细菌淀粉酶在牛类动物的饲料中的用途的制作方法

专利名称：：细菌淀粉酶在牛类动物的饲料中的用途的制作方法
技术领域：
：现代农业系统中的高产牛(COW)在下述条件下生长，所述条件的特征为非常高的乳产量(奶牛(dairycow))或生长速率(肉用牛(beefcattle))，其后为同样高的能量需求。当增加摄入超过维持水平时，饲料的利用率(utilisation)就会显著下降。部分出于此原因，反刍动物饲料中包括了越来越易于降解的饲料，例如含淀粉原料，如基于谷类的浓缩物和全谷物青贮饲料(wholecerealsilage)。经常在排泄物(faeces)中回收含淀粉材料，这说明这些祠料组分的利用率还可进一步增加。本发明涉及细菌淀粉酶在牛类动物(bovineanimal)，如奶牛和肉用牛的饲料中的用途，特别是用于改进乳产量(milkyield)、增重(weightgain)、表观消化率(apparentdigestibility)、4吏用尼龙袋法(nylonbagmethod)的饲冲+干物质(feedstuffdrymatter)的消失(disappearance)，和/或饲泮牛專争4b率(feedconversion)。本发明还涉及组合物，如包含细菌淀粉酶的饲料添加剂和饲料，以及制备这些纟且合物的方法。相关领域的描述WO03/068256Al描述了用于改进反刍动物营养的淀粉酶饲料补充剂。使用的淀粉酶是由米曲霉(Aspergillusoryzae)产生的真菌淀粉酶。Tricarico等在AnimalScience2005，81:365-374描述了含有a-淀粉酶活性的米曲霉提取物对泌乳的(lactating)荷尔斯坦因(Holstein)奶牛的瘤胃发酵(ruminalfermentation)和乳产生的影响。美国专利号3,250,622公开了特定添加剂的用途，所述添加剂含有蛋白分解酶和淀粉分解酶以及胶酶(gumase)，其与磨碎的麦芽载体密切相关，用于刺激奶牛中乳的产生。没有指定所述酶的来源。Mora-Jaimes等(Agrociencia36(1)(2002),31-39)研究了用淀粉酶处理的喂食羊羔的高粱谷物的性能和瘤胃发酵。Rojo等(AnimalFeedScienceandTechnology,123-124(2005),655-665)研究了来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和黑曲霉(Aspergillusniger)的夕卜源淀粉酶对瘤胃淀粉消化和羊羔性能的影响。WO01/41795Al涉及蛋白酶和季氨羧酸内盐的组合在球虫病(coccidiosis)和细菌感染的治疗和/或预防中的用途。而且还要求保护通常的动物增重的改进。可以包括木聚糖酶和/或淀粉酶。提到了来自枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的a-淀粉酶。虽然也提到了反刍动物，然而所有实例都涉及肉用子鸡(broilerchick)。本发明的目的是提供可替代的、优选改进的淀粉酶，其可以通过改进饲料利用率、乳产量和/或增重而减轻上述问题。此外，或者可选地，本发明的淀粉酶可以具有改进的性质，如剂量响应曲线(dose-responseprofile),pH曲线、粒化稳定性(pelleting-stability)、温度稳定性、胆汁盐(bile-salt)稳定性、蛋白酶稳定性，和/或比活性。此外，或者可选地，本发明的淀粉酶能够降解瘤胃(rumen)、大肠和/或小肠中的淀粉。发明简述本发明涉及至少一种细菌淀粉酶在牛亚科动物(animalofthesubfamilyBovinae)的饲料中的用途，特别是用于改进乳产量、增重、饲料消化率和/或饲料转化率(FCR)。本发明还涉及至少一种细菌淀粉酶在组合物制备中的用途，所述组合物用于牛亚科动物的飼料中。此外，本发明涉及祠料添加剂组合物，其包含至少一种细菌淀粉酶，连同至少一种选自维生素和/或矿物质的额外组分。最后，本发明涉及组合物，其包含至少一种细菌淀粉酶，连同至少一种选自干草(hay)、草料(forage)、粗饲料(roughage)和/或饲料浓缩物(feedconcentrate)的额外组分。这种组合物的实例是飼料浓缩物和全混合日粮(totalmixedration)(TMR)。5发明详述在本上下文中，淀粉酶是催化淀粉和其它直链和支链寡糖和多糖的内-水解的酶。在具体的实施方案中，根据本发明使用的淀粉酶具有a-淀粉酶活性，即，催化寡糖和多糖中1，4-a-糖苷键的内水解。a-淀粉酶以随机方式作用于，例如淀粉、糖原和相关的多糖和寡糖，释放a-构型中的还原基团。在优选的实施方案中，本发明的淀粉酶是a-淀粉酶(系统名称1,4-a-D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。在其它实施方案中，本发明的淀粉酶属于淀粉酶的EC3.2.1组，如EC3.2.1.1(a-淀粉酶)、EC3.2.1.2(|3-淀粉酶)、EC3.2.1.3(葡聚糖l,4-a-葡糖苷酶、淀粉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶)、EC3丄U0(a-葡糖苷酶)、EC3.2.1.60(葡聚糖1,4画a-麦芽四糖水解酶(glucan1，4-a-maltotetraohydrolase))、EC3.2.1.68(异淀粉酶)、EC3.2.1.98(葡聚糖1,4-a-麦芽己糖酶)或EC3.2,1.133(葡聚糖1,4-a-麦芽糖水解酶)。在优选实施方案中，根据本发明使用的淀粉酶可分类为(或者分类为)属于EC3.2.1.1组。EC号是指来自NC-IUBMB的EnzymeNomenclature(酶命名法)1992,AcademicPress,SanDiego,California,其包4舌分另'J在Eur.J.Biochem.1994,223，1-5;Eur.J.Biochem.1995，232，1-6;Eur.J.Biochem.1996,237，1-5;Eur.J.Biochem.1997，250，1-6;andEur.J.Biochem.1999,264，610-650出版的补遗l-5。命名法定期地补充和更新，参见例如在http:〃www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html的万维网。可以用任何合适的试验确定淀粉酶活性。通常，pH试验和温度试验可以适用于所述的酶。pH值试'睑的实例为pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。温度试验的实例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、卯或95。C。优选的pH值和温度在生理范围内，如3、4、5、6、7或8的pH值，和30、35、37或40。C的温度。优选的试验方法是本文实施例5中的KNU(S)法。另一个优选的试验方法是本文实施例6中的还原糖法。可选地，可以使用下述淀粉酶试验方法底物Phadebas片剂(PharmaciaDiagnostics;交耳关的不溶性蓝色淀粉聚合物，其与牛血清白蛋白和緩沖物质混合，并制成片剂)。试验温度37°C。试验pH:4.3(或7.0，如果期望的话)。反应时间20分钟。在悬浮于水中后，用a-淀粉酶水解淀粉，得到可溶的蓝色片段。在620nm测定所得的蓝色溶液的吸光度，其是a-淀粉酶活性的函数。一个真菌a-淀粉酶单位(lFAU)是在标准的试验条件下每小时分解5.26g淀粉的酶量。优选的淀粉是Merck,Amylum可溶的Erg.B.6,批号9947275。对试验更详细的描述，APTSMYQI-3207，可应要求从NovozymesA/S，Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd,Denmark获得。在具体的实施方案中，明确定义了淀粉酶，所述淀粉酶以加入到饲料中的形式存在，或者以包括于饲料添加剂中的形式存在。明确定义指，淀粉酶制备物为蛋白质基础上的至少50%纯度。在另外的具体实施方案中，淀粉酶制备物为至少60、70、80、85、88、90、92、94或者至少95%纯。可以通过本领域已知的任何方法，例如通过SDS-PAGE,或者通过大小排阻色谱(参见WO01/58275的实施例12)来确定纯度。定义明确的淀粉酶制备物具有优势。例如，要剂量正确地(dosecorrectly)将淀粉酶加入祠料就容易得多，所述淀粉酶基本不含干扰或者污染的其它酶。术语剂量正确地具体指目的是获得一致而恒定的结果，和获得根据期望的效果优化剂量的能力。具有这种数量级的纯度的淀粉酶制备物可以使用重组的产生方法获得，但是它们不那么容易获得，而且当用传统的发酵方法产生时，各批次之间的差别要高得多。本发明的淀粉酶的分离、纯化和浓缩可以通过常规方法进行。例如，可以通过常规步骤从发酵液中回收淀粉酶，所述常规步骤包括，但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，并通过本领域已知的各种方法进一步纯化，所述方法包括，但不限于色谱(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE，或提取(参见，例如，ProteinPurification,J,C.Janson和LarsRyden编，VCHPublishers,NewYork,1989)。可如本领域已知的将纯化的淀粉酶配制成适用于动物饲料和/或动物饲料添加剂的液体或固体产品。根据本发明使用的细菌淀粉酶以有效量包括于牛饮食或牛饲料添加剂中。现在期望的是，有效量低于1000mg酶蛋白每kg饮食干物质(ppm)，优选低于800、600、500、400，或低于300ppm。在优选的实施方案中，淀粉酶的剂量低于200mg酶蛋白每kg饮食干物质，优选低于150、100、90、80、70、60或低于50ppm。在甚至更优选的实施方案中，淀粉酶的剂量低于40、35、30、25或低于20ppm。在最优选的实施方案中，淀粉酶的剂量低于15、12、10、9、8或低于7mg酶蛋白每kg饮食干物质。另一方面，有效量可以高于0.01mg酶蛋白每kg饮食干物质，优选高于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.75、1、2、3或高于4mg酶蛋白每kg饮食干物质(ppm)。因此，优选剂量范围的非限定性实例为0.10-50mg酶蛋白/kg，优选0.50-10、1-9、2-8、3-8，或4-7mg酶蛋白/kg。优选剂量范围的其它实例(均以ppm表示)为1-35、1-30、2-25、3-20和4画15。为了确定每kg伺料的淀粉酶蛋白mg数，从饲料组合物纯化淀粉酶，使用期望的淀粉酶方法确定纯化后的淀粉酶的比活性。也可以使用相同的方法同样地确定饲料组合物的淀粉酶活性，根据这两个确定结果，计算以mg淀粉酶蛋白每kg饲料表示的剂量。将同样的规则应用于确定饲料添加剂中的淀粉酶蛋白mg数。当然，如果样品使用了用于制备添加剂或饲料的淀粉酶，可以由此样品确定比活性(不需要从飼料组合物或添加剂中纯化淀粉酶)。为了对细菌进行分类学上的分类和鉴定，必须参照Bergey'sManualofSystematicBacteriology(1986)，vol2,ISBN0-683-0783。