半滑舌鳎人工催产和雌核发育二倍体鱼苗的诱导方法

专利名称：：半滑舌鳎人工催产和雌核发育二倍体鱼苗的诱导方法
技术领域：
：本技术属于鱼类遗传育种
技术领域：
，是一种批量生产适于苗种繁育的半滑舌鳎未受精卵以及诱导半滑舌鳎卵进行雌核发育，获得雌核发育二倍体鱼苗的方法，可应用于半滑舌鳎苗种规模化生产和全雌苗种的生产。
背景技术：
：半滑舌鳎(6>/7^/o^m"肌7/ser")是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类，我国沿海均有分布，以黄海、渤海为多。半滑舌鳎由于其味道鲜美、.肉质细嫩、营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。半滑舌鳎是目前海水鱼类养殖的主要品种之一，其养殖产量目前近万吨，价格昂贵，市场价达到150元/500克左右，半滑舌鳎养殖业目前每年的产值约为15亿元人民币。鉴于半滑舌鳎的养殖潜力和潜在的经济社会效益，近年来，我国科技工作者对半滑舌鳎生殖调控和自然产卵技术进行了大量研究工作，主要釆用人工控制光照和水温的方法刺激半滑舌鳎亲鱼成熟和自然产卵，该项技术于2002年获得成功，在人工养殖条件下，通过控制亲鱼养殖池的水温和光照时间，诱导半滑舌鳎亲鱼成熟并自然产卵，获得了半滑舌鳎受精卵，并生产出了半滑舌鳎苗种(中国水产科学研究院黄海水产研究所，姜言伟等，1993;柳学周等，2006)。这种半滑舌鳎育苗方式，基本上是以人工控温、控光刺激亲鱼成熟和在养殖池中进行自然产卵和自然受精，这种生产模式的可操作性较差，亲鱼产卵率较低，受精率较低，不利于有计划的安排生产，影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的形成；特别是这种育苗方式不能获得半滑舌鳎的未受精卵，严重影响了半滑舌鳎雌核发育和性别控制技术的建立和全雌苗种的生产，影响了半滑舌鳎养殖业的产业化发展。因此，开展半滑舌鳎人工催产技术的研究，建立通过注射激素使亲鱼同步发育和排卵的技术，获得未受精卵，是进行半滑舌鳎规模化育苗和人工雌核发育研究中急需解决的一大难题。而有关通过激素注射进行半滑舌鳎人工催产、获得未受精卵的研究，目前未见报道。研究表明，半滑舌鳎雌性个体和雄性个体，在生长速率上存在巨大差别，其雌性个体比雄性个体大3-4倍(中国水产科学研究院黄海水产研究所，孟田湘等，1988),半滑舌鳎鱼苗经过1年养殖后，雌性个体可长到500-750克，而雄性个体则只有50-150克。由于雄性个体生长过慢，影响了商品鱼的质量，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展，因此，对半滑舌鳎开展雌核发育技术的研究、研制全雌育种技术，培育半滑舌鳎全雌苗种，在渔业生产中推广应用全雌苗种，对于提高半滑舌鳎的养殖产量和产品质量非常重要。如果研制出半滑舌鳎全雌苗种，进行大面积推广后，将极大提高半滑舌鳎的养殖产量，增加产量80—100%,每年将增加10多亿元的经济效益。雌核发育是生产鱼类全雌苗种的重要途径。这条技术途径在其它淡水鱼类和少数海水鱼类上有过一些研究，并生产出了一些单性苗种，如对银鲫天然雌核发育机理进行了大量的研究(中国科学院水生生物研究所，桂建芳等，1996),我国最早在鲤鱼上建立了人工雌核发育技术(中国科学院水生生物研究所，吴清江，1981);随后，在鲢鱼也建立了雌核发育诱导方法(中国水产科学研究院长江水产研究所，潘光碧等，1995);同时，一些学者也开展了海水鱼类牙鲆雌核发育技术的研究(中国科学院海洋研究所刘静等，1999)。不过，上述鱼类的性别决定机制均为XY型，即雄性为XY型、雌性为XX型性别决定，雌鱼只产生一种卵子，即X卵子，而雄鱼则产生XY型2种精子。最近，国内一些学者开展了半滑舌鳎性别相关分子标记筛选的研究，以及半滑舌鳎性腺发育和性别转换技术的研究等项工作，成功地筛选到半滑舌鳎雌性特异AFLP分子标记，建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术(黄海水产研究所陈松林等，2007;邓思平等，2007)，发现半滑舌鳎雌性个体存在异型性染色体(周丽青等，2005)。AFLP分子标记和染色体分析研究表明，半滑舌鳎为ZW型性别决定机制，即雌鱼产生Z型和W型两种卵子，而雄鱼只产生一种Z型精子。这种ZW型雌鱼产生的卵子，经雌核发育后将产生ZZ型雄鱼和鼎型超雌鱼两种类型。ww型超雌鱼与zz型雄鱼交配后将产生全雌苗种。而有关半滑舌鳎人工雌核发育技术以及通过人工雌核发育诱导二倍体鱼苗产生的技术，目前国内外均未见才艮道。
