专利名称：同源异源多倍体水稻的选育的制作方法
技术领域：
本发明涉及同源异源多倍体水稻的选育，属于多倍体水稻育种的技术领域。
背景技术：
目前世界上水稻育种包括常规育种、杂交育种和分子育种全部是建立在二倍体水平基础上的，受有性生殖限制不能广泛利用20多种野生稻中的有利基因，难以达到增产50％以上的目标，然而，多倍体化是自然界植物进化的重要方式，高等植物70％左右是多倍体，主要粮棉油作物如小麦、棉花、油菜等也是多倍体，它们经历了二倍体向多倍体进化的过程，并且伴随着产量的成倍增长。因此蔡得田、袁隆平、卢兴桂在中国专利ZL00114471.5中提出利用远缘杂交和多倍体双重优势选育超级稻的选育技术，它包括三个阶段，即亚种间、种间和基因组间杂种优势利用。但是自从1933年日本学者Nakamori发现同源四倍体水稻(Nakamori，E.On the occurrence of the tetraploid plant of rice Oryzasativa L.Proc.Imp.Acad.9，340-341，1993)以来，世界上有许多科学家从事水稻多倍体研究，但进展缓慢。其主要原因是同源多倍体水稻结实率低，一般都低于50％，达不到应用于生产的水平。因此日本学者Nagai认为，对于水稻育种家来说，多倍体育种是很少有希望的(Nagai I.Japonica rice.TokyoYokendoLtd，1962)。经分析多倍体水稻结实率低的原因主要在于亲缘关系太近，缺乏减数分裂稳定性，因此选育出多倍体减数分裂稳定性(PMeS)品系(Cai DT etal，Breeding of polyploidy rice pines with polyploidy meiosis stability，Chinese Science.C series Life Sciense，2007.11-9)解决了籼粳亚种间多倍体杂种的低结实率问题，并且构建了能够结实、营养生长优势强的异源四倍体水稻(AABB和AAEE)杂种，但存在易落粒、结实率达不到70％以上、籽粒比籼粳四倍体杂种小，仅与栽培稻二倍体相当。为此需要充分利用PMeS品系(ApAp基因组)的高结实特性，不易落粒性和A基因组同源四倍体的籽粒增大性，以异源四倍体AABB为亲本与PMeS品系杂交创建同源异源多倍体水稻，以选育出杂种优势强、结实率高、不易落粒、籽粒大、抗逆性强的新型多倍体水稻而应用于生产，大幅度提高水稻产量，有利于解决世界粮食供应不足的危机。
发明内容
本发明的目的是创建同源异源多倍体水稻以便充分利用野生稻资源中存在着的许多有利基因和栽培稻PMeS品系的减数分裂稳定性、高结实性和不易落粒性从而利用远缘杂交和多倍体化双重优势，应用于新型多倍体水稻育种。
本发明的技术方案为a.选择亲本，b.杂交与激素处理，c.胚挽救培养，d.染色体加倍，e.加倍愈伤组织分化出苗或加倍丛芽生长出苗，f.生根培养，g.移栽培育，h.加倍植株水稻的鉴定。
本发明的具体过程为a.选择亲本选择优良亚洲栽培稻(AA基因组)品种二倍体与斑点野生稻(Oryza sativaL，BB基因组)二倍体杂交加倍培育或栽培稻四倍体与斑点野生稻四倍体杂交的异源四倍体AABB为亲本，以具有多倍体减数分裂稳定性(PMeS，PolyploidMeiosis Stability)品系HN2026、Sg99012及其衍生系的二倍体和四倍体为另一亲本。
b.杂交与激素处理杂交以异源四倍体AABB为母本，以PMeS品系为父本，采用剪颖去雄，在授粉前1.5-2小时往柱头上喷洒混合激素溶液(2，4-D0.02-0.05mg/L+GA30.03-0.06mg/L)，稍稍晾干。剪取开花刚开始的父本稻穗置于母本稻穗上方，轻轻抖动使花粉尽可能多的散落到柱头上。授粉后的当天下午4时后往杂交穗时喷洒混合激素一次，第二天和第三天下午各喷洒一次，以促进受精后的杂交胚胎发育。