可供选择地，可以使用为人所熟知的16SrRNA序列分析(参见例如Johansen等，Int.J.Syst.Bacteriol,1999,49,1231-1240，特别是1233页第二栏的方法部分)；或者可以咨询分类学专家，例如，来自DSMZ或其它公认的保藏机构的分类学专家。如在本文中使用的，术语细菌指示了淀粉酶源自细菌。术语"源自"包括可以获得或者获得自野生型的细菌菌抹，以及它们的变体的酶。变体可以具有至少一个氨基酸残基的至少一个取代、插入和/或缺失。术语变体还包括重排体(shufflant)、杂合体(hybrid)、嵌合酶和共有酶(consensusenzyme)。可以用本领域已知的任何方法产生变体，所述方法如定点突变、随机突变、共有衍生方法(consensusderivationprocess)(EP897985)和基因重才非(WO95/22625，WO96/00343)等。就本目的而言，当使用至少一种细菌淀粉酶进行变体的设计、衍生或制备时，淀粉酶变体可以称为(qualifyas)细菌的。术语细菌的指的不是可能的重组产生宿主，而只是指淀粉酶编码基因的宿主起源。根据本发明使用的淀粉酶优选源自芽孢杆菌属(Bacillus)的菌抹，如解淀粉芽孑包杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、环状芽孑包4干菌(Bacilluscirculans)、Bacillushalmapalus、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、芽孢杆菌属的菌种(Bacillussp.)、嗜热脂肪芽孢杆菌8(Bacillusstearothermophilus)和枯草芽孑包杆菌(Bacillussubtilis);优选来自解淀粉芽孢杆菌、Bacillushalmapalus、地衣芽孢杆菌、芽孢杆菌属的菌种和嗜热脂肪芽孢杆菌的菌林；更优选来自解淀粉芽孢杆菌、Bacillushalmapalus、芽孢杆菌属的菌种和嗜热脂肪芽孢杆菌；甚至更优选来自解淀粉芽孢杆菌、Bacillushalmapalus、芽孢杆菌属的菌种和嗜热脂肪芽孢杆菌；最优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌。根据本发明使用的淀粉酶的非限定性实例是源自下述的那些地衣芽孢杆菌，如Swissprot入口名(entryname)AMY—BACLI，初级登录号P06278;解淀粉芽孢杆菌，如Swissprot入口名AMY—BACAM，初级登录号P00692;巨大芽孢杆菌，如Swissprot入口名AMY—BACME，初级登录号P20845;环状芽孢杆菌，如Swissprot入口名AMY—BACCI，初级登录号P08137;嗜热脂肪芽孢杆菌，如Swissprot入口名AMY—BACST,初级登录号P06279。另一个实例源自枯草芽孢杆菌，如Swissprot入口名AMY—BACSU,初级登录号P00691。就本发明而言，优选的淀粉酶是下述商业产品中包含的淀粉酶BAN、Stainzyme、TermamylSC、Natalase和Duramyl(全部来自Novozymes)。根据本发明使用的更特定的淀粉酶实例是包含于商业的ValidaseBAA和ValidaseHT产品中(来自ValleyResearch)的淀粉酶。根据本发明使用的淀粉酶的更进一步的具体实例是包含于下述商业产品中的淀粉酶Clarase、DexLo、GC262SP、G-ZymeG990、G-ZymeG995、G-ZymeG997、G-ZymeG998、HTAA、Optimax7525、PurastarOxAm、PurastarST、SpezymeAA、SpezymeAlpha、SpezymeBBA、SpezymeDeltaAA、SpezymeDBA、SpezymeEthyl、SpezymeFred(GC521)、SpezymeHPA、SpezymeExtra和Ultraphlow(全部来自Genencor);ValidaseHT340L、ValleyThin340L(全部来自ValleyResearch);Avizyme1500、Dextro300L、Kleistase、Maltazyme、Maxamyl、Thermozyme、Thermatex、StarzymeHT120L、StarzymeSuperConc，禾口Ultraphlo。本发明还涉及淀粉酶在牛亚科动物饲料中的用途，所述淀粉酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸1-481具有至少65%同一性的氨基酸序列；这种淀粉酶在制备组合物中的用途，所述组合物用于牛亚科动物的铜料9中；饲料添加剂组合物，其包含这种淀粉酶，以及选自维生素和/或矿物质的至少一种额夕卜组分(additionalingredient);和组合物(例如饲料组合物)，其包含这种淀粉酶以及选自干草、草料、粗饲料和/或饲料浓缩物的至少一种额外组分。优选地，在饲料中的用途是(i)改进乳产量、增重和/或飼料转化率(FeedConversionRatio);(ii)改进乳产量、表观消化率和/或使用尼龙袋法的饲料干物质的消失；(iii)与纤维素酶组合。(iii)的用途可以是(iv):改进乳产量和/或背脂厚度(backfatthickness)。优选地，饲料添加剂包含纤维素酶。更优选地，饲料添加剂是预混物(premix)，如矿物质预混物、维生素预混物，或包括维生素及矿物质的预混物。饲料组合物优选还包含纤维素酶。饲料组合物可以是富含淀粉酶的浓缩物(concentrate),富含淀粉酶的全混合日4泉，和/或可以包含玉蜀黍(maize)和/或高粱，优选玉蜀黍。本发明还涉及制备组合物的方法，所述组合物用于牛亚科动物的饲料中，所述方法包括向至少一种饲料成分中加入淀粉酶的步骤，所述淀粉酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少65%同一性的氨基酸序列。优选地，所述方法还包括加入纤维素酶。本发明还涉及增加牛亚科动物的乳产量的方法，所述方法包括向动物饲料中加入淀粉酶的步骤，所述淀粉酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少65%同一性的氨基酸序列。优选地，所述方法还包括向动物飼料中加入纤维素酶。本发明还涉及增加牛亚科动物的背脂厚度的方法，所述方法包括向动物飼料中加入淀粉酶与纤维素酶组合的步骤，所述淀粉酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少65%同一性的氨基酸序列。本发明还涉及改进表观消化率、使用尼龙袋法的饲料干物质的消失，增加增重和/或改进牛亚科动物的饲料转化率的方法，所述方法包括向饲料或饲料添加剂中加入淀粉酶的步骤，所述淀粉酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少65%同一性的氨基酸序列。将本发明的氨基S交序列("发明序列"；例如，SEQIDNO:2的氨基酸1-481)和不同的氨基S臾序列("外源序列，，)之间的同一性程度计算为两个序列比对中完全匹配的数目，除以"发明序列"的长度或"外源序列，，的长度中最短的。将结果用百分比同一性表示。作为实例，下面是SEQIDNO:2的氨基酸1-481("发明序列")与SEQIDNO:4("外源序列")的比对的部分SEG2,1-4811AAPFNGTMMGYFEWYIjPDDGTIjWTKVANEANNrjSSrjG工TAIjWIjPPAYKG49....IMIIIIIIIIIMI..I.::.::I:II...IM:I:IIMISE(241HHNGTNGTMMGYFEWYIjPNDGNHWNRIjRSDASNIjKDKGISAVWIPPAWKG50当"发明序列"和"外源序列"在重叠的相同位置具有同样的氨基酸残基时，即发生了完全匹配(在比对实例中，完全匹配的氨基酸残基下面用T表示)。实例中完全匹配的数目是28。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如，具有SEQIDNO:2的氨基酸1-481的序列的长度是481)。在实例中，发明序列的长度是49，而外源序列的长度是50。在实例中，重叠是上面序列的氨基酸序列"AAPF—AYKG";或者下面序列的氨基S吏序列"HNGT…AWKG"。在这个实例中没有缺口(缺口用"-"表示)。因此，上述实例中表示的两个部分序列的同一性为(28(完全匹配)/49(最短序列的长度》x100%=57.14%。因此，在具体的实施方案中，通过下述方法确定多肽的氨基酸序列与(或对于)SEQIDNO:2的氨基酸1至481的同一性的百分比i)使用具有BLOSUM62取代矩阵，缺口开放罚分为10，而缺口延伸罚分为0.5的Needle程序比对两个氨基酸序列；ii)计数比对中完全匹配的数目；iii)将完全匹配的数目除以两个氨基酸序列中最短者的长度，和iv)将iii)中除法的结果转化成百分比。在优选的实施方案中，淀粉酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸l-481有至少66、67、68或者至少69%同一性的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，淀粉酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少70、75、80或者至少85%同一性的氨基酸序列。在进一步优选的实施方案中，淀粉酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少90、92、95、97或者至少99%同一性的氨基酸序列。在可供选择的实施方案中，淀粉酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸1-481有至少60、61、62、63或者至少64%同一性的氨基酸序列。在下文中，与SEQIDNO:2的氨基酸1-481具有特定的°/。同一性(例如，至少65%同一性)的淀粉酶称为同源淀粉酶(homologousamylase)。同源淀粉酶的非限定性实例是源自解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶，如Swissprot入口名AMY—BACAM，初级登录号P00692(SEQIDNO:7),和以商品名BAN由NovozymesA/S销售的商业淀粉酶；源自地衣芽孢杆菌的淀粉酶，如Swissprot入口名AMY—BACLI，初级登录号P06278(SEQIDNO:8)，和以商品名DURAMYL由NovozymesA/S销售的商业淀粉酶；源自芽孢杆菌属菌种的淀粉酶，如以商品名STAINZYME由NovozymesA/S销售的商业淀粉酶；源自Bacillushalmapalus的淀粉酶，如以商品名NATALASE由NovozymesA/S销售的商业淀粉酶；和源自嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶，如Swissprot入口名AMY—BACST,初级登录号P06279(SEQIDNO:9)，和以商品名TERMAMYLSC由NovozymesA/S销售的商业淀粉酶。