.4将扩增产物在4℃下保存或直接用琼脂糖凝胶电泳
b.4.1琼脂糖凝胶浓度为1.2％b.4.2加入溴化乙锭0.5毫微克/毫升b.4.3电泳的电压为110伏b.4.4用水平板电泳槽电泳1-1.5小时；b.5电泳结束后，在紫外灯下照相。
本发明用人工合成的寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作引物，对脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行PCR扩增的具体步骤为j.1采用聚合酶链反应(PCR)j.1.1混合液体积为25微升j.1.2含有10×PCR缓冲液2.5微升j.1.3氯化镁1.5毫摩尔/升j.1.4 dNTP 200微摩尔/升j.1.5 Taq DNA聚合酶1个单位j.1.6寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)1微升j.1.7 45毫微克的模板脱氧核糖核酸(DNA)；j.2用25微升的矿物油覆盖反应液j.2.1 PCR仪为Eppendorf-AG22331型j.2.2聚合酶链反应94℃下解链5分钟；j.3进行40个循环j.3.1每一个循环包括94℃下解链30秒j.3.2 62℃下引物附着模板脱氧核糖核酸30秒j.3.3 72℃下脱氧核糖核酸(DNA)聚合链的伸长1分钟j.3.4最后一个循环72℃下延伸5分钟；j.4将扩增产物在4℃下保存或直接用琼脂糖凝胶电泳j.4.1琼脂糖凝胶浓度为1.2％j.4.2加入溴化乙锭0.5毫微克/毫升
j.4.3电泳的电压为110伏j.4.4用水平板电泳槽电泳1-1.5小时；j.5电泳结束后在紫外灯下照相。
采用随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)技术，获得了与葡萄抗黑痘病基因连锁的分子标记，对该分子标记克隆、测序，获得了葡萄抗黑痘病基因分子标记的脱氧核糖核酸(DNA)的组成与序列，用该特定DNA序列可以检测葡萄抗黑痘病基因的存在与否，以加速育种进程和提高抗黑痘病育种的准确性；可以进一步通过染色体步移法，对抗黑痘病基因作图与定位，依据获得的葡萄抗黑痘病基因分子标记序列，人工合成的寡聚核苷酸序列(5’ACAATCACCCAACTCCTC 3’)也具有检测葡萄抗黑痘病基因存在与表达的功能。
本发明具有以下用途可用作脱氧核糖核酸(DNA)探针、核糖核酸(RNA)探针、基因定位作图、基因转移、葡萄抗黑痘病育种中早期筛选鉴定的DNA分子依据、作为抗黑痘病葡萄品种和株系的脱氧核酸核酸(DNA)指纹以及注册植物专利的理论依据。
本发明的葡萄抗黑痘病基因分子标记为葡萄杂交育种提供了幼苗期鉴定的DNA依据，将会加速抗黑痘病育种的进程和提高育种效率，为快速选育抗黑痘病葡萄新品种，进一步克隆抗黑痘病基因和基因转移提供方法和物质基础，也为葡萄抗黑痘病的遗传规律研究和分子标记连锁遗传作图提供科学依据。本发明检测葡萄抗黑痘病基因的脱氧核糖核酸(DNA)的序列和人工合成的寡聚核苷酸序列，从根本上解决和加速了葡萄抗黑痘病育种进程。
权利要求
1.一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法，其特征是采用以下技术操作步骤进行1.a以葡萄抗黑痘病育种的种间杂交组合白河-35-1×佳利酿的双亲及F1代、F2代为试材，提取、分离、纯化脱氧核糖核酸(DNA)1.b用脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行RAPD扩增1.c获得与葡萄抗黑痘病基因连锁的脱氧核糖核酸(DNA)的片段1.d用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取纯化该脱氧核糖核酸(DNA)片段1.e以pGEM-T载体连接脱氧核糖核酸片段1.f转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA进行酶切1.g将鉴定为阳性克隆的菌液测定该DNA片段的碱基构成及其序列1.h获得1365碱基对的DNA片段的全部碱基组成及其序列1.i进一步依据1365碱基对的全部碱基组成及其序列1.j人工合成4个寡聚核苷酸，其中之一(