C.胚挽救培养取授粉后7-10天的幼嫩谷粒，剥去颖壳，经消毒处理后接种于胚挽救培养基种中，25℃暗培养。胚挽救培养基配方为N6+6-BA 0.3-0.7mg/L+NAA0.3-1.0mg/L+CH50-100mg/L+Sucrose3％-5％+Agar0.75％，pH6.0。
d.染色体加倍在胚挽救培养过程中，部分幼胚萌发生长出芽，另一部分则诱导出愈伤组织，因此通过愈伤组织和和丛芽二种途径诱导染色体加倍。
d-1.愈伤组织加倍处理取生长旺盛，浅黄色具颗粒状表面的愈伤组织接入含有秋水仙素(Colchicines)300-800mg/L的加倍液中，置于恒温摇床20-25℃，90-115rpm摇荡培养48-60hr。愈伤组织加倍液配方为N6+2，4-D 1.0-3.0mg/L+6-BA0.1--0.5mg/L+NAA0.5-1.5mg/L+Sucrose3％-5％+Colchicine300-800mg/L，pH6.0。加倍处理完毕后，用无菌水冲洗愈伤组织3-4次，接入上述配方中培养7-10天。
d-2.丛生芽加倍处理经胚挽救萌发的幼苗，在丛生芽培养基2/3MS+6BA 2.0-3.0mg/L+KT1.0-3.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+sucrose3-6％，agar0.6-1.0％。将高度在2cm以下的小芽切下来，接种至含有秋水仙素的丛生芽加倍液中，于恒温摇床20-25℃，90-115r/min振荡培养48-60hr。丛生芽加倍液为1/2MS+6BA 2.0mg/L+KT2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+Sucrose5％+Colchicines 500mg/L，pH6.0。加倍处理后的小芽用无菌水冲洗3-4次。
e.加倍愈伤组织分化出苗或者加倍丛生芽生长成苗将恢复培养的加倍愈伤组织转至分化培养基中诱导分化出苗，分化培养基为MS+6BA 1.0-2.0mg/L+KT1.0-3.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+Sucrose3-5％+Agar0.6-1.0％，pH6.0。或者将加倍处理后的小芽接入丛生芽培养基中恢复培养，丛生芽培养基为1/2MS+6BA 2.0mg/L+KT 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+Sucrose3-5％+agar0.6-1.0％，pH6.0。一个星期后转入新鲜培养基中直至丛芽再生长。
f.生根培养加倍愈伤组织分化出苗和加倍丛芽培养出的丛芽生长到5-15cm时按单个芽苗分开接入生根培养基1/2MS+6BA0.1-0.3mg/L+NAA 0.3-0.7mg/L+Sucrose2-3％+activated carbon 0.01-0.3％+Agar0.6-1.0％，pH6.0中生根。
g.移植培育全部生根成完整小水稻植株达到10cm以上时，先打开瓶塞加入无菌水淹没培养基表面后置于20-25℃室内散射光下炼苗2天，然后在自来水中彻底洗净小水稻植株的根系，然后于下午4:00后按单株移植至水稻育秧田中，或者泥钵中，保持1cm左右浅水用弓架支撑薄膜外置遮阳网。移植的第2、3、4天的中午用喷雾器喷洒1/10MS大量元素于移植秧苗上既保湿又增加营养，4-5天后揭开薄膜，7天后揭去遮阳网，90％以上加倍水稻苗能成活。
h.加倍水稻植株的鉴定鉴定可分为形态学鉴定，细胞学鉴定和分子标记鉴定。