发明内容本发明的目的是1)建立半滑舌鳎亲鱼人工催产技术，通过人工催产获得半滑舌鳎未受精卵；2)建立人工诱导半滑舌鳎卵子进行雌核发育的技术方法，培育雌核发育二倍体鱼苗。本发明技术内容包括二个方面一、半滑舌鳎亲鱼人工催产和授精方法；二、雌核发育二倍体鱼苗的诱导和鉴定方法。一、半滑舌鳎亲鱼人工催产和授精方法它的技术内容包括1.亲鱼的选择；2.催产激素的选择和剂量；3.人工催产及人工授精；1.亲鱼的选择方法选择体表无损伤的半滑舌鳎雌性和雄性成鱼作为亲鱼，雌鱼体重应在为1.5-3kg/尾；雄鱼体重为150-350g/尾，按每平方米一雌二雄的密度进行室内流水养殖，投喂贝类、野杂奸和活沙蚕等新鲜活何料，每天的投辨量为鱼体重的2-4%。对达到性成熟年龄(雌性3年、雄性2年)的亲鱼，在催产前2-3个月进行控温控光；在此期间，水温从17-19。C逐步升高到22-23°C(按每10天升高0.5-l°C),并维持在此温度；光照时间由每天8小时逐渐延长到16小时(按每10天延长1小时)，并维持在16小时。通过观察和手摸检查选择性腺明显隆起、用手轻压性腺上下两侧有明显的充实感且性腺前端有一定的柔软度的雌鱼，用于注射激素进行人工催产。雄性亲鱼要选择轻挤性腺部位，可以看到精液流出者方可用于催产。2.催产激素的选择和剂量半滑舌鳎对几种催产激素较为敏感，如绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素释放激素类似物A2和A3以及地欧酮(DOM)等，其中如下几种激素及其剂量催产效果较好LRH-A2的适宜剂量为雌鱼G.5-2.0|ag/kg,雄鱼3-6jug/kg;LRH-A3的适宜剂量为雌鱼0.4-2.0|ug/kg,雄鱼2-5ng/kg;HCG+LRH-A3的适宜剂量为难鱼HCG40-60IU+LRH-A30.4-1.5jug/kg;LRH-A3+D0M的适宜剂量为:雌鱼LRH-A30.4-2.0jug/kg+DOM卜2mg/kg。3.人工催产及人工授精技术内容包括(l)激素注射、(2)效应时间确定、(3)人工挤卵和授精。(1)激素注射选好亲鱼后，按以上催产剂量进行激素注射。注射时可以用MS-222进行麻醉或直接注射，亲鱼从水中捞起后，迅速用大毛巾包住，以防其受伤。激素溶液的注射量雌鱼不要超过lml/每尾，雄鱼不要超过0.2ml/每尾，注射部位为侧线上方头部后方的肌肉较厚部分，进针角度不要超过45°,雄鱼注射时还要注意进针深度，不要穿透鱼体。(2)效应时间确定激素种类不同，注射后的效应时间也不同，各种激素在22-23。C时的效应时间如下LRH-A2:36-44h;LRH-A3:35-43h;HCG+LRH-A3:34-42;LRH-A3+D0M:35-43h。(3)人工挤卵和授精到达效应时间以后，当雌鱼性腺由硬明显变软，并感觉性腺内的卵有明显的流动感，即可进行挤卵和人工授精。用手在性腺上下两侧从后到前轻压性腺部位，即可将卵挤出，接在烧杯中。采精时，用手挤压雄鱼腹部，将挤出的精液用吸管吸到2-5毫升的小瓶中备用。当进行生产性授精时，每条雌鱼的卵(100-300毫升)用2-3条雄鱼的精液(1-2毫升)授精即可。将精卵混合均匀，先加入两倍于卵体积的海水，2-3分钟后，再加入5-8倍于卵体积的海水完成受精过程，20min后洗去过多的精液即可转入聘化缸进行孵化。二、雌核发育二倍体鱼苗的诱导方法包括(一)、半滑舌鳎卵子人工雌核发育方法；(二)、雌核发育鱼苗的鉴定方法。(一)、半滑舌鳎卵子人工雌核发育方法它的技术内容包括1、精子的遗传灭活；2、未受精卵与失活精子的"授精"；3、雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定；4、雌核发育鱼卵染色体加倍冷休克温度及处理时间的确定。1.精子的遗传灭活采用异源的花鲈精子和同源的半滑舌鳎精子刺激半滑舌鳎卵子进行雌核发育。半滑舌鳎精液先用显微镜检查精子活力(运动精子的百分率)，当活力达到60%以上者可用于紫外线灭活处理。精子的遗传灭活条件为将100juL半滑舌鳎精液用^"子稀释液MPRS(配方为KC10.39g/L,CaCl22H200.17g/L,NaHC030.25g/L,NaCl3,59g/L,NaH2P040.22g/L，MgCl20.23g/L,Glucose1.0g/L)稀释10倍，平铺于培养皿中，用90-110mJ/cm2紫外线照射，然后与5-10mL半滑舌鳎卵"授精"。异源精子为冷冻保存的花鲈精子。从液氮中取出花鲈冷冻精子，在37。C水浴复温解冻后镜检精子活力，活力达到70%以上者用于紫外线灭活处理。将100juL解冻的花鲈精液用lmLMPRS溶液稀释后，平铺于培养皿中，分别用紫外线照射，剂量范围为20，40,60,80,100,120，140，160mJ/cm2。照射后的精液分别和5-10mL半滑舌鳎卵受精，在22-23。C恒温培育。结果表明，90-110mJ/cm2的紫外线照射精子刺激卵雌核发育的效果较好，胚胎发育率高。2.未受精卵与灭活精子的"授精"将经紫外线照射后的精液200-1000jaL加到半滑舌鳎未受精卵(10-100毫升)中，将精卵轻轻摇动混匀，随后加入2-10毫升海水，继续混匀后，再加入20-200毫升海水完成"4受^r，，过程，在22-23。C下培育2-IO分钟，准备用于染色体加倍处理。3.雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定染色体加倍采用冷休克处理方法，在"授精"后不同时间(2,3,4，5,6，7，8min),将卵倒入小抄网(直径10-15厘米)，然后将盛有雌核发育卵的小抄网浸入3-6。