同源淀粉酶的其它非限定性实例是具有、包含或者由SEQIDNO:2的氨基酸1-481、1-484、1-486或者1-513组成的淀粉酶(其中"1"指成熟多肽的起始氨基酸，Ala,参见序列表)；具有、包含或者由SEQIDNO:4的氨基酸1-483组成的淀粉酶；具有、包含或者由SEQIDNO:5的氨基酸1-483组成的淀粉酶；具有、包含或者由SEQIDNO:6的氨基酸1-481组成的淀粉酶(其中"1"指成熟多肽的起始氨基酸，Val，参见序列表)；具有、包含或者由SEQIDNO:7的氨基酸1-483组成的淀粉酶(其中"1"指成熟多肽的起始氨基酸，Val，参见序列表)；具有、包含或者由SEQIDNO:8的氨基酸1-483组成的淀粉酶(其中'T，指成熟多肽的起始氨基酸，Ala,参见序列表)；和具有、包含或者由SEQIDNO:9的氨基酸1-515组成的淀4分酶(其中"1"指成熟多肽的起始氨基酸，Ala,参见序列表)；以及保持淀粉酶活性的任何上述淀粉酶的片段或变体。片段是从氨基和/或羧基末端缺失一个或几个(more)氨基酸的多肽。优选地，片段包含至少450个氨基酸残基，更优选至少460个氨基酸残基，甚至更优选至少470个氨基酸残基，和最优选至少480个氨基酸残基。其它优选的片段包含至少481、483、484或至少513个氨基酸残基。SEQIDNO:2的淀粉酶具有酶活性的片段的实例是具有其中的氨基酸1-481、1-484和1-486的序列。变体可以是包含保守取代、缺失和/或插入一个或几个氨基酸的保守型变体，例如不显著影响蛋白质折叠和/或活性的小插入或取代；通常为l至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端曱硫氨酸残基;多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的'J、延伸，如多组氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或结合域。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和曱石克氨酸)。本发明的淀粉酶的保守型变体的非限定性实例包括小的氨基末端插入(延伸)，例如1或2个氨基酸残基，如Ala,或Ala-Ala。可供选择地，变体可以并入氨基酸改变，所述改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。在任何上述氨基酸序列中氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是最多40、38、36、35、32、30、25、20或15个。优选地，取代、缺失和/或插入的总数是最多10,优选9,更优选8，更优选7，更优选最多6，更优选最多5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，和甚至最优选l。在具体的实施方案中，根据本发明使用的淀粉酶是制粒稳定的(pelletingstable)和/或热裙定的。酶的解链温度(meltingtemprature)(Tm)是其热稳定性的量度。本发明的淀粉酶可以具有至少75。C、76。C、77。C、78°C、79。C、80。C、81。C、82。C、83。C、84。C、85。C、86。C、870C、88。C、89。C、90。C、91。C、92°C、93°C、94。C或者至少95°C的Tm，如通过差示扫描量热法(DSC)所确定的。在10mM磷酸钠、50mM氯化钠緩冲液，pH7.0中进行DSC。扫描速率恒定，例如1.5。C/min。扫描间隔可为20至100。C。可以选择另一种緩冲液用于扫描，例如pH5.0、5.5、6.0或pH6.5的緩冲液。在进一步可选的实施方案中，可以使用更高或更低的扫描速率，例如较低的扫描速率1.4。C/min、1.3。C/min、1.2。C/min、1.1。C/min、1.0。C/min或者0.9。C/min。在另一个优选的实施方案中，根据本发明使用的淀粉酶在pH7.0和37。C具有相对于最适pH和37。C时的活性至少35%的活性。更优选地，在pH7.0和37。C的活性是最适pH和37。C时活性的至少40、45、50、55、60、65、70或至少75%(参见实施例6的表6)。在另一个优选的实施方案中，本发明的淀粉酶在pH7.0和37。C和存在5mM胆汁盐时具有相对于最适pH和37。C、不存在胆汁盐时的活性至少25%的活性。更优选地，在pH7.0和37。C、存在5mM胆汁盐时的活性是最适pH和37。C、不存在胆汁盐时活性的至少30、35、40、45、50、55、60或者至少65%(参见实施例6的表7)。在进一步优选的实施方案中，本发明的淀粉酶在pH7.0和37。C时的比活性是相对于淀粉酶TERMAMYLSC在pH5.0和37。C时的比活性的至少10%，更优选至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65，或者至少70%(参见实施例6的表8)。在另一个优选的实施方案中，本发明的淀粉酶在pH7.0和37。C,存在5mM胆汁盐时的比活性是相对于淀粉酶TERMAMYLSC在pH5.0和37°C，存在5mM胆汁盐时的比活性的至少10%,更优选至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70，或者至少75%(参见实施例6的表9)。可以使用还原糖法合适地确定上述优选实施方案中提及的活性，例如，如实施例6中所述，使用优选的蜡质玉米(waxycorn)作为底物。实施例6中描述了详细的步骤。在另一个具体的实施方案中，根据本发明使用的淀粉酶在存在蛋白酶时是稳定的。蛋白酶的实例是消化蛋白酶，和饲料蛋白酶如在例如WO01/58275、WO01/58276、WO2004/111220、2004/111221、WO2004/072221和WO2005/035747中描述的蛋白酶。消化蛋白酶的实例是胰酶(pancreatin)和胃蛋白酶(pepsin)。可以通过下述方法确定蛋白酶稳定性在期望的pH(例如pH3、4或5)在緩沖液中将0.5mg/ml纯化的淀粉酶蛋白质在存在蛋白酶(例如胃蛋白酶，70mg/l)时温育期望的时间(例如30、45、60、90或120分钟)，然后将pH提高至期望的pH(例如pH4、5、6或7)，并使用例如本文实施例6的还原糖法测定残余活性。残余的淀粉酶活性优选为相对于对照(未用蛋白酶处理的才羊品)的至少20%,优选至少30、40、50、60、70、80或至少90%。本发明的淀粉酶可以与纤维素酶组合使用。术语"与......组合"具体包括下述情况两种酶都有活性，并且同时或者在时间上有重叠地发挥它们的作用，优选同时发挥作用，但也可包括酶逐个作用。在本上下文中，纤维素酶是催化纤维素、地衣淀粉(lichenin)和谷类卩-D-葡聚糖中1,4-P-D-葡糖苷键的内水解的酶。其它名称是，例如，内切-1，4-卩-0-葡聚糖酶、|3-1，4-葡聚糖酶；和(3-1，4-内切葡聚糖水解酶。系统名称是1,4-(l,3;l,4)-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。在优选的实施方案中，本发明的纤维素酶分类(或可分类)为EC3.2.1.4(酶命名法1992，见上文)。可以用任何适当的方法确定纤维素酶活性。通常地，试验-pH和试验-温度可以适合于所研究的酶。试验-pH值的实例是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。试验-温度的实例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95。C。优选的pH值和温度是在生理范围内，如pH值为3、4、5、6、7，或8，和温度为30、35、37，或40。C。优选的纤维素酶源自木霉属(Trichoderma)的菌抹，优选里氏木霉(Trichodermareseei)，更优选CELLUCLAST纤维素酶(或其纤维素酶组分)，其商业上可从NovozymesA/S获得。纤维素酶组分的实例是纤维二糖水解酶I和II(CBHI、CBHII)，以及内切葡聚糖酶I和II(EGI、EGII)。术语"源自，，的意思如上面(淀粉酶部分)所述，且包括野生型纤维素酶，以及其变体和片段。在本上下文中，牛亚^f动物(也称作牛类(bovines)，或牛类动物(bovineanimals))指动对勿界(kingdomofAnimalia)、脊索动4勿门(phylumofChordata)、哺乳动物纟冈(classofMammalia)、4禺^帝动物目(theorderofArtiodactyla)和牛考牛(familyofBovidae)的动物。生物学的亚科包括约24种中型到大型的有蹄动物(ungulate)，包括家牛(domesticanimal)、野牛(Bison)、水牛(WaterBuffalo),牦牛(Yak)和四角与螺^走角的/令羊(four-hornedandspiral-hornedantelope)。一4殳特性包4舌偶3帝(cloven-hoof)和通常有真正的角的物种的至少一个性征(sex)。优选的属包括四角羚属(Tetracerus)、蓝牛属(Boselaphus)、水牛属(Bubalus)、牛属(Bos)、中南大羚属(Pseudoryx)、非洲野牛属(Syncerus)、美洲野牛属(Bison)、薮羚属(Tmgelaphus)和大羚羊属(Taurotragus)。最优选的属是牛属，其中包括下述种欧洲野牛(Bosprimigenius(原牛)，灭绝))、白臀野牛(Banteng)(爪哇野牛(Bosjavanicus))、白肢野牛(Gaur)(大额牛(Bosfrontalis)),牦牛(野牦牛(Bosmutus))、家牛(普通牛(Bostaurus)、瘤牛(Bosindicas)(今天经常当作原牛)，和林牛(Fouprey)(柬埔寨野牛(Bossauveli))。就本目的而言，家牛是最优选的种。就本目的而言，术语包括所有种类的家牛，和所有生产类型的牛，特别是奶牛和肉用牛。牛类l良刍动物,其特征在于与单胃动物相比具有额外的发酵能力。例如，牛和羊在皱胃(abomasum)前有三个前胃(fore-stomach)。功能上最重要的是瘤胃，其作为飼料储存和发酵室。通过大量而复杂的厌氧微生物(细菌、原生动物(protozoa)和真菌)进行发酵过程。这些能够降解除了蛋白质和淀粉之外的细胞壁物质，因此使反刍动物吞咽饲料材料并其中受益，所述飼料材料不会在皱胃或小肠中降解。这包括例如干草、其它草料和富含细胞壁物质的青贮。瘤胃中发酵的产物是短链脂肪酸(SCFA)，其作为反刍动物中的初级能量来源，和气体，如曱烷和二氧化碳。因此在体外瘤胃系统中，经常用产生气体的体积作为对给定饲料的可发酵性的量度，将体外产生气体增加作为改进的饲料降解和增加的能源可用性的量度。大多数体外系统包括使用新鲜采样的瘤胃流体，通常采自羊(sheep)或牛(cow)。最佳的乳生产需要充足的能量摄入，并且因此优选奶牛良好的饲料利用。对于获得肉用牛的最佳增重同样如此。