h-1.形态学鉴定在水稻抽穗期对加倍植株进行观测，对茎秆粗壮、籽粒变大、可结实或结实率提高的植株分别挂牌，成熟期考察它们的株高、茎粗、粒长、粒宽、芒长、芒色、落粒性、结实率。将那些茎秆粗壮、籽粒变大、可结实或结实率提高、不易落粒的植株初步确定为加倍成功的同源异源多倍体水稻。
h-2.细胞学鉴定包括两个部分一个染色体数目的观察，二是应用GISH(基因组原位杂交)技术检查所获杂种及其多倍体水稻根尖染色体的基因组构成。染色体数目观察制片采用去壁低渗火焰干燥法，包括取材、固定、水洗酶解低渗、制片染色和制片观察五个步骤。GISH包括实验材料采取、染色体制片、基因组DNA提取及探针制备、原位杂交、杂交后制片的洗脱与信号检测、图象处理六个步骤。同源异源六倍体的染色体数目为2n＝6x＝AAAABB＝72，GISH观察的基因组构成为2n＝6x＝AAAABB＝72(32-44条带蓝色荧光来自A基因组的染色体，16-22条带红色荧光来自B基因组的染色体，并有4-16条带蓝、红区段分布的来自AB基因组部分同源的染色体)。
h.分子标记鉴定采用CTAB法提取亚洲栽培稻品种HN2026-2x及Sg99012-4x、斑点野生稻O.punctata-2x、异源杂种、同源异源多倍体的总DNA。用A基因组B基因组特别序列为引物。经PCR扩增其反应程序为94℃预热5分钟，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸20秒，循环30次再置于72℃保护8分钟，进入4℃保持待测，经琼脂糖凝胶电泳后观察DNA谱带，记录带型并照相。将具有A和B基因组带型的单株确定为杂种，并根据A基因组带型标记量的多少而确定同源异源多倍体。最后综合三种鉴定结果确定已加倍的水稻植株是同源异源六倍体或同源异源八倍体。
本发明所产生的同源异源六倍体水稻AAApApBB和同源异源八倍体水稻AAApApApApBB具有以下积极效果1.建立了选育同源异源多倍体水稻的技术体系；2.创造了两个自然界并未存在的水稻类型；3.充分利用了存在于BB基因组中的野生稻有利基因，强抗逆性、强分蘖性与优质性；4.充分利用PMeS品系的减数分裂稳定性和高结实性以提高同源异源多倍体的结实率；5.充分利用AA基因组存在的籽粒大、不易落粒的优点；6.达到利用远缘杂交和多倍体双重优势选育新型多倍体超级稻品种或杂种的目的。
具体实施例方式
下面以实施例对本发明进一步说明实施例1同源异源六倍体水稻DHI238的选育a.选择亲本以异源四倍体(AsAsBB)Cw008-4x为母本，以PMeS品系HN2026-2x为父本各选5株。
b.杂交和激素处理以Cw008-4x为母本，在开花盛期的早晨7:30开始选择适宜稻穗，通过剪去1/3颖壳，用镊子去除花药，套袋。然后喷加激素混合液(2，4-D+GA3)，稍晾干，在10:30左右取HN2026-2X正要开花的稻穗为父本，置于去雄稻穗的杂交袋上待父本颖花开放时用手轻轻抖动，使花粉尽量多地散落在母本的柱头上，一般需用3穗父本提供，将杂交袋口折叠，夹好回形针，于当日下午4:00左右和第二天、第三天各喷洒激素混合液于杂交稻穗上，以促进杂种胚胎的发育。
c.胚挽救培养取杂交授粉后7-10天的幼嫩谷粒，剥去颖壳，经正常消毒程序后将带有杂种胚胎已膨大的子房接种到胚挽救培养基(如前所述)中，25℃光照12hr下培养，共接入20个子房，12个子房形成愈伤组织。
d.染色体加倍将12块愈伤组织转入2个装有愈伤组织加倍液的三角瓶中，置入恒温摇床，20℃，105rpm振荡培养48hr。愈伤组织加倍液配方为N6+2，4-D 2.0mg/L+6BA0.5mg/L+Sucrose 5％+Colchicines 500mg/L，PH6.0。