C的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为20-30min，冷^f木克处理完毕后将卵移入22-23。C海水中培养。统计受精率，单倍体率，雌核发育二倍体率。结果发现雌核发育卵在"授精"后4-6min进行冷休克处理都能够诱导产生雌核发育二倍体，且以"授精"后5min的诱导率最高。4.雌核发育鱼卵染色体加倍冷休克温度和持续时间的筛选在确定了冷休克起始时间后，需要确定冷休克温度和休克持续时间。将与紫外失活精子"授精"的卵，分成6个温度梯度2。C，4°C,5°C,6°C,8°C,10°C，在每个溫度梯度分别处理15min,20min，25min,30min，35min和40min。共计36组试验。最后统计受精率，单倍体率，雌核发育二倍体率。结果表明在休克温度3。C-6。C，休克时间15-30min条件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中在4.5-5.5'C处理20-25min的雌核发育诱导率最高。(二)、雌核发育鱼苗的鉴定方法它的技术内容包括l.染色体分析鉴定雌核发育鱼苗；2.通过微卫星分子标记鉴定雌核发育鱼苗；3.通过半滑舌鳎雌性特异AFLP标记鉴定雌核发育鱼苗。1.染色体分析鉴定雌核发育鱼苗采用常规染色体制片方法，对半滑舌鳎雌核发育鱼苗进行染色体分析，发现半滑舌鳎雌核发育鱼苗的染色体数为42条，与半滑舌鳎普通鱼苗染色体数目完全相同；同时我们还发现有些雌核发育鱼苗含有2条巨型WW染色体，这些鱼苗为雌核发育的鼎型鱼苗。由此证明这些鱼苗为雌核发育二倍体个体，与母本完全相同。2.用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗；采取高盐法提取雌核发育鱼和正常鱼苗基因组DNA,从我们筛选到的半滑舌鳎多态性微卫星引物中，选取微卫星引物Cyse31,其引物序列为Cyse31Nl:GACGGTCAAAAGTGGTGTGA;Cyse31Cl:TTTCCACTGTTCACCTGCTG.然后进行PCR扩增，PCR扩增条件为94。C热变性5min,然后进行38个循环，每个循环包括94。C变性30s,56-62。C退火30s，72。C延伸30s,最后在72。C延伸7min。PCR扩增产物在6。/。的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，采用银染法染色。结果表明该引物对在半滑舌鳎普通鱼苗中扩增出2个等位基因(即杂合子)的比例为55.6%，而在鲈鱼精子诱导的雌核发育鱼苗(25尾)中，有20尾鱼苗只扩增出1个等位基因，纯合率为80%,而只有5个个体扩增出2个等位基因，杂合率仅为20%,并且在所有检测的雌核发育鱼苗中仅出现2个等位基因。由以上结果可以证明雌核发育鱼苗确实是由雌核发育而来。3.用半滑舌鳎雌性特异AFLP标记鉴定雌核发育鱼苗采用我们以前建立的半滑舌鳎雌性特异AFLP标记和遗传性别鉴定的PCR技术进行半滑舌鳎雌核发育鱼苗遗传性别的鉴定。其技术原理为含有W染色体的雌性个体中可以扩增出雌性特异DNA片段，不含W染色体的ZZ雄性个体则没有这种特异DNA片段。采用雌性特异PCR引物Cse382Nl(序列为ATTCACTGACCCCTGAGAGC)和Cse382Cl(序列为GTAAACAGCACACACTCAACAA)，利用高盐法提取半滑舌鳎雌核发育鱼苗个体DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR条件为95。C预变性5分钟，然后95°C30秒、66°C30秒、72。Cl分钟，35个循环，最后在72"C延伸IO分钟，采用1%琼脂糖电泳分析PCR产物。从10尾异精雌核发育半滑舌鳎鱼苗中检测到4尾鱼苗含有382bp的雌性特异DNA片段，表明我们获得的半滑舌鳎雌核发育鱼苗中含有40%左右的超雌鱼苗。本发明与已有技术对比其特点是本发明突破了半滑舌鳎人工催产和人工雌核发育的难题，成功地建立了半滑舌鳎人工催产技术，可以通过人工催产批量化获得未受精卵；卵子受精率为60-89%,孵化率为34-79%;本发明建立了半滑舌鳎人工雌核发育技术，获得了异源精子和同源精子诱导的雌核发育二倍体鱼苗，采用AFLP标记证明雌核发育鱼苗中含有WW超雌个体，这些个体可以用来生产半滑舌鳎全雌苗种；本发明建立的半滑舌鳎人工催产和雌核发育二倍体鱼苗的诱导技术，技术先进，操作方便，方法高效、实用、可靠，其诱导半滑舌鳎雌核发育二倍体的百分率为0.4-6.3%;为半滑舌鳎苗种生产和全雌苗种研制提供了技术手段，在半滑舌鳎规模化育苗、性别控制和全雌鱼苗培育上具有重大应用价值和广阔的推广应用前景。图1:染色体加倍适宜起始时间的确定；图2:适宜冷休克温度的确定；图3:适宜冷休克处理时间的确定；图4:雌核发育半滑舌鳎的染色体分析；A:雌核发育产生的ZZ型个体；B:雌核发育产生的WW型个体，图中可见2个巨大的染色体，即鼎染色体。