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)可用作引物，对脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行PCR扩增1.k对原杂交组合双亲及其F1代、F2代，中国野生葡萄，欧洲葡萄，美洲野生葡萄，以及杂交组合广西-1×京可晶的亲本及其F1代分别进行扩增1.l获得特异性脱氧核糖核酸(DNA)片段1.m用上述方法回收、克隆、测序该DNA片断1.n获得了另一个检测葡萄抗黑痘病性状的脱氧核糖核酸(DNA)序列，其大小为1110碱基对1.o确定获得的寡聚核苷酸序列(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作为检测葡萄抗黑痘病基因的探针。
2.根据权利要求1所述的一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法，其特征是用脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行RAPD扩增的具体步骤为2.b.1采用聚合酶链反应(PCR)2.b.1.1混合液体积为25微升2.b.1.2含有10×PCR缓冲液2.5微升2.b.1.3氯化镁1.5毫摩尔/升2.b.1.4dNTP 200微摩尔/升2.b.1.5Taq DNA聚合酶1个单位2.b.1.6随机引物1微升2.b.1.745毫微克的模板脱氧核糖核酸(DNA)；2.b.2用25微升的矿物油覆盖反应液2.b.2.1PCR仪为Eppendorf-AG22331型2.b.2.2聚合酶链反应94℃下解链5分钟；2.b.3进行45个循环2.b.3.1每一个循环包括94℃下解链1分钟2.b.3.236℃下引物附着模板脱氧核糖核酸2分钟2.b.3.372℃下脱氧核糖核酸(DNA)聚合链的伸长2分钟2.b.3.4最后一个循环是72℃下延伸10分钟后；2.b.4将扩增产物在4℃下保存或直接用琼脂糖凝胶电泳2.b.4.1琼脂糖凝胶浓度为1.2％2.b.4.2加入溴化乙锭0.5毫微克/毫升2.b.4.3电泳的电压为110伏2.b.4.4用水平板电泳槽电泳1-1.5小时；2.b.5电泳结束后，在紫外灯下照相。
3.根据权利要求1所述的一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法，其特征是用人工合成的寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作引物，对脱氧核糖核酸(DNA)作模板进行PCR扩增的具体步骤为3.j.1采用聚合酶链反应(PCR)3.j.1.1混合液体积为25微升3.j.1.2含有10×PCR缓冲液2.5微升3.j.1.3氯化镁1.5毫摩尔/升3.j.1.4dNTP 200微摩尔/升3.j.1.5Taq DNA聚合酶1个单位3.j.1.6寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)1微升3.j.1.745毫微克的模板脱氧核糖核酸(DNA)；3.j.2用25微升的矿物油覆盖反应液3.j.2.1PCR仪为Eppendorf-AG22331型3.j.2.2聚合酶链反应94℃下解链5分钟；3.j.3进行40个循环3.j.3.1每一个循环包括94℃下解链30秒3.j.3.262℃下引物附着模板脱氧核糖核酸30秒3.j.3.372℃下脱氧核糖核酸(DNA)聚合链的伸长1分钟3.j.3.4最后一个循环72℃下延伸5分钟；3.j.4将扩增产物在4℃下保存或直接用琼脂糖凝胶电泳3.j.4.1琼脂糖凝胶浓度为1.2％3.j.4.2加入溴化乙锭0.5毫微克/毫升3.j.4.3电泳的电压为110伏3.j.4.4用水平板电泳槽电泳1-1.5小时；3.j.5电泳结束后在紫外灯下照相。
全文摘要
本发明涉及一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法，是以种间杂交组合白河－35－1×佳利酿的双亲及F
文档编号A01H1/02GK101054595SQ20071001735
公开日2007年10月17日 申请日期2007年2月5日 优先权日2007年2月5日
发明者王跃进, 张剑侠 申请人:西北农林科技大学