e.加倍愈伤组织分化出苗加倍处理完毕后，无菌取出愈伤组织，用无菌水冲洗三次，接入诱导培养基(除了没有Colchicines并添加0.75％agar外，配方与愈伤组织加倍液相同)中恢复7天，愈伤组织再呈旺盛生长状态，再将它们转至分化培养基基中分化出苗。分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+KT2.0mg/L+NAA0./L+Sucrose3％+agar0.75％，pH6.0。在25℃、光照12hr，培养18天时12个愈伤组织中已有4个分化出苗，分化率为33.3％，移走分化苗后的愈伤组织经扩增形成52个，总共为56个愈伤组织，共获126株分化苗，单块愈伤组织分化出苗数为2.25。
f.生根培养将3cm以上的芽苗转入生根培养基1/2MS+6BA0.5/L+Sucrose2％+activated carbon 0.02％+agar0.75％，pH6.0。置于25℃，光照12hr条件下培养生根。126个芽苗在培养25天后有120株分化生根，生根率93.6％。
g.移植培育将f中获得的120株已有10cm左右的加倍杂交水稻试管苗中的培养瓶塞打开，添加无菌水淹没培养基表面，置于20℃散射光的实验台上炼苗2天后，用自来水彻底清洗试管苗根系，于下午4:00(当时气温24℃)分单株插于育秧田中，外盖一层薄膜和一层遮阳网，此后的第2、3、4天中午用1/10MS大量元素喷洒加倍杂种水稻秧苗。一星期后揭开遮阳网和薄膜，20天后统计成活稻株为108株，成活率为90.0％。
h.加倍水稻植株的鉴定h-1.形态学鉴定开花期发现茎秆粗壮同源异源六倍体(直径2.48cm)、异源四倍体(1.27cm)；剑叶面积变大同源异源六倍体(27.20×2.75)、同源异源四倍体(18.75×1.82)；籽粒增大同源异源六倍体(1.12×10.32)、异源同源四倍体(0.84×10.27)；粒重增加异源六倍体(千粒重35.2g)比异源四倍体(26.2g)明显增重。
h-2.细胞学鉴定对初定的已加倍成同源异源六倍体植株的根尖染色体观察计数，为2n＝6x＝72，未加倍的植株为2n＝3x＝36；GISH技术证明异源六倍体根尖染色体，由AAAABB组成，其中20-22条染色体红色探针标记说明为B基因组染色体，40-44条染色体显示蓝色为A基因组染色体，4条到8条染色体呈蓝、红嵌合区段方式，说明它们为A、B部分同源染色体。
h-3.分子标记鉴定抽提同源异源六倍体和其亲本异源四倍体和HN2026-2x的DNA，用A、B基因组特异性标记引物，经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后发现异源六倍体明显具有A基因组和B基因组特有的标记，比具有异源四倍体的A基因组多一条带。
实施例2.同源异源八倍体水稻DHI237的选育a.选择亲本以异源四倍体Cy301-4x(AsAsBB)为亲本之一，以PMeS品系Sg99012-4x为另一亲本各选5株。
b.杂交和激素处理以Cy301-4x为母本、Sg99012-4x为父本，采用与实施例1的方法进行杂交和激素处理。
c.胚挽救培养采用实施例1的相同方法，接入幼嫩子房28个，形成10个愈伤组织，诱导率为35.7％。
d.染色体加倍将10块愈伤组织转入愈伤组织加倍液中，按实施例1的方法培养。
e.加倍愈伤组织分化出苗10个愈伤组织在如实施例1的相同分化条件下培养分化出5个芽苗，分化率达到50％；取出小苗后的愈伤组织再分化，从总共56块愈伤组织中分化出176株芽苗，增殖倍数3.14。
f.生根培养在与实施例1相同的生根培养基中152株芽苗有137株生根，生根率为90.13％。
g.移栽培育以实施例1相同技术将来自f的137株小苗移植于秧田中共存活125株，成活率为91.24％。
h.加倍水稻植株的鉴定h-1.形态学鉴定根据茎秆变粗、叶片增大、可以结实、籽粒增大的特点，初步选定72株为加倍形成的同源异源八倍体。