图5:半滑舌鳎雌核发育鱼苗的微卫星鉴定；1-18为半滑舌鳎普通二倍体鱼苗个体，M为pBR322DNA/#^I分子量标准，19-43为半滑舌鳎雌核发育鱼苗个体。图6:半滑舌鳎雌核发育鱼苗的遗传性别鉴定上部为雌性特异DM标记的4全测，下部为Actin基因作为对照。具体实施例方式下面以半滑舌鳎为例，对本发明的技术内容进行详细说明本发明技术内容包括一、半滑舌鳎亲鱼人工催产和授精；二、半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗的诱导和鉴定方法。一、半滑舌鳎亲鱼人工催产和授精它的技术内容包括1.亲鱼的选择；2.催产激素的选择和剂量；3.人工催产及人工授精；1.亲鱼的选择研究用半滑舌鳎亲鱼为山东莱州明波水产有限公司和山东海阳黄海水产有限公司人工培育的半滑舌鳎亲鱼，雌核发育诱导实验也是在上述两个公司进行。选择体表无损伤的半滑舌鳎雌性和雄性成鱼作为亲鱼，雌鱼体重应在为1.5-3kg/尾；雄鱼体重为150-350g/尾，按每平方米一雌二雄的密度进行室内流水养殖，投喂贝类、野杂虾和活沙蚕等新鲜活饵料，每天的投斜量为鱼体重的2-4%。对达到性成熟年龄(雌性3年、雄性2年)的亲鱼，共选择了400尾亲鱼，在催产前2-3个月进行控温控光；在此期间，水温按每10天升高0.5-rC从17-19。C逐步升高到22-23°C，并维持在此温度；光照时间按每10天延长1小时由每天8小时逐渐延长到16小时，并维持在16小时。通过观察和手摸检查选择性腺明显隆起、用手轻压性腺上下两侧有明显的充实感且性腺前端有一定的柔软度的雌鱼，用于注射激素进行人工催产。雄性亲鱼要选择轻挤性腺部位，可以看到精液流出者方可用于催产。2.催产激素的选择和剂量通过反复的试验发现，半滑舌鳎对绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素释放激素类似物A2和A3以及地欧酮(D0M)等各种催产激素都比较敏感，用较小的剂量就可以诱导雌鱼排卵，各种激素均能用于催产生产。但是，各种激素的催产剂量不宜太高，经过4莫索后，本发明找到了较为有效的激素种类及其剂量分别为HCG:雌鱼50-120IU/kg,雄鱼300-500IU/kg;LRH-A2:雌鱼0.5-2.0jig/kg，；^l鱼3-6ng/kg;LRH-A3:辦i鱼0.4-2.0ng/kg，力#鱼2-5|ag/kg;另外，几种激素组合也有较好的效果HCG+LRH-A3:雌鱼HCG40-60IU+LRH-A30.4-1.5jag/kg;LRH-A3+D0M:对,鱼LRH-A3Q.4—1.8jugkg+DOMl-2mg/kg。3.人工催产及人工授精(1)激素注射选好亲鱼后，按以上催产剂量注射催产激素。催产亲鱼数量比例按雌雄=1:4进行。注射时可以用MS-222进行麻醉或直4妻注射，直接注射时要在桌上铺一层厚度〉4cm的海绵，在海绵上铺上一块海水浸湿的大毛巾，亲鱼从水中捞起后，迅速用大毛巾包住，以防其受伤。注射时要注意，激素溶液的注射量雌鱼不要超过lml,雄鱼不要超过0.2ml,注射部位为侧线上方头部后方的肌肉较厚部分，进针角度不要超过45°，雄鱼注射时还要注意进针深度，不要穿透鱼体。采取一次注射方式。(2)效应时间确定将注射激素后到挤卵的时间定为效应时间。不同激素的效应时间不尽相同，而且效应时间与亲鱼池的水温也密切相关。经过:l莫索后确定了各种激素在水温为23。C时的效应时间如下HCG:39-48h;LRH-A2:36-44h;LRH—A3:35—43h;HCG+LRH-A3:34-42;LRH-A3+D0M:35-43h。(3)人工挤卵和授精到达效应时间以后，要每30min检查一次，当雌鱼性腺由硬明显变软时，可进行挤卵和人工授精。挤卵时的操作和注射催产激素时一样进行。当雌鱼从水中捞起后，要注意用手按住生殖孔部位，以防卵流出或喷出并迅速用毛巾包好鱼体，生殖孔一侧露在外侧并^^去海水。用手在上下两侧从后到前轻压性腺部位，即可将卵挤出，接在烧杯中。采精时，用手挤压雄鱼腹部，将挤出的精液用吸管吸到2-5毫升的小瓶中备用，或直接将精液挤到有卵的烧杯中。当进行生产性授精时，每条雌鱼的卵(100-300毫升)用2-3条雄鱼的精液(1-2毫升)授精即可。将精卵混合均匀，加入2倍于卵量的海水，混合均勻完成授精操作，20min后洗去多余精液即可转入孵化缸中进行孵化。采用如上方法，我们成功地进行了多次人工催产实验，获得未受精卵3500多毫升，现将几次催产实验的结果列于表l。表l、半滑舌鳎人工催产和授精结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>二、半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗的诱导和鉴定方法，包括二部分内容(一)半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗的诱导；(二)半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗的鉴定方法。