期望的是，根据本发明使用的淀粉酶改进食用淀粉在瘤胃中的降解，特别是降解緩慢的淀粉(如玉蜀黍淀粉，其未进行热处理和/或包含大颗粒，或马铃薯淀粉)，由此向瘤胃微生物及反当动物本身贡献更多的能量(以短链脂肪酸的形式)。还期望的是，根据本发明使用的淀粉酶促进旁路淀粉(即通过瘤胃而到达小肠的淀粉)在小肠中的降解，和/或增加葡萄糖的吸收，从而通过最小化大肠中的微生物降解和在排泄物中排出淀粉来利用(salvage)能量。期望的是，观察到的淀粉降解的改进将向牛提供更多的能量，从而增加乳产量或增重。在本发明的细菌淀粉酶的用途的具体实施方案中，参考本文的实施例2，平均气体产生量(GP)为至少0.9ml,其使用本文实施例1的修正HFT方法并使用TMR作为底物。无论淀粉酶的剂量如何，优选在最优剂量，使用同样的16方法确定。在优选的实施方案中，平均气体产生量(如上述所确定)为至少1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或至少3,5ml。如可从实施例2中所见的，真菌淀粉酶导致充分低于(wellbelow)0.9ml的气体产生量。这意味着真菌淀粉酶显然不会使淀粉在瘤胃中消失。这个观察结果得到了Tricarico等(AnimalScience2005，81:365-374)的证实，他们观察到在泌乳奶牛中同样有这种情况，并在瘤胃中插入导管引导补加AMAIZE的饲津牛(andruminallycannulatedsteersthefeedofwhichwassupplementedwithAMAIZE)(参见摘要)。观察到的本发明细菌淀粉酶引起的气体产生量增加实际可以理解为淀粉降解的改进，可从实施例4中见到。因此，在具体的实施方案中，参照实施例4,使用本文实施例1的修正HFT方法以TMR作为底物并培育4小时，与没有外源淀粉酶的对照相比较，根据本发明使用的细菌淀粉酶能减少残余淀粉的量。可以如实施例4中所述确定残余淀粉。在另一个具体的实施方案中，根据本发明使用的细菌淀粉酶至少部分地降解已经存在于牛类动物瘤胃中的淀粉。上面提及的至少0.9ml平均气体产生量可以理解为存在于底物中的淀粉至少5%的降解。因此，根据本发明使用的细菌淀粉酶优选降解底物(或饮食，或饲料组合物)中至少5%(w/w)的淀粉，更优选至少6、7、8、9、10、11、12、13、14或者至少15%的淀粉，后面的百分比对应于1.8ml的平均气体产生量。在其它优选的实施方案中，淀粉酶降解至少20、22、24、26、28或者至少30%的淀粉。优选的底物是TMR,例如，如实施例1中所述。就本目的而言，改进的乳产量指下述之一:(i)每日乳产生量增加的体积(1/天)；(ii)每日乳产生量增加的重量(kg/天)；(iii)每日产生的kg乳相对于以kg表示的干物质摄入的增加的比例(kg乳/kgDMI);(iv)每日产生的乳脂肪的增加的重量(kg/天)；(v)每日产生的乳蛋白质的增加的重量(kg/天)；(vi)每日3.5%脂肪修正的乳(fatcorrectedmilk)的增加的产生量(kg/天)；和/或(vii)每日乳固体增加的产生量，其中术语"乳固体，，包括乳糖、脂肪、蛋白质和乳糖的总量。增加的乳产量还可以表示为(viii)每日产生的乳糖的增加的重量(kg/天)，或者(ix)每日增加的4。/。脂肪修正的乳(kg/天)，例如，计算如下(0.4xkg乳产量)+(15xkg乳脂肪)。当下述情况时可以获得增加的乳产量，例如，乳的干物质含量增加(例如更多的脂肪或蛋白质)而无伴随的体积增加，体积增加而无干物质的增加，和体积以及乳的干物质含量都增加。在具体的实施方案中，参照本文实施例7，(a)相对于未添加淀粉酶的对照，每日乳产生量(kg/天)增加至少1%,优选2、3、4、5、6、7、8或至少9%;(b)相对于未添加淀粉酶的对照，每日乳产生量(kg/天)相对于干物质摄入量(DMI)(kg/天)的比例(kg乳/kgDMI)改进至少1%，优选至少2、3或者至少4%;(c)相对于未加淀粉酶的对照，每日产生的乳脂肪的重量(kg/天)改进至少1%,优选至少2、3、4、5、6、7或者至少8%;(d)相对于未加淀粉酶的对照，每日产生的乳蛋白质的重量(kg/天)改进至少1%，优选至少2、3、4、5、6、7、8或者至少9%;(e)相对于未加淀粉酶的对照，每日3.5%(或者4%)脂肪修正的乳产生量(kg/天)改进至少1%，优选至少2、3、4、5、6、7、8或者至少9%;和/或(f)相对于未加淀粉酶的对照，3.5%(或者4。/。)脂肪修正的乳产生量(kg/天)4是高至少1%，优选至少2、3、4或者至少5%。实施方案(a)-(f)优选指如下面FCR段落中所述的牛试验(cow-trial)。饲料转化率(FCR)说明如何有效地利用饲料。FCR越低，饲料利用得越好。可以根据牛试验确定FCR，所述试验包括第一处理，其中将根据本发明使用的淀粉酶以期望浓度(例如，6或30mg酶蛋白质每kg祠料，优选每kg铜料干物质(DM))加入动物祠料，和未向动物饲料中加入淀粉酶的第二处理(对照)，每个处理由四头或七头牛(优选奶牛)组成，牛在畜舍(bam)(优选具有散养畜栏(freestall))中圈养，配备Calan门(Calangate)用于测定个体的铜料摄入，用TMR饮食饲养牛，其中优选包含SO。/。浓缩物(主要由玉米粉(cornmeal)、并且小麦4分(wheatmiddling)、含可〉容物的干酒糟(distiller，sdriedgrainwithsolubles)和大豆粉(SBM)组成)、37%玉米青贮、7%苜蓿半干青贮(alfalfahaylage)和6%苜蓿干草，将FCR计算为相对于以kg每天每只牛(可选地，对于增重为kg每只牛)表示的乳产量(或者可选地，增重)的以kg/牛(优选kgDM/牛)表示的进行期望时间的试验(例如第一、第二、第三或第四个21天时间，或者全部84天时间)的飼料摄入，相对于第二处理的FCR，第一处理的FCR得到改进。为了解详情，参见实施例7。在具体的实施方案中，同对照相比，FCR改进(即，减少)至少1.0%,优选至少1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%或者至少2.5%。在进一步具体的实施方案中，同对照相比，FCR改进(即减少)至少2.6%、2.7%、2.8%、2.9%或者至少3.0%。在更进一步的具体实施方案中，同对照相比，FCR改进(即减少)至少3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%或者至少3.8%。可供选择地，改进是相对于对照组而言，对照组4妻受剂量为240DU/kgTMR干物质的AMAIZE淀粉酶。改进的增重指相对于未加淀粉酶的对照，改进的每日、每周、每两周或每月的增重(用g或kg每个相对时间段表示)。这优选在如上面FCR段落中所述的试验中确定。在具体的实施方案中，本发明的淀粉酶改进饲料的表观消化率(例如，与未加淀粉酶的对照相比)。特别地，本发明的淀粉酶可以改进干物质消化率、中性洗涤剂纤维消化率和/或有机物消化率。此外，本发明的淀粉酶可以改进淀粉消化率和/或粗蛋白质消化率。例如，本发明的淀粉酶将(i)干物质消化率改进至少1%,更优选至少2、3、4、5、6、7、8或者至少9%;(ii)中性洗涤剂纤维消化率改进至少2%,更优选至少4、5、10或者至少20%，甚至更优选至少25、30或者至少35%;(iii)有机物消化率改进至少1%，更优选至少2、3或者至少4%，甚至更优选至少5、6或者至少7%;(iv)淀粉消化率改进至少1%,更优选至少2%;和/或(v)粗蛋白质消化率改进至少1%,更优选至少2、3、4、5或者至少6%。可以根据牛试验确定如上概述的表观消化率，所述试验包括第一处理，其中将根据本发明使用的淀粉酶以期望浓度(例如，6或30mg酶蛋白质每kg饲料)加入动物飼料，和未向动物铜料中加入淀粉酶的第二处理(对照)，每个处理由六头牛，例如公牛或母牛，优选奶牛组成，牛在畜舍(优选具有散养畜栏)中圈养，配备Calan门用于测定个体的飼料摄入，用TMR饮食饲养牛，其中优选包含50。/。浓缩物(主要由玉米粉、粗小麦粉、含可溶物的干酒糟和大豆粉(SBM)组成)、37%玉米青贮、7%苜蓿半干青贮和6%苜蓿干草，用对应于阶段4(四个21天时间)的最后一周中的平均每天摄入的量再饲养8天，从第5天至第8天通过直肠触诊(rectalpalpation),每8小时(优选每天取样点间隔增加1小时)收集排泄物定时采集样本(grabsample)(约300g),直至每头牛收集到总共12个样本，取TMR的样本(来自每组)和每天的祠料残渣(ort)(对每头牛)，将所有的排泄物、TMR和饲料残渣样本汇集到一起(分别针对每头牛)，在60。C强迫通风烘箱中干燥48小时，碾磨样本通过l-mm筛子，分析干物质(DM)、酸性洗涤剂纤维(ADF)和中性洗涤剂纤维(NDF)，例如，如Goering,H.K.，VanSoest，RJ.,1970在AgricultureHandbookNo.379中所述，分析样本的氮(N)(例如，使用ElementorVarioMaxCNAnalyzer),和灰分含量(在马弗炉(mufflefurnace)中600°C5小时)，使用不可消化的NDF作为标记，计算总消化道的表观消化率。优选地，在使用Daisy-II温育箱(AnkomTechnology,Macedon,NY，US)体外瘤胃培育120小时后，确定不可消化的NDF(Goering和VanSoest，1970),瘤胃流体来自用对照饮食饲养的牛。更多细节参见实施例8和表11。在另一个具体的实施方案中，本发明的淀粉酶可以改进粗纤维、粗蛋白质、有机物和/或粗脂肪的总消化道表观消化率〖例如，与未加淀粉酶的对照相比较)。例如，本发明的淀粉酶可以改进下述的表观消化率(i)将粗纤维的表观消化率改进至少1%，更优选至少2，或者至少3%;(ii)将粗蛋白的表观消化率改进至少1%;(iii)将有机物的表观消化率改进至少1%,更优选至少2或至少3%;和/或(iv)将粗脂肪的表观消化率改进至少1%，更优选至少2、3、4或者至少5%。可以根据体内牛研究确定总消化道表观消化率，所述研究使用三头未泌乳的牛(GermanHolstein),和两个处理，即加入50mg酶蛋白质(EP)每kg干物质(DM),和未加酶的对照。向每日日粮(例如，由44%玉米青贮、18%草青贮、9%干草和29%基于玉米的浓缩物组成的TMR)中加入酶。优选在连接有空调的畜舍(20。C)中在橡胶垫上安置牛，单独饲养，可自由取水。实验可以持续2个阶段，每阶段25天(共50天)；在每个阶段中，前14天用于适应，而后11天用于采样。每头牛优选每天在100h和l&00h喂5.5kg(DM)TMR,并在早晨喂食后2小时喂0.5kg(DM)干草。此外，优选施用100g/d矿物质预混物。从第22天至第25天，在8:30通过直肠触诊对每头牛收集排泄物定时采集样本(约200g)。可将Ti02用作标记以计算总消化道的表观消化率。如本领域通常的情况，可通过在105。C干燥直至无进一步的重量损失(通常为24小时)来确定DM。要了解更多详细内容，参见实施例9和表16。说明书第18/38页在进一步的实施方案中，本发明的淀粉酶改进在尼龙袋中培育过程中飼料中干物质(DM)的消失,例如从下述祠料中消失，如玉米粒(corngrain)、大麦、玉米青贮和/或TMR。