h-2.细胞学鉴定对加倍形成的同源异源八倍体植株根尖进行染色体计数发现它们为2n＝8X＝96；基因组构成为ApApApApApApBB。
h-3.分子标记鉴定用与实施例1相同的方法发现A、B基因组标记同存于加倍杂种中。
权利要求
1.一种同源异源多倍体水稻选育方法，包括同源异源六倍体(AsAsApApBB)水稻和同源异源八倍体(AsAsApApApApBB)水稻的选育方法，其特征在于过程为a.选择亲本，b.杂交与激素处理，c.胚挽救培养，d.染色体加倍，e.加倍愈伤组织，分化出苗或加倍丛芽生长成苗，f.生根培养，g.移植培育，h.加倍水稻植株的鉴定。
2.根据权利要求1所述的同源异源多倍体水稻选育方法，其特征在于具体过程为a.选择亲本选择优良亚洲栽培稻(AA基因组)品种二倍体与斑点野生稻(Oryzapunctata，BB基因组)二倍体杂交加倍培育或栽培稻四倍体与斑点野生稻四倍体杂交形成的异源四倍体AABB为亲本，以具有多倍体减数分裂稳定性(PMeS，Polyploid Meiosis Stability)品系HN2026、Sg99012及其衍生系的二倍体和四倍体为另一亲本；b.杂交与激素处理杂交以异源四倍体AABB为母本，以PMeS品系为父本，采用剪颖去雄，在授粉前1.5-2小时往柱头上喷洒混合激素溶液(2，4-D 0.02-0.05mg/L+GA30.03-0.06mg/L)，稍稍晾干，剪取开花刚开始的父本稻穗置于母本稻穗上方，轻轻抖动使花粉尽可能多的散落到柱头上，授粉后的当天下午4时后往杂交穗时喷洒混合激素一次，第2、3天下午各喷洒一次，以促进杂交胚胎发育；C.胚挽救培养取授粉后7-10天的幼嫩谷粒，剥去颖壳，经消毒处理后接种于胚挽救培养基种中，25℃暗培养，胚挽救培养基配方为N6+6-BA 0.3-0.7mg/L+NAA0.3-1.0mg/L+CH50-100mg/L+Sucrose3-5％+Agar0.75％，pH6.0；d.染色体加倍在胚挽救培养过程中，部分幼胚经萌发生长出芽，另一部分则诱导出愈伤组织；因此以愈伤组织和丛芽两种途径诱导染色体加倍；d-1.愈伤组织加倍处理取生长旺盛，浅黄色具颗粒状表面的愈伤组织接入含有秋水仙素(Colchicines)300-800mg/L的加倍液中，置于恒温摇床20-25℃，90-115rpm摇荡培养48-60hr，愈伤组织加倍液配方为N6+2，4-D 1.0-3.0mg/L+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.5-1.5mg/L+Sucrose3-5％+Colchicines300-800mg/L，pH6.0，加倍处理完毕后，用无菌水冲洗愈伤组织3-4次，接入上述配方中培养7-10天；d-2.丛生芽加倍处理经胚挽救萌发的幼苗，在丛生芽培养基(2/3MS+6BA 2.0-3.0mg/L+KT1.0-3.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+sucrose3-6％+agar0.6-1.0％)中扩增丛芽，将高度在2cm以下的小芽切下来，接种至含有秋水仙素的丛生芽加倍液中，于恒温摇床20-25℃，90-115r/min振荡培养48-60hr，丛生芽加倍液为1/2MS+6BA2.0mg/L+KT 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+Sucrose5％+Colchicines 500mg/L，pH6.0，加倍处理后的小芽用无菌水冲洗3-4次；e.加倍愈伤组织分化出苗或者加倍丛生芽生长成苗将恢复培养的加倍愈伤组织转至分化培养基中诱导分化出苗，分化培养基为MS+6BA 1.0-2.0mg/L+KT1.0-3.