(一)半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗的诱导它的技术内容包括1、精子的遗传灭活；2、未受精卵与灭活精子的"授精"；3、雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定；4、雌核发育鱼卵染色体加倍冷休克温度及处理时间的确定。1.精子的遗传灭活经过筛选比较，本发明的实验表明，同源的半滑舌鳎精子和异源的花逢卢精子都可以用来刺激半滑舌鳎卵子进行雌核发育。半滑舌鳎精液先用显微镜检查精子活力(运动精子的百分率)，当运动精子的百分率达到60%以上者可用于紫外线灭活处理。精子的遗传灭活条件为将100mL半滑舌鳎精液用精子冷冻稀释液MPRS(配方为KC10.39g/L，CaCl2.2H200.17g/L,NaHCO30.25g/L，NaCl3.59g/L,NaH2P040.22g/L，MgCh0.23g/L,Glucose1.0g/L)稀释10倍，平铺于培养皿中，用90-110mJ/cm2紫外线照射，然后与5-10mL半滑舌鳎卵"授精"。异源精子为我们冷冻保存的花鲈精子。从液氮中取出花鲈冷冻精子，在37。C水浴复温解冻后镜检精子活力，活力达到70%以上者用于紫外线失活处理。将lOOiaL解冻的花f卢精液用lmLMPRS溶液稀释后，平铺于培养皿中，分别用紫外线照射，剂量范围为20，40，60,80，100，120，140,160fflJ/cm2。照射后的精液分别和5-10mL半滑舌鳎卵受精，在22-23。C恒温培育，在细胞分裂后，统计受精率。待发育至嚢胚期，原肠期，肌节期，尾芽期时分别统计所剩数量，单倍体率及其发育情况。综合考虑受精率，单倍体率及发育情况，表明用90-110mJ/cfi^的紫外线照射后的精子刺激卵雌核发育的效果较好，胚胎发育率高。2.未受精卵与失活精子的"授精"将以上经紫外线照射后的精液加到半滑舌鳎未受精卵(10-100毫升)中，将精卵轻轻摇动混匀，随后加入2-10毫升海水，继续混允后再加入20-200毫升海水完成4受精"过程，在23。C下培育2-10分钟，准备用于染色体加倍处理。3、雌核发育鱼卯染色体加倍起始时间的确定染色体加倍采用冷休克处理方法。在"授精，，后不同时间(2,3，4，5，6,7，8min),将卵倒入小抄网(直径10-15厘米)，然后将盛有雌核发育卵的小抄网浸入3-6。C的海水浴中进行冷^f木克处理，冷休克处理时间为20-30min,冷休克处理完毕后将小抄网中的卵转入23。C海水中培养。同时用同批精子进行单倍体对照。统计受精率，单倍体率，雌核发育二倍体率。结果发现雌核发育卵在"授精"后4-6rain进行冷休克处理都能够诱导产生雌核发育二倍体，且以"授精"后5min的诱导率最高。其雌核发育二倍体相对诱导率达2.4±0.7%(图1)。4.染色体加倍冷休克温度和持续时间的筛选用90-110mJ/ci^剂量的紫外线(UV)处理花f卢精子，并与半滑舌鳎卵在23。C下4受精，受精后5min按照如下条件进行筛选。冷休克温度设置为2。C,4°C,5°C，6°C，8。C和10°C6个梯度，冷休克处理时间设置为15min，20min,25min,30min,35min和40min。共计36组试验。最后统计受精率，单倍体率，雌核发育二倍体率。结果表明在休克温度3。C-6。C，休克时间15-30min条件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中以4.5-5.5°C,20-25min条件下二倍体诱导率最高(图2和图3)。(二)、半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗的鉴定方法它的技术内容包括l.通过染色体分析鉴定雌核发育鱼苗；2.通过^t卫星分子标记鉴定雌核发育鱼苗；3.通过半滑舌鳎雌性特异AFLP标记鉴定雌核发育鱼苗。1.染色体分析鉴定雌核发育鱼苗(1)半滑舌鳎胚胎和鱼苗染色体制备根据染色体制备的常规方法进行改进后进行半滑舌鳎雌核发育胚胎和鱼苗染色体的制备。主要步骤包括将胚胎或鱼苗置于0.02%的秋水仙素中，在室温下处理2个小时。然后把胚胎或鱼苗放入0.075mol/L的KCL中低渗30分钟。用新配制的卡诺氏液(曱醇冰醋酸=3:1)连续固定3次，每次20分钟。再取单个胚胎或鱼苗放入50%的冰醋酸中，用尖镊子撕碎胚胎，使细胞游离；采用热滴片法滴片，10%吉姆萨染液染色20分钟，然后在IOOO倍显微镜下镜检。(2)染色体鉴定结果由于花鲈染色体数目为2n=48条，其核型为48t;而半滑舌鳎染色体数目为2n=42,其核型为421。因此花妒的染色体数目与半滑舌鳎相差很大，通过染色体分析即可证明雌核发育鱼苗是否为雌核发育而来。如果雌核发育鱼苗的染色体数目及核型与母本(半滑舌鳎)相同，则证明这些鱼苗是雌核发育而来。本发明采用常规方法对半滑舌鳎雌核发育胚胎和鱼苗进行了染色体分析，发现半滑舌鳎雌核发育鱼苗的染色体数为42条，与半滑舌鳎染色体数目完全相同；同时我们还发现有些雌核发育个体含有2条巨型WW染色体，这些个体为雌核发育的WW类型(图4)。由此证明这些鱼苗为雌核发育二倍体个体。2.