例如，在培育时间2小时后，玉米粒、大麦、玉米青贝i和TMR中DM消失分别为至少1%(优选至少5、10、15、20、25、30或者至少35%)、至少1%(优选至少2、4、6、8或者至少10%)、至少1%(优选至少2或者至少3%),和至少1%(优选至少2或者至少3%)。作为另一个实例，在培育时间4小时后，玉米粒、大麦、玉米青贮和TMR中DM消失分别为至少1%(优选至少5、10、15、20、25或者至少26%)、至少1%(优选至少2、4或者至少6%)、至少1%(优选至少2或者至少3%),和至少1%(优选至少2或者至少3%)。作为进一步的实例，在培育时间8小时后，玉米粒和大麦中DM消失分别为至少1%(优选至少5、10、15、20、25、30或者至少33%)，至少1%(优选至少2%)。可以在上述体内试验(在总消化道表观消化率的情况)中，使用为人所熟知的尼龙袋技术确定伺料干物质的消失，所述尼龙袋技术可以参考实施例9，并在实施例9中详细描述。要获得更进一步的详细内容，参见实施例9和表12-15。在进一步的实施方案中，本发明的淀粉酶与纤维素酶组合(i)改进乳产量(kg/d)，优选在泌乳早期(earlylactationstage)(例如，在分娩后第1天至14天)，更优选不改变乳组成；和/或(ii)改进背脂厚度，优选在分娩后140天或140天之后。可以使用两组，在体内饲养试验中在9个月内确定乳产量和背脂厚度，其中每组由例如220头奶牛(GermanHolstein)组成。优选将奶牛安置在具有条缝地板(slottedfloor)的小(cubical)畜舍中。实验阶段优选包括分娩前的三周和分娩后的20周。用全混合日粮(TMR)飼养牛(优选一天八次)，所述TMR未补加酶(对照)，或者补加了合适剂量的酶(例如对应于25mg酶蛋白质(EP)/kgTMR干物质(DM)的淀粉酶，和1.4ml/kgTMR纤维素酶，或者与淀粉酶相似的量(EP/kg))。可以在喂食前立即将酶喷洒在TMR上。TMR的主要组分是玉米青贮、草青贮和浓缩物(可以在农场上混合)，而且干物质含量可为约50%。优选每天在旋转式挤奶间(milkingparlour)中对牛挤3次奶。定期在试验中评估个体乳产量和组成，以及背脂厚度。要获得更详细的内容，参见实施例10和图1和2。就本目的而言，认为术语飼养(feed)和喂养(fodder)同义。关于牛类如牛的21飼料组成，以及其组分，牛类饮食通常由易降解的部分(称作浓缩物)和富含纤维较不容易降解的部分(称作干草、草料或粗饲料)组成。干草由干燥的草、豆类或全谷类组成。草其中包括梯牧草属(timothy)、黑麦草属(ryegrass)、羊茅属(fescue)。豆类其中包括三叶草(dover)、紫花苜蓿(luceme)或苜蓿、豌豆(pea)、豆(bean)和野豌豆属(vetch)。全谷类其中包括大麦、玉蜀黍、燕麦、高粱。全谷类的其它实例是小麦和黑麦。就本目的而言，认为术语玉蜀黍和玉米同义。其它饲料作物(foragecrop)包括甘蔗(sugarcane)、习习衣甘蓝(kale)、油菜(rape)和甘蓝(cabbage)。块才艮作物(rootcrop),如完菁(turnip)、蕉青甘蓝(swede)、饲用甜菜(mangel)、饲料甜菜(fodderbeet)和糖用甜菜(sugarbeet)(包括糖用甜菜浆和甜菜糖蜜)也用来饲养反刍动物。更进一步的作物是块茎，如马铃薯、木薯和甘薯。青贮是富含纤维部分(例如来自草、豆类或全谷类，全植物或其部分，例如玉蜀黍)的窖存形式(ensiledversion),用受控的厌氧发酵方法(天然发酵或添加剂处理)处理具有高含水量的物质。浓缩物主要由谷类(如包括啤酒麦芽糟(brewer，sgmin)和酒糟的大麦、玉蜀黍、小麦、高粱、燕麦和/或黑麦)，但是也经常包含富含蛋白质的饲料组分，如大豆(优选大豆粉)、油菜籽、棕榈仁、棉籽和向日葵。还可以用全混合日粮(TMR)饲养牛，其中将所有的饮食组分，例如草料、青贮浓缩物和预混物(例如矿物质、维生素)在提供之前混合。参照实施例3，在具体的实施方案中，本发明的祠料组合物包括TMR、浓缩物、玉蜀黍、大麦、黑麦、小麦、燕麦和/或马铃薯。在优选的实施方案中，饲料组合物包含玉蜀黍和高粱中的至少一种(或者包括玉蜀黍和/或高粱)，最优选玉蜀黍。术语如"玉蜀黍"、"大麦"、"马铃薯"等，包括全植物或其部分，以及各种源自其中的制备物和物质，其中包括叶、花、茎(stalk)、根、果实、核(kernel)、谷粒、粗粉和淀粉。此外，这些植物部分可按原样(以天然形式)使用，干燥、压碎、浸泡，或者作为青贮(非限定性列表)。在进一步特定的实施方案中，本发明的饲料组合物是富含淀粉酶的浓缩物或者富含淀粉酶的全混合日粮(TMR)，其中淀粉酶是根据本发明使用的细菌淀粉酶，如上文所述。可将浓缩物制粒，并且在制粒前或制粒后加入淀粉酶。浓缩物还可以是醪浓缩物(mash-concentrate)。此外，可将根据本发明使用的淀粉酶添加至任何其它饲料组分或组合物，例如混合的，或者作为表面饰料(top-dressing),或者可将其包括在饲料添加剂中，例如通过如下所述的预混物。除了如上所述根据本发明使用的淀粉酶之外，本发明的饲料添加剂组合物包含选自维生素和矿物质的至少一种额外组分。例如，本发明的伺料添加剂可以包括(i)至少一种维生素，(ii)至少一种矿物质，或者(iii)至少一种维生素和至少一种矿物质。至少一种维生素可以是脂溶性或者水溶性。脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱(choline)、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸(panthothenate)，例如D-泛酸钧。至少一种矿物质可以是常量(macro)矿物质和/或痕量矿物质。痕量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。常量矿物质的实例是钙、磷和钠。预混物是本领域中公认的术语用于某些飼料添加剂。它们可以是固体或液体的。矿物质预混物是意欲向动物饲料添加的组合物,且其包含期望种类和量的矿物质，特别是痕量矿物质。维生素预混物是意;&欠向动物饲料添加的组合物，其包含期望种类和量的维生素。一些预混物包括维生素和矿物质。本文实施例12中包括了用于牛的这种组合的预混物的实例。本发明还涉及要求保护的用途、方法和组合物，其中本发明的细菌淀粉酶与下述组合使用(i)用于反刍动物的其它酶，如蛋白酶、肌醇六磷酸酶、细胞壁降解酶，如木聚糖酶、纤维素酶，和/或内切葡聚糖酶；(ii)瘤胃素(Rumensin)(莫能菌酸钠(monensinsodium));和/或(iii)泰乐菌素(Tylan)(泰乐菌素(tylosin))。本发明进一步通过如下实施例描述，不应将所述实施例看作为对本发明范围的限制。实施例用作緩冲剂和底物的化学物质是至少试剂级的商业产品。实施例1:修正的HohenheimForage值测试(HFT)HohenheimForage值测试(HFT)由Menke等(1979),J.Agric.Sci.Camb.93:217-222:"当在体外用瘤胃液体培育反刍动物飼料时，根据气体产生量估计反刍动物饲料的消化率和可代谢的能量含量(Theestimationofthedigestibilityandmetabolizableenergycontentofruminantfeedingstuffsfromthegas23productionwhentheyareincubatedwithrumenliquorinvitro)"，由Steingass,H.(1983):"BestimmungdesenergetischenFutterwertesvonwirtschaftseigenenFuttermittelnausderGasbildungbeiderPansensaftfermentationinvitro"，HohenheimUniversi您，Fak.Agrarwiss.Dissertation,和由Steingass等，于Tieremahmng14;pp251-270(1986):"SchatzungdesenergetischenFutterwertesausderinvitromitPansensaftbestimmtenGasbildungundderchemischenAnalyse.1.UntersuchungenzurMethodeijbers"描述。它的目的主要是才艮据气体产生量估计用于乳产生时铜料中用于泌乳的净能量。这个测试的本修正版本用于测试瘤胃体外系统中外源酶的效果。简言之，在玻璃注射器中将饲料底物与瘤胃液体和适当的緩冲液混合物的组合物一起称重。用紧密配合但可移动的活塞将玻璃注射器封闭，使产生的气体的体积增加。将注射器在39。C温育4小时。测定产生气体的量并用于转换公式中(参见实施例2中的公式)。试剂大量元素溶液(masselementsolution):6.2g磷酸二氢钾(KH2P04)0.6g七水合硫酸镁(MgS04*7H20)9ml浓磷酸(lmol/1)溶于蒸馏水中，加至1L(pH约1.6)緩冲溶液35.0g碳酸氢钠(NaHC03)4.0g碳酸氢铵((丽4)恥03)溶于蒸馏水中，加至lL。痕量元素溶液13.2g二水合氯化钧(CaCl2*2H20)10.0g四水合氯化锰(II)(MnCl2*4H20)1,0g六水合氯化钴(II)(CoCl2*6H20)8.0g氯化铁(III)(FeCl3*6H20)溶于蒸馏水中，加至100ml钠盐溶液100mg钠盐溶于蒸馏水中，加至100ml还原〉容液先将3ml氢氧化钠(c-lmol/l)，然后将427.5mg水合硫化钠(Na2S*H20)加入71.25mlH20中。在将溶液加至培养基溶液之前不久(shortlybefore)制备溶液酶缓冲液10.88g三水合乙酸钠(CH3COONa*3H20)5.88g二水合氯化钓(CaCl2*2H20)0.1gBSA(牛血清白蛋白)溶于蒸馏水中，加至21，用乙酸调节至p1^5.8设备注射器(玻璃注射器，100ml,1/1用毛细管基底表示刻度(gmduatedwkhcapillarybase》硅试管(用于每个注射器，约50mm)，将其拖至(pullover)毛细管底部并用夹子(clamp)封闭用于65个注射器的带有能量单元的转子，约1转每分钟具有通风设备的培养箱(精度+O.S。C，内部最小尺寸70cm*70cm"Ocm)精密天平或分析天平抽吸泵(例如手动的、适用于摩托车的气泵)，用于去除瘤胃中的物质，回流阀(returnvalve)、洗涤瓶(washingflask)具有塞子的进料瓶(2L)，用于收集瘤胃液体装有工艺(technical)二氧化碳、具有减压阀的气瓶注满瘤胃液体的设备，其由半自动吸液管(50ml)、Woulff瓶(2L)、磁力搅拌器、具有循环泵的恒温器和PVC盆(bowl)(10L)组成越底物底物(饲料)是全混合日粮，其由44%标准浓缩物(商业上可从theUniversityofHohenheim,InstitutftirTierernShrung获得)、6%标准干草(商业上可从theUniversityofHohenheim,InstitutfUrTierernahrung获得)、37%玉蜀泰青贮和13%草青贮，均在65。C干燥(两种青贮都来自Village-Neuf，St.LouisCedex,France的农场)。