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+Sucrose3-5％+Agar0.6-1.0％，pH6.0，或者将加倍处理后的小芽接入丛生芽培养基中恢复培养，丛生芽培养基为1/2Ms+6BA 2.0mg/L+KT 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+Sucrose3-5％+agar0.6-1.0％，pH6.0，一个星期后转入新鲜培养基中直至丛芽再生长；f.生根培养加倍愈伤组织分化出苗和加倍丛芽培养出的丛芽生长到5-15cm时按单个芽苗分开接入生根培养基1/2MS+6BA0.1-0.3mg/L+NAA0.3-0.7mg/L+Sucrose2-3％+activated carbon 0.01-0.3％+Agar0.6-1.0％，pH6.0中生根；g.移植培育全部生根的完整小水稻植株生长到10cm以上时，先打开瓶塞加入无菌水于室内散射光下炼苗2天，在自来水中彻底洗净小水稻植株的根系，然后于下午4:00后按单株移植至水稻育秧田或泥钵中，保持1cm左右浅水，用弓架支撑薄膜外置遮阳网，移植的第2、3、4天中午喷洒1/10MS大量元素于移植秧苗上既保湿又增加营养，4-5天后揭开薄膜，7天后揭去遮阳网，90％以上加倍水稻苗能成活；h.加倍水稻植株的鉴定鉴定可分为形态学鉴定、细胞学鉴定和分子标记鉴定；h-1.形态学鉴定在水稻抽穗期对加倍植株进行观测，对茎秆粗壮、籽粒变大、可结实或结实率提高的植株分别挂牌，成熟期考察它们的株高、茎粗、粒长、粒宽、芒长、芒色、落粒性、结实率，将那些茎秆粗壮、籽粒变大、可结实或结实率提高、不易落粒的植株初步确定为加倍成功的同源异源多倍体水稻；h-2.细胞学鉴定包括两个部分一个染色体数目的观察，二是应用GISH(基因组原位杂交)技术检查所获杂种及其多倍体水稻根尖染色体的基因组构成，染色体数目观察制片采用去壁低渗火焰干燥法，包括取材、固定、水洗酶解低渗、制片染色和制片观察五个步骤，GISH包括实验材料采取、染色体制片、基因组DNA提取及探针制备、原位杂交、杂交后制片的洗脱与信号检测、图象处理六个步骤，同源异源六倍体的染色体数目为2n＝6x＝AAAABB＝72，GISH观察的基因组构成为2n＝6x＝AAAABB＝72(32-44条带蓝色荧光来自A基因组的染色体，16-22条带红色荧光来自B基因组的染色体，并有4-16条带蓝、红区段分布的来自AB基因组部分同源的染色体)；h.分子标记鉴定采用CTAB法提取亚洲栽培稻品种HN2026-2x及Sg99012-4x、斑点野生稻O.punctata-2x、异源杂种、同源异源多倍体的总DNA，以A基因组B基因组特别序列为引物，经PCR扩增，其反应程序为94℃预热5分钟，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸20秒，循环30次再置于72℃保护8分钟，进入4℃保持待测，经琼脂糖凝胶电泳后观察DNA谱带，记录带型并照相，将具有A和B基因组带型的单株确定为杂种，并根据A基因组带型标记量的多少而确定同源异源多倍体，最后综合三种鉴定结果确定已加倍水稻植株为同源异源六倍体或同源异源八倍体。
全文摘要
本发明提出了通过远缘杂交和生物技术创建同源异源多倍体水稻的方法。它包括a.选择亲本，b.杂交与激素处理，c.胚挽救培养，d.染色体加倍，e.加倍愈伤组织分化出苗或加倍丛芽生长成苗，f.生根培养，g.移栽培育，h.加倍水稻植株的鉴定等八个步骤。创建的同源异源多倍体水稻有两种，一种是以异源四倍体A
文档编号A01H1/04GK101044836SQ20071005200
公开日2007年10月3日 申请日期2007年4月28日 优先权日2007年4月28日
发明者侯明辉, 朱姣姣, 万春春, 陈冬玲, 宋兆建, 蔡得田 申请人:湖北大学