用微卫星标记鉴定半滑舌鳎雌核发育鱼苗微卫星标记具有较高的多态性以及共显性遗传的特性，能够检测出种群及个体间的异质性，可以用于检测雌核发育二倍体的遗传结构及其与雌性亲本的遗传同质性。因此，我们利用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗。(1)基因组DNA的提取采取高盐法提取半滑舌鳎雌核发育个体和正常二倍体个体基因组DNA:首先将固定于无水乙醇中的鱼苗或鳍条置于l.5ml离心管中，剪碎后加入400n1TNES裂解液(lOmMTris-HCl，pH7.5,400jaMNaCl，100mMEDTA,0.6%SDS)和IOjil蛋白酶K(10mg/ml),然后于55。C消化。消化完全后，加入140iaK包和氯化钠溶液，混匀，12000rpm/min4。C离心30min。取上清液，加入两倍体积-2(TC预冷的无水乙醇沉淀，然后将絮状沉淀用无菌的吸头挑出后用70。/。乙醇洗涤两次，待乙醇完全挥发后，用50jalTE(10mMTris-HCl,pH8.0，10mMEDTA)溶解DNA。(2)PCR扩增PCR反应体系为IOnl，包括lxPCRbuffer[20mMTris-HCl，PH8.4,20mMKC1，10mM(NH4)2S04]，10—50ng基因组DNA，0.2pM引物，120juMdNTPs,1.5mMMgCl2和O.5Ura《酶(TaKaRa)。PCR扩增条件为94。C热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94°C变性30s,56-62。C退火30s，72。C延伸30s,最后在72。C延伸7min。用于4全测雌核发育半滑舌鳎的微卫星标记为Cyse31,其引物序列为正向引物序列GACGGTCAAAAGTGGTGTGA;反向引物序列TTTCCACTGTTCACCTGCTG(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳在PCR产物中加入5jul的曱酰胺上样液(其中包含O.01MEDTA，1mg/mU臭芬蓝，1mg/ml二曱苯青)于95。C变性5分钟，然后立刻放在冰水中。变性后的PCR产物于6。/。的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以pBR322DNA/#wI(TIANGEN)作为分子量标准，银染法染色。(4)结果分析首先通过微卫星富集文库法构建了半滑舌鳎微卫星富集文库，从中筛选出多态性微卫星标记。然后用这些多态引物在正常鱼苗和雌核发育鱼苗中进行扩增，从中进一步筛选出在正常群体里杂合率较高、在雌核发育群体里纯合率较高的标记。经过筛选，从半滑舌鳎微卫星富集文库中筛选到的微卫星标记Cyse31可以用来鉴定半滑舌鳎雌核发育二倍体，该标记在18尾半滑舌鳎普通鱼苗中扩增出2个等位基因(即杂合子)的比例为55.6%;而在25尾雌核发育鱼苗中，有20尾个体只扩增出1个等位基因(纯合子比例为80%)，仅有5尾个体扩增出2个等位基因，杂合子比例仅为20%(见图5),并且在所有检测的雌核发育个体中仅出现2个等位基因(图5)。由以上结果可以证明雌核发育鱼苗确实是由雌核发育而来。3.用半滑舌鳎雌性特异AFLP标记鉴定雌核发育鱼苗采用我们以前建立的半滑舌鳎雌性特异标记和遗传性别鉴定技术，可以鉴定出半滑舌鳎雌核发育鱼苗的遗传性别。才艮据半滑舌鳎雌性异配的特点，即半滑舌鳎雌性亲鱼产生2种卵子，Z型卵和W型卵，因此在雌核发育鱼苗中就产生2种类型，一种是ZZ型雄鱼，另一种则是WW型超雌鱼。我们以前建立的半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术可以从具有W染色体的个体中扩增出特异DNA片段，而ZZ雄性个体则没有这种特异DNA片段。采用雌性特异PCR引物Cse382Nl(序列为ATTCACTGACCCCTGAGAGC)和Cse382Cl(序列为GTAAACAGCACACACTCAACAA)，利用高盐法提取半滑舌鳎雌核发育鱼苗个体DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25.Oji1，包括2.5jul10xPCR緩冲液，L0|a12.5mMdNTP,2.0ju110pM引物混合液，基因组DNA0.8-1.5jul，双蒸水16.3-17jul，Taq酶(5Us/|al)0.2/al。PCR条件为95。C预变性5分钟，然后95。C30秒、66。C30秒、72。Cl分钟，35个循环，最后在72。C延伸10分钟，进行1%琼脂糖电泳检测，我们从10尾异精雌核发育半滑舌鳎鱼苗中成功地检测到4尾鱼苗含有382bp的雌性特异DNA片段，而在用半滑舌鳎精子授精的10尾普通鱼苗中，也才企测到4尾鱼苗含有382bp的雌性特异DNA片段(图6),表明我们获得的半滑舌鳎鱼苗中含有4oy。左右的ww超雌鱼苗。三、雌核发育二倍体鱼苗诱导实施结果采用上述建立的半滑舌鳎雌核发育方法，我们10多次成功地获得了半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗。现将半滑舌鳎雌核发育鱼苗研制的代表性结果列于表2。表2、半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗诱导的主要结果编号精子对照受精率°/。雌核发育二倍体相对诱导率(°/)获得雌核发育二倍体鱼苗数(尾)1花鲈670.93002花鲈561.34003花鲈782.85004花鲈430.62005花鲈742.510006花鲈702.510007花鲈68110008花鲈820.81209半滑舌鳎895.6300010半滑舌鳎696.3200011半滑舌鳎590.480权利要求1.一种半滑舌鳎亲鱼人工催产和授精方法，其特征在于他的方法包括(1)亲鱼的选择；(2)催产激素的选择和剂量；(3)人工催产及人工授精；(1).亲鱼的选择方法半滑舌鳎亲鱼为3龄雌鱼和2龄雄鱼，在催产前2-3个月进行控温控光；在此期间，水温按每10天升高0.5-1℃，从17-19℃逐步升高到22-23℃，并维持在此温度；光照时间按每10天延长1小时，由每天8小时逐渐延长到16小时，并维持在16小时；通过观察和手摸检查选择性腺明显隆起、用手轻压性腺上下两侧有明显的充实感且性腺前端有一定的柔软度的雌鱼，用于注射激素进行人工催产；雄性亲鱼要选择轻挤性腺部位，看到精液流出者方可用于催产；(2)、催产激素的选择和剂量半滑舌鳎对几种催产激素较为敏感，如绒毛膜促性腺激素HCG、促黄体素释放激素类似物A2和A3以及地欧酮DOM，其中如下几种激素及其剂量催产效果较好LRH-A2的适宜剂量为雌鱼0.5-2.0μg/kg，雄鱼3-6μg/kg；LRH-A3的适宜剂量为雌鱼0.4-2.0μg/kg，雄鱼2-5μg/kg；HCG+LRH-A3的适宜剂量为雌鱼HCG40-60IU+LRH-A30.4-1.5μg/kg；LRH-A3+DOM的适宜剂量为雌鱼LRH-A30.4-2.0μg/kg+DOM1-2mg/kg；(3).人工催产及人工授精技术内容包括A、激素注射；B、效应时间确定；C、人工挤卵和授精；A、激素注射选好亲鱼后，按催产剂量进行激素注射；注射时用MS-222进行麻醉或直接注射，亲鱼从水中捞起后，迅速用大毛巾包住，以防其受伤；激素溶液的注射量雌鱼不要超过1ml/每尾，雄鱼不要超过0.2ml/每尾，注射部位为侧线上方头部后方的肌肉较厚部分，进针角度不要超过45°，雄鱼注射时不要穿透鱼体；B、效应时间确定激素种类不同，注射后的效应时间也不同，各种激素22-23℃时的效应时间如下LRH-A236-44h；LRH-A335-43h；HCG+LRH-A334-42；LRH-A3+DOM35-43h；C、人工挤卵和授精到达效应时间以后，当雌鱼性腺明显由硬变软，感觉性腺内的卵有明显的流动感时，即进行挤卵和人工授精；用手在性腺上下两侧从后到前轻压性腺部位，将卵挤出，接在烧杯中；采精时，用手挤压雄鱼腹部，挤出的精液用吸管吸到2-5毫升的小瓶中备用；当进行生产性授精时，每条雌鱼产出的卵约100-300毫升，可用2-3条雄鱼的精液约1-2毫升授精；将精卵混合均匀，加入两倍于卵体积的海水，2-3分钟后，再加入5-8倍于卵体积的海水完成受精过程，20min后洗去过多的精液即可转入孵化缸进行孵化；2、一种半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗的诱导和鉴定方法，其特征在于他的方法包括(1)半滑舌鳎卵子人工雌核发育方法；(2)雌核发育鱼苗的鉴定方法；(1)、半滑舌鳎卵子人工雌核发育方法它的技术内容包括A、精子的遗传灭活；B、未受精卵与失活精子的"授精"；C、雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定；D、雌核发育鱼卵染色体加倍冷〗木克温度及处理时间的确定；A.精子的遗传灭活釆用异源的花鲈精子和同源的半滑舌鳎精子刺激半滑舌鳎卵子进行雌核发育；半滑舌鳎精液先用显微镜检查精子活力，当活力达到60%以上者可用于紫外线灭活处理；精子的遗传灭活条件为将100inL半滑舌鳎精液用精子稀释液MPRS稀释10倍，平铺于培养皿中，用90-110roJ/cm2紫外线照射，然后与5-lOmL半滑舌鳎卵"授精"；异源精子为冷冻保存的花鲈精子，从液氮中取出花鲈冷冻精子，在37。C水浴复温解冻后镜检精子活力，活力达到60%以上者用于紫外线灭活处理；将100nL解冻的花鲈精液用lmLMPRS溶液稀释后，平铺于培养皿中，用90-110mJ/cm2紫外线照射，然后与5-10mL半滑舌鳎卵受精，在22-23。C恒温培育；B.未受精卵与失活精子的"授精"经紫外线照射后的4青液200-1000IliL加到10-100毫升半滑舌鳎未受精卵中，将精卵轻轻摇动混匀，随后加入2-10毫升海水，继续混匀后，再加入20-200毫升海水完成"授精"过程，在22-23。C下培育2-6分钟，准备用于染色体加倍处理；C.雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定染色体加倍采用冷休克处理方法，在"授精，，后2,3,4,5,6，7,8min,将卯倒入直径为10-15厘米的小抄网，将盛有雌核发育卵的小抄网浸入3-6。