用实验室用压榨机将所有组分碾碎通过1.5mm筛子，然后混合形成TMR。样品称重将干物质含量为400mg的饲料准确称重至36个注射器的每个注射器中。这些注射器中的15个是底物对照，显示没有酶作用时的气体产生量。其余21个注射器用于酶样品(7个注射器用于1个酶样品)。然后向注射器插入先用凡士林涂抹的活塞。也对其它28个注射器进行这种处理，这28个注射器包含具有瘤胃液体的24ml培养基溶液，但是没有任何底物样品。7个注射器的气体产生量代表仅来自瘤胃液体的气体产生量的平均值。其余21个注射器是不加任何底物的酶对照。当用凡士林涂抹活塞时，注射器的摩擦阻力降低。此外，注射器是防水而且气密的。在充满瘤胃液体之前，所有注射器都保留于39。C培养箱中。钠溶液的制备以下述顺序将组分在Woulff瓶中混合711ml水0.18ml痕量元素溶液355.5ml緩冲溶液355.5ml大量元素溶液将成品溶液(completedsolution)加温至39。C(水浴或具有恒温器的PVC盒)，并通过;兹力搅拌器保持均一。首先，加入1.83ml钠盐溶液。始终通过浸没的软管(submergedhose)向培养基溶液中熏(fiimigate)C02。在36°C,加入全部还原溶液。指示剂从蓝色变成红色，再变成无色。当指示剂变成无色时加入瘤胃液体。首先用浸没的软管将C02通气继续15分钟，在注入注射器的过程中，抬升软管使液体保持以C02饱和。瘤胃液体的提取在早晨饲喂测试动物(主要是安置瘘管的(fistulated)羊，有时是牛)之前，将瘤胃液体提取至预热的2l进料瓶中，将进料瓶用作收集容器。使用松散编织的亚麻袋过滤瘤胃流体，轻柔地转移至保温瓶中，并在运送至实验室过程中小心地阻止进入空气。在持续搅拌和通入C02的情况下，向约1400ml培养基溶液加入750ml瘤胃液体。注入注射器以相对于酶緩冲液的一定比例稀释待测试的酶。将酶加入相应的注射器中准确的0.4ml溶液中，由此使酶溶液必须完全覆盖底物。在将培养基溶液和瘤胃液体的混合物均质化后，用半自动吸液管将24ml置于每个注射器中，之前在培养箱中将注射器加温高至39。C。这代表18ml培养基溶液和6ml瘤胃液体的体积。然后，通过小心振荡去除所有气泡。同时，用这种方式打碎所有飼料块。在盖上夹子后，在活塞的水平面，加入(register)不含任何气体相的准确体积的液体。将注射器直接置于预热培养箱(39。C)的转子中。温育和确定气体体积在温育过程中，注射器必须在转子中保持水平位置。应将传递调至一转每分钟。在温育过程中，培养箱中的温度应该保持在39。C+0.5。C。四个小时后，完成温育。通过仔细读出活塞在校准标度(calibrationscale)的位置来测定气体形成。此外，通过小心地旋转，检查活塞未卡住。通过两个标度线之间的插值，可以达到高达+0.5ml的读数精度。实施例2:体外的淀粉酶测试在实施例1的体外反刍动物模型中，测试了几种细菌淀粉酶，并用于与三种真菌淀粉酶比较。每个实验重复多次("n")。从NovozymesA/S,Krogshoejvej36，2880Bagsvaerd,Denmark获得下述淀粉酶BAN240L、STAINZYME12L、TERMAMYLSCL、NATALASE200L、DURAMYL300LDX和FUNGAMYL800L。从ValleyResearchInc.,3502NorthOliveRoad,SouthBend,IN46628，US获得VALIDASEBAA和VALIDASEFAA淀粉酶。从Alltech(AlltechInternationalHeadquarters,3031CatnipHillPike,Nicholasville，KY40356，US)获得AMAIZE淀粉酶。结果示于下面的表1中，作为平均气体产生量(GP)。与未加外源酶(m1/0/。)的对照相比较，以绝对数值以及以％给出GP。为了修正用于由酶制备物中可用的底物(例如蛋白质和配制物质，如葡萄糖和蔗糖)产生的气体，在HFT系统中温育包含酶和瘤胃流体的酶对照样品，而不是饲料底物。如下计算酶对饲料底物(Delta-G)的作用，基本上按照Wallace等在J.Anim.Sci.2001,79:1905-1916中所建议的:Delta-G=(SE-SC)-(RFE-RFC),其中SE-瘤胃流体、伺料底物和酶，SC-瘤胃流体和飼料底物，RFE-瘤胃流体和酶，和27RFC-瘤胃流体。在表1中，每种淀粉酶的剂量表示为以mg每kg底物表示的粗蛋白(CP),和以mg每kg底物表示的酶蛋白(EP)。用燃烧法测量粗蛋白(CP),其中大体上C02、H20、NOx和N2通过不同拙袭"；+':老梦苕土u^翁夕々kAA^"古《/f太缺^rffii丸旦':A.7!i:Jr教汰中';piil音教为此根据制造商的说明使用LECOFP-528氮分析仪。将粗蛋白计算为氮(N)乘以因子625，即粗蛋白(g/kg)二N(g/kg)x6.25。还可以用凯氏定氮法(Kjeldahlmethod)(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis第14版,AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)确定氮含量。根据所研究酶的酶活性和比活性确定酶蛋白(EP),参照实施例5的a-淀粉酶方法。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>DURAMYL300LDX地衣芽孢杆菌1863160043,7/14.5VALIDASEBAA枯草芽孢杆菌1000-41.9/6.2VALIDASEHT枯草芽孢杆菌1000-42.3/7.5真菌淀粉酶FUNGAMYL800L米曲霉81467020/0VALIDASEFAA米曲霉1000-20.2/0.7VALIDASEFAA米曲霉10000-20/0VALIDASEFAA米曲霉100000-20/0AMAIZE米曲霉472-20.1/0.2AMAIZE米曲霉945-20.1/0.4AMAIZE米曲霉1889-40.1/0,3AMAIZE米曲霉10000-0/0AMAIZE米曲霉126349-10/0表1的结果清楚地显示，细菌淀粉酶的性能好于真菌淀粉酶，后者通常产生非常少量的气体。在这个模型中还显示出清晰的剂量响应作用(dose-responseeffect),参见例如STAINZYME12L和DURAMYL300LDX气体产生量相对于淀粉酶活性的数据。对于TERMAMYLSCL和NATALASE200L淀粉酶，也可以看到清晰的剂量响应作用，但是仅存在于剂量范围的较低端一在非常高的剂量观察到气体产生量变水平(levelout)或者甚至有轻微的下降。不希望受到任何理论的限制，这可以归因于商业酶制剂中包括的配制物化学品过量。如上所述，测试具有下述氨基酸序列的纯化的淀粉酶SEQIDNO:2的氨基酸1-486，SEQIDNO:4的1-483,SEQIDNO:5的1-483，SEQIDNO:6的1-481，和SEQIDNO:7的1-483,得到了相同的结果。实施例3:对各种淀粉底物的体外活性在实施例1的体外模型中测试实施例2中所述的淀粉酶中的四种，但是使用一定范围的不同的含淀粉底物代替TMR底物，即，使用浓缩物(标准浓缩物，商业可由theUniversityofHohenheim，InstitutflirTierernahrung获得)、玉米粉、玉米青贮(如实施例1中所述制备)、大麦粉、黑麦粉、小麦粉、燕麦粉(詞料级)和马铃薯淀粉(食品级)。结果示于下面的表2中。在每一部分，三种首先提及的淀粉酶是细菌淀粉酶，而后面提及的淀粉酶是真菌淀粉酶。在实施例2中更详细地描述了这些淀粉酶，其中还描述了如何计算酶蛋白质剂量(CP、EP)和平均GP。类7z扒、一酶酶剂量每kg底物平均GPmg蛋白质(CP)mg酶蛋白(EP)n(%)TMRSTAINZYME12L3108114911.2TERMAMYLSCL10002751011.2DURAMYL300LDX18631600414.5AMAIZE1889-40,3浓缩物STAINZYME12L3108114925.3TERMAMYLSCL-一--DURAMYL300LDX1863160027.3AMAIZE1889-20玉米粉STAINZYME12L3108114935.9TERMAMYLSCL1000275273.6DURAMYL300LDX1863160031.8AMAIZE1889-0.4玉米青贮STAINZYME12L31081149228.8TERMAMYLSCL----DURAMYL300LDX18631600224.0AMAIZE1889-20大麦粉STAINZYME12L3108114929.1TERMAMYLSCL1000275116.2DURAMYL300LDX----AMAIZE1889-10黑麦粉STAINZYME12L3108114928.8TERMAMYLSCL100027525.9DURAMYL300LDX----AMAIZE1000-22.130<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表2的结果表明细菌淀粉酶对所有底物都有作用，而对玉米青贮和玉米粉的作用最显著。TERMAMYLSC淀粉酶看起来是对所有底物最有效的细菌淀粉酶。如上所述，测试具有SEQIDNO:2的氨基酸1-486、SEQIDNO:4的1-483,和SEQIDNO:6的1-481的氨基酸序列的纯化的淀粉酶，得到相同的结果。真菌淀粉酶对所有底物的作用通常是小的。实施例4:体外淀粉降解使用实施例1中所述的体外瘤胃系统，通过与没有外源淀粉酶的对照样品比较，确定细菌淀粉酶TERMAMYLSCL在4小时体外瘤胃培养中降解的淀粉量。底物是TMR,酶剂量为lOOOmg粗蛋白每kg饲料。通过加入99.9%乙醇至终浓度为80%乙醇，终止HFT反应并沉淀淀粉。离心样品(2500xg,4°C，lOin.)并弃去上清。为了将残余的淀粉定量，再次用80%乙醇沉淀样品，并在离心后向残余物中加入乙酸緩冲液(pH5)，然后在40。C温育15分钟，接着加入200微升Termamyl300LDX(NovozymesA/S)并继续在90。C以上温育30分钟。随后，将温度降低至60。C,加入500微升Amyloglucosidase(淀粉葡萄糖苦酶)(320U/ml;MegazymeInternational),并将样品温育16小时。使用GOPOD试剂将得到的葡萄糖定量，所述试剂是使用葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的比色试剂盒，可由MEGAZYMEInternational获得。如表4中所示，与同样温育4小时的对照样品相比，细菌淀粉酶降低了残余淀粉量。由淀粉酶降解的淀粉量是18.7mg/管，相当于对照样品中残余淀粉的30%。如上所述测试了具有SEQIDNO:2的氨基酸1-486的氨基酸序列的纯化的淀粉酶，得到了相同的结果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>重复上述实验，但是用真菌AMAIZE淀粉酶替换细菌淀粉酶。如表5中所示，与同样温育4小时的对照样品相比，真菌淀粉酶不能够减少残余淀粉。这与这种淀粉酶在HFT中产生非常少量的气体是一致的(参见实施例2)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>实施例5:a-淀粉酶活性使用商业上可由RocheDiagnostics获得的目录号为11876473的AMYK-试剂盒测定a-淀粉酶活性。底物是4，6-亚乙基(G》-对-硝基苯基(G,)-a,D-麦芽庚并唐香(4,6-ethylidene(G7)-p-nitrophenyl(G,)-a,D-maltoheptaoside)(亚乙基-G7PNP)。a-淀粉酶分裂(splitoff)亚乙基-Gn，然后由酶a-葡糖苦酶(试剂盒的部分)在形成葡萄糖和黄色对-硝基酚的情况下，将得到的Gn-p-硝基苯基切割。在405nm,例i口用Konelab30Analyzer(商业上可由ThermoElectronCorporation获得)，例如使用2分钟的测定时间观察形成对-硝基酚的速率(其为反应速率的量度，从而也是a-淀粉酶活性的量度)。反应条件是温度37。C,pH:7.15，反应时间5分钟。优选使用含有Brij0.0025%(SigmaB4184)的氯化4丐0.03M作为稳定剂。可以相对于标准给出a-淀粉酶活性，例如以KNU(S)的单位表示，其按照相对于公知KNU(S)活性的a-淀粉酶标准物确定。更详细的方法描述(EB-SM-02^.(n)以及KNU(S)TERMAMYLSC标准物可从NovozymesA/S，Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd应要求获得。实施例6:淀粉酶pH曲线，具有和没有胆汁盐这个实验用于确定三种a-淀粉酶在加入和未加入胆汁盐时的pH曲线，所述淀粉酶为两种本发明的细菌淀粉酶和现有技术的真菌米曲霉淀粉酶。使用的淀粉酶是纯化的芽孢杆菌属淀粉酶(TERMAMYLSC和STAINZYME)，和，用于比较的，纯化的米曲霉淀粉酶(来自FUNGAMYL)。这些酶制剂全部在商业上可由NovozymesA/S，Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd,Denmark获得。还原糖法酶緩沖液50mM乙酸盐、50mM咪唑、50mM丙二酸、lmMCaCl2、0.01%TritonX-100。用HCl/NaOH调节至pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0或7.0。底物缓冲液1.5mg/ml支链淀粉(蜡质玉米，例如来自Cerestar的蜡质玉米04201，批号WM5671),50mM乙酸盐，50mM口米峻，50mM丙二酸，1mMCaCl2。用HCl/NaOH调至理想pH(如上)。在100。C温育5分钟。加入或者不力口5mM胆汁盐(即商业上可由例如LGCpromochem获得的牛磺胆酸钠(Sodiumtaurocholate),500g/mol)来制备底物緩沖液。用还原糖法检测淀粉酶活性。简而言之，在PCR-MTP(Thermo-Fast96，ABgene,目录号AB-0600)中将50fil酶(在酶緩冲液中稀释，使其落入方法的线性范围内)与lOO(il底物緩冲液混合。将MTP，s在37。C温育15分钟，然后加入75(J终止溶液(100mM对-羟基苯甲酸酰阱(p-hydroxybenzoicacidhydrazide)，180mM酒石酸钾钠，2%NaOH),将板在95。C温育10分钟。然后从每个孔中转移150jil至96孔MTP,监测410nm处的吸光度作为淀粉酶活性的量度。结果(两次测定的平均值)示于下面的表6-9中。表6显示在没有胆汁盐时，在所示pH的每种酶的活性。对于每种酶，最大活性设为100%。表7显示的与表6相同，但其为存在5mM胆汁盐的情况。表8表示在没有胆汁盐时在所示pH，相对于这个实验中测定的最大酶活性，每种酶每mg酶蛋白的活性，所述最大酶活性为TERMAMYLSC酶在pH5.0的活性(100%)。因此，相对于这个活性，将每种酶的活性归一化(normalize)。根据比活性确定每种酶的酶蛋白的量。表9显示的与表8相同，但其为存在5mM胆汁盐的情况。在这里，在存在5mM胆汁盐时TERMAMYLSC酶在pH5.0时的活性是参照值(100%)。表6:无胆汁盐时的相对活性<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>这些结果显示，尽管胆汁盐似乎轻微地p争低了淀粉酶活性，但是在存在5mM胆汁盐时，活性仍然令人满意。结果还显示，胆汁盐不会导致最适pH的改变。结果还显示，本发明的每种芽孢杆菌属淀粉酶在pH7时都具有高于50%的相对活性，对于比较的真菌淀粉酶则并非如此。最后，表8和9表明，至少在这些条件下，来自TERMAMYLSC的淀粉酶具有比其它两种测试的淀粉酶明显更高的活性每mg酶。实施例7:在奶牛中的体内试验一乳产量用28头奶牛(Holstein)进行了体内试验，所述奶牛在具有散养畜栏的配备Calan门的畜舍中圏养(AmericanCalan，Northwood,NH),用于测定个体的伺料摄入量。允许奶牛用三周时间适应上述的门。然后根据预试验的乳产量将奶牛分群，并随机指定进行四种处理中的一种。以4x4^立丁方(Latinsquare)设计进行研究。在四个21天阶段里测试四种处理，并在每个阶段的后7天收集数据。以两个剂量(低剂量=6mg酶蛋白(EP)每kg全混合日粮(TMR)干物质(DM);高剂量=30mgEP/kgTMR干物质)测试细菌TERMAMYLSC淀粉酶(商业上可由NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd，Denmark获得)，与未加外源淀粉酶的对照相比较，并与包含真菌淀粉酶的产品AMAIZE(AllTechInc.,Nicholasville，Kentucky,US)比较。AMAIZE的剂量(240DU/kgTMR干物质)基于已公开的试验(Tricarico等，AnimalScience2005，81:365-374)，所述试验显示这是三组测试(240、480和720DU/kgTMR干物质)中最有效的剂量。饮食由TMR组成，所述TMR中包含50%浓缩物、37%玉米青贮、7%苜蓿半干青贮草，和6%苜蓿干草。浓缩物主要由玉米粉、粗小麦粉、含可溶物的干酒糟和大豆粉(SBM)组成。每天随意(adlibitum)喂奶牛一次TMR，并且每天测量个体的饲料拒食情况(feedrefusal)。奶牛每天挤两次奶，并通过计算机自动记录乳产量。在每个阶段的第19天和第21天，每天取两次乳样品。用近红外分析(DairyOneLaboratories,UniversityPark,PA,US)分析乳样品的蛋白质和乳脂肪。如下计算脂肪^f务正的乳(FCM):FCM3.5%=[(0.434xkg乳产量)+(16.216xkg乳脂肪)]。作为实例，对于30kg乳产量和5。/。脂肪/kg的泽西种乳牛(Jerseycow)，FCM3.5%是(0.434x30)+(16.216x1.5)=37.34。使用SAS(1999)的MIXED程序分析所有数据，公认的显著性为P<0.05。用最小二乘法确定不同处理之间的差异。以测定的不同参数的平均值的形式表示的结果示于表10中，并且也显示了均值的标准误差(SEM)值。表10性能参数对照细菌淀粉酶真菌淀SEM低剂量高剂量粉酶千物质摄入量(DMI)(kg/天)27.0b28.1a'b29.0a28.5a0.45乳(kg/天)43.2b47.1a44.2b45.2ab0.74享L/DMI(kg乳/kgDMI)1.601.681.521.59-乳脂肪(％)2.982.993.093.080,07乳脂肪(kg/天)1.28b1.39a1.35ab1.40a0.0435<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>各行中上标不同的平均值是统计学上有差异的(p<0.05)如表10中所示，低剂量的细菌淀粉酶显著改进乳产量(kg/天)以及FCM/DMI,报道的最适剂量的真菌淀粉酶则相反。乳脂肪(kg/天)、乳蛋白质(kg/天)，以及3.5。/o脂肪修正的乳(FCMkg/天)都由真菌淀粉酶以及低剂量的细菌淀粉酶显著改进。实施例8,奶牛的体内试验一飼料表观消化率在实施例7中所述体内试验的阶段4结束(conclusion)时，每组中产量最高的六头牛继续食用它们的实验饮食。使用阶段4最后一周的数据确定平均每曰摄入量，用同样的每日量再喂牛8天。从第5天到第8天，每8小时(每天取样点的时间间隔增加1小时)通过直肠触诊收集排泄物定时采集样本(300g)，直至每头牛共收集到12个样本。在排泄物收集期间，每天取TMR(从每组)和残渣(从每头牛)。将所有排泄物、TMR和残渣样本(对于每头牛)汇集到一起，并在60。C强迫通风烘箱里干燥48小时。通过l-mm筛子研磨样本，并长口Goering,H.K.，VanSoest，P丄,1970,在Foragefibreanalyses(apparatus,reagents,procedures,andsomeapplications),AgricultureHandbookNo.379,Agric.Res.Serv.,USDA,Washington,DC,USA所述分析干物质(DM)、酸性洗涤剂纤维(ADF)和中性洗涤剂纤维(NDF)。还分析样本的氮(N)(ElementorVarioMaxCNAnalyzer,ElementorAmericasInc.,Mt.Laurel,NJ,US)、淀粉(CumberlandValleyAnalyticalLaboratory),和灰分含量(在马弗炉中600°C5小时)。使用不可消化的NDF作为标记计算总消化道(totaltract)的表观消化率。在使用Daisy-II培养箱(AnkomTechnology,Macedon，NY,US)和用对照饮食饲养的牛的瘤胃流体，体外瘤胃培育(Goering和VanSoest，1970)120小时后确定不可消化的NDF。使用SAS(1999)的MIXED程序分析所有数据，公认的显著性为P0.05。用表ll中的最小二乘法连同均值的标准差(SEM)表示消化率数据。表1136<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>各行中上标不同的平均值是统计学上有差异的(p<0.05)如表11中所示，与对照样品相比，低剂量的细菌淀粉酶显著改进干物质、中性洗涤剂纤维和有机物质的消化率，报道的最适剂量的真菌淀粉酶则相反。对于低剂量的细菌淀粉酶，淀粉和粗蛋白的消化率在数值上也是最高的，但是与对照组相比，差异不是统计学上显著的。实施例9:总消化道消化率一使用尼龙袋技术的飼料的瘤胃降解在本研究中使用的酶是细菌TERMAMYLSC淀粉酶(商业上可由NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd,Denmark获得)。通过尼龙袋法(Flachowsky，G.,M.Schneider,W.I.Ochrimenko,G.H.Richter,和H.