C的海水浴中进行冷休克处理，冷^木克处理时间为20-30min，冷休克处理完毕后将卵移入23。C海水中培养；统计受精率，单倍体率，雌核发育二倍体率；结果表明在授精后4-6min中都能够诱导产生雌核发育二倍体，且以授精后5min的诱导率最高；D.染色体加倍冷休克温度和持续时间的筛选在确定了冷休克起始时间后，需要确定冷休克温度和休克持续时间；将与紫外失活精子"授精，，的卵，分成6个温度梯度2。C,4°C,5°C,6°C,8。C和1(TC,在每个温度梯度分别处理15min,20min,25min，30min,35min,40min;最后统计受精率，单倍体率，雄核发育二倍体率；结果表明在休克温度3°C-6°C，休克时间15min-30min条件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中在4.5-5.5。C处理20-25min的雌核发育诱导率最高；(2)、雌核发育鱼苗的鉴定方法它的技术内容包括A.染色体分析筌定雌核发育鱼苗；B.通过微卫星分子标记鉴定雌核发育鱼苗；C.通过半滑舌鳎雌性特异AFLP标记鉴定雌核发育鱼苗；A.染色体分析鉴定雌核发育鱼苗采用常规染色体制片方法，对半滑舌鳎雌核发育鱼苗进行染色体分析，发现半滑舌鳎雌核发育鱼苗的染色体数为42条，与普通半滑舌鳎鱼染色体数目完全相同；同时我们还发现有些雌核发育鱼苗含有2条巨型WW染色体，这些鱼苗是雌核发育的WW型鱼苗；由此充分证明这些鱼苗为雌核发育二倍体个体；B.用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗采取高盐法提取雌核发育鱼和正常鱼苗基因组DNA，从我们筛选到的半滑舌鳎多态性微卫星引物中，选取微卫星引物Cyse31，其引物序列为Cyse31Nl:GACGGTCAAAAGTGGTGTGA;Cyse31Cl:TTTCCACTGTTCACCTGCTG.然后进行PCR扩增，PCR扩增条件为94。C热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94。C变性30s,56-62。C退火30s,72。C延伸30s，最后在72。C延伸7min;PCR扩增产物在6"/。的聚丙烯酰胺凝月交上进行电泳分离，采用银染法染色；结果表明该引物对在半滑舌鳎普通鱼苗中扩增出具有2个等位基因的杂合子的比例为55.6%，而在25尾雌核发育鱼苗中，有20尾只扩增出l个等位基因，仅有5个个体扩增出2个等位基因，杂合率仅为20%，并且在所有4企测的雌核发育鱼苗中仅出现2个等位基因，由此证明这些鱼苗是雌核发育而来；C.用半滑舌鳎雌性特异AFLP标记鉴定雌核发育鱼苗采用半滑舌鳎雌性特异AFLP标记和遗传性别鉴定的PCR技术进行半滑舌鳎雌核发育鱼苗遗传性别的鉴定；其技术原理为含有W染色体的雌性个体中可以扩增出雌性特异DNA片段，不含W染色体的ZZ雄性个体则没有这种特异DNA片^殳；采用序列为ATTCACTGACCCCTGAGAGC的特异引物Cse382Nl和序列为GTAAACAGCACACACTCAACAA的特异引物Cse382Cl，利用高盐法提取半滑舌鳎雌核发育鱼苗个体DNA作为模板，进行PCR扩增；PCR反应体系为25.Oji1,包括2.5jil10xPCIU爰冲液，l.O)al2.5mMdNTP,2.0ju110pM引物混合液，基因组DNA0.8-1.5ji1,双蒸水16.3-17jul，5U/ja1的Taq酶0.2ju1;PCR扩增条件为95。C预变性5分钟，然后95。C30秒、66。C30秒、72。Cl分钟，35个循环，最后在72。C延伸10分钟，采用1%琼脂糖电泳分析PCR产物；从10尾异精雌核发育半滑舌鳎鱼苗中4佥测到4尾鱼苗含有382bp的雌性特异DNA片段，表明我们获得的半滑舌鳎雌核发育鱼苗中含有40%左右的超雌鱼苗。全文摘要一种半滑舌鳎人工催产和雌核发育二倍体鱼苗的诱导方法，包括亲鱼人工催产、精子的遗传失活、雌核发育二倍体鱼苗的诱导及鉴定方法。本发明首次建立了半滑舌鳎人工催产获得批量化未受精卵的方法，首次建立了采用半滑舌鳎精子和花鲈精子诱导半滑舌鳎卵子雌核发育获得雌核发育二倍体鱼苗的方法，筛选到人工催产有效的激素种类和剂量，筛选到适合半滑舌鳎卵雌核发育的冷休克起始时间、冷休克温度和时间，建立了半滑舌鳎雌核发育鱼苗的鉴定方法。本方法获得半滑舌鳎卵的受精率为60-89％，孵化率为34-79％，雌核发育鱼苗诱导率为0.4-6.3％；本发明具有先进、高效、实用、可靠的特点，在半滑舌鳎苗种繁育、性别控制和全雌育种上具有重大应用价值和广阔的推广应用前景。文档编号A01K61/00GK101185425SQ20071011430公开日2008年5月28日申请日期2007年11月1日优先权日2007年11月1日发明者季相山,廖小林,徐建勇,杨景峰,武鹏飞,田永胜,翟介明,苏鹏志,邵长伟,陈松林申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所