-J.L6hnert，MethodischeHinweisezurA而endungderNylonbeutel-TechnikbeimWiederkauer.SchriftenreihederLehrgangseinrichtungfiirFiitterungsberatungJena-Jemderoda1988，11:20-26;Kurtz,H.,和F.J.Schwarz,Insitu-AbbaubarkeitvonRestpflanzenverschiedenerMaishybridenimReifeverlauf.iJbers.TieremShg.2005,33:111-120;Madsen，J,，和T.Hvelplund，Predictionofinsituproteindegradabilityintherumen.ResultsofaEuropeanringtest.ActaAgric.Scand.，1994，Suppl.25:103-124)确定8种不同饲料(玉米粒、大麦(粗大麦粉)、啤酒麦芽糟、干的糖用甜菜果肉(driedsugarbeetpulp)、玉米青贮、草青贮、干草和全混合日粮(TMR))的瘤胃消失。由基于大麦的啤酒生产中的新鲜德国啤酒麦芽糟冷冻干燥啤酒麦芽糟。如下所述使用同样的TMR。研磨饲料以模拟牛的咀嚼，并增加样品均一度。使用3mm筛子研磨玉米粒、大麦和糖用甜菜果肉样品。将干草、TMR和青贮样品先切成较小的块，然后在研磨(5mm筛子)之前冻干(干草除外)。相似地，将啤酒麦芽糟冷冻干燥并用这种方式研磨(5mm筛子)。研究基本由两个处理组成，即加入50mg酶蛋白(EP)每kg干物质(DM)，和无酶的对照。然而每个处理是双重的(two-fold),即，在尼龙袋中和在日粮中。将酶溶于蒸馏水(总体积100ml/kgDM)中，并喷洒在日粮(TMR,其由44%玉米青贮、18%草青贮、9%千草和29%基于玉米的浓缩物组成)上以及要在8个尼龙袋系列中的每个进行测试的饲料上。将同样量的蒸馏水喷洒在对照饲料和对照尼龙袋上。每天向日粮加入酶/水，但是在试验前向尼龙袋中的饲料加入酶/水，并深度冷冻(-20。C)直至使用。将这些饲料(即日粮以及尼龙袋)分配给三头未泌乳的牛(GermanHolstein)，每头在背部瘤胃中装备瘤胃导管，进行两个实验系列，每个系列中每个处理为3头牛，得到不完全的3x3拉丁方设计。实验组接受含酶的曰粮以及含酶的尼龙袋，对照组接受未加入酶的日粮和尼龙袋。对于尼龙袋，在每个处理的三头牛瘤胃中，每次温育时间放置重复的袋(duplicatebags),其中包含5g不同的饲料，跟踪DM的消失多至72小时。保持牛处于有空调的关闭畜舍(20。C)内在橡皮垫上，单独饲养并可以自由取水。实验持续2个阶段，每阶段25天(共50天)；在每个阶段中，用前14天进行适应，后ll天使用尼龙袋取样。每天在7:00h和16:00h喂每头牛5.5kg(DM)TMR,早晨喂食后2小时喂0.5kg(DM)干草。另外施加100g/d的矿物质预混物。从第22天至第25天，在8:30h从每头牛通过直肠触诊收集排泄物定时采集样本(200g)。使用Ti02作为标记以计算总消化道的表观消化率。作为实例，如果你在饲料中使用l%Ti02，饲料DM摄入量为10kg，并在排泄物中发现4%Ti02，这对应于2.5kgDM的排泄物量(按照Ti02质量衡算，入=出)，也就是说，饲料的粗消化率为75%(10中消化7.5kg)。结果示于下面的表12-15中，显示了在温育时间长达8小时后，来自尼龙袋的玉米粒、大麦、玉米青贮和TMR各自的DM-消失(。/。)。如同本领域通常所见，通过在105。C干燥直至无进一步重量损失(通常为24小时)来确定DM。表16显示淀粉酶处理对体内营养物表观消化率(％干物质)的作用。表12(玉米粒)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>各行中上标不同的平均值是统计学上有差异的(p<0.05)表13(大麦)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>如表12-15中所明显表示，在含有较高量淀粉的饲料的温育中，补加淀粉酶改进了DM消失对于玉米粒(淀粉含量71.9。/。)是显著的(p0.05)，对于在最初8小时的温育中大麦(淀粉含量57.6%)和玉米青贮(淀粉含量33.1%)数值上提高，而对于在最初4小时的温育的TMR(淀粉含量33.0%)数值上提高。如可预期的，淀粉酶对不含或者含可忽略量淀粉的四种饲料没有作用，所述饲料即草青贮、干草、糖用甜菜果肉和哞酒麦芽糟(数据未给出)。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>如表16中所明显表示，淀粉酶使TMR中的粗纤维、粗蛋白、有机物和粗脂肪的总消化道(从口到排泄物)表观消化率在数值上增加，但是差异不是在统计学上显著的。不希望受到任何理论的限制，这可以归因于下述机制中的一种或多种淀粉酶影响瘤胃中的微生物群落，其能够影响这些其它(非淀粉)组分的降解；淀粉酶可以提供微生物群落生长的能量，使微生物的数量增加，从而降解其它组分；去除淀粉可以更易于接近其它组分(笼蔽效应(cageeffect))。使用SAS(1999)的MIXED程序分析数据，公认的显著性为P<0.05。用最小二乘法确定不同处理之间的差异。实施例10:奶牛中的体内试验一细菌淀粉酶和纤维素酶在9个月的饲养试验中包括两组(2x220)奶牛(GermanHolstein)，以测试向饲料中加入细菌淀粉酶和纤维素酶组合物的作用。使用的酶是细菌TERMAMYLSC淀粉酶和CELLUCLAST纤维素酶，两者商业上均可由NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd，Denmark获得。CELLUCLAST纤维素酶源自里氏木霉。将牛在具有条缝地板的小畜舍中圈养。实验阶段包括分娩前的三周和分娩后的20周。用全混合日粮(TMR)饲养牛(一天八次)，所述TMR中未补加酶(对照)或者补加淀粉酶(l.6ml/kgTMR，对应于25mg酶蛋白(EP)/kgTMR干物质(DM))和纤维素酶(1.4ml/kgTMR)。在喂养前立即将酶喷洒在TMR上。TMR的主要成分是草青贮、玉米青贮和浓缩物(在农场上混合)，而干物质含量为约50%。将动物分成两组，对照组和处理组。我们试图通过将具有相似的期望性能的个体牛分配到一个组中，来相似地构成两个组。这可以根据下述原则完成初次分娩依据(after)父亲(father)(属于牛的正常饲养程序)预计的乳产量，而多次分娩依据哺乳次数和先前的哺乳量预计的乳产量。每天在旋转式挤奶间中对牛挤3次奶。在试验中定期评价个体的乳产量和组成以及背脂厚度。酶处理对乳产量的影响在图1中显示为处理组和对照组之间乳产量(kg/d)的差异作为分娩后天数的函数。在早期泌乳阶段，组合使用淀粉酶和纤维素酶导致乳产量增加(而乳组成没有任何变化；数据未显示)。从第1天至第14天的差异是显著的，而在泌乳晚期，作用不再显著。两组的背脂厚度在图2中显示为分娩后天数的函数(经过归一化，将分娩前第28天的背脂厚度水平设为100%)。在试验期间，与对照O)相比，酶处理组(o)具有更高水平的背脂厚度，而在分娩后第140天，作用在统计学上是显著的(p二0.02)。实施例11:奶牛的体内试验乳产量、消化率、尼龙袋实验如实施例7-10中所述，在奶牛体内对具有SEQIDNO:2的氨基酸1-486的氨基酸序列的纯化的细菌淀粉酶进行了体内测试。获得了相同的结果。实施例12:飼料添加剂组合物将TERMAMYLSC淀粉酶与每kg具有下述组成的维生素和矿物质预混物(也称作矿物质饲料)混合14%钙、9.5%钠、6%磷、5%镁、800,000IU维生素A、120,000IU维生素D3、3000mg维生素E、130mg维生素Bl、78mg维生素B2、70mg维生素B6、525昭维生素B12、21mg叶酸、260mgD-泛酸钓、2500mg烟酸、130000吗生物素、8500mg锌、4000mg锰、1200mg铜、100mg碘、21mg钴、50mg硒。提到的百分比为w/w。包括的TERMAMYLSC淀粉酶的量对应于1.8g酶蛋白/kg预混物。以每个动物每天100g的速率喂预混物。假定每天的饲料消耗量是30kg(DM)。内，因为这些方面意欲作为本发明几个方面的说明。任何等同的方面意欲在本发明的范围之内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的那些之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也意欲落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。本文引用了多篇参考文献，其公开的内容通过引用整体并入。权利要求1.细菌淀粉酶在牛亚科动物的饲料中的用途。2.权利要求l的用途，用于改进乳产量、体重增加和/或詞料转化率。3.权利要求l的用途，用于改进乳产量、表观消化率，和/或使用尼龙袋法的饲料干物质消失。4.权利要求1的用途，其与纤维素酶组合使用。5.权利要求4的用途，用于改进乳产量和/或背脂厚度。6.细菌淀粉酶在用于牛亚科动物饲料的组合物的制备中的用途。7.制备用于牛亚科动物的饲料中的组合物的方^，所述方法包括向至少一种饲料组分中添加细菌淀粉酶的步骤。8.权利要求7的方法，所述方法还包括添加纤维素酶。9.增加牛亚科动物乳产量的方法，所述方法包括向动物飼料中添加细菌淀粉酶的步骤。10.权利要求9的方法，其还包括向动物饲料中添加纤维素酶。11.增加牛亚科动物的背脂厚度的方法，所述方法包括向动物饲料中添加与纤维素酶组合的细菌淀粉酶的步骤。12.增加牛亚科动物的体重增加和/或饲料转化率的方法，所述方法包括向动物饲料中添加细菌淀粉酶的步骤。13.改进牛亚科动物的飼料干物质的消失和/或表观消化率的方法，所述方法包括向动物饲料中添加细菌淀粉酶的步骤。14.飼料添加剂组合物，其包含细菌淀并分酶，连同选自维生素和矿物质的至少一种额外组分。15.权利要求14的饲料添加剂，其还包含纤维素酶。16.权利要求15的组合物，其为矿物质预混物、维生素预混物，或包括维生素和矿物质的预混物。17.组合物，其包含细菌淀粉酶，以及至少一种选自干草、草料、粗詞料和/或浓缩物的额外的组分。18.权利要求17的组合物，其还包含纤维素酶。19.权利要求17的组合物，其为富含淀粉酶的浓缩物。20.权利要求17的组合物，其为富含淀粉酶的全混合日粮。21.权利要求17-20中任一项的组合物，其包含玉蜀黍和/或高粱。22.权利要求21的组合物，其包含玉蜀黍。全文摘要本发明涉及至少一种细菌淀粉酶在牛亚科反刍动物的饲料中的用途，特别是用于改进乳产量，所喂饮食的表观消化率、饲料干物质的消失、体重增加，和/或饲料转化率(FCR)。牛类动物的实例是奶牛和肉用牛。本发明还涉及这些淀粉酶在饲料和饲料添加剂如预混物、浓缩物和全混合日粮(TMR)中的用途。淀粉酶可以与纤维素酶组合使用，以改进乳产量和/或背脂厚度。优选的淀粉酶源自Bacillushalmapalus、地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌，并且优选与嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶同源。文档编号A23K1/18GK101489412SQ200780026592公开日2009年7月22日申请日期2007年7月12日优先权日2006年7月13日发明者威比·格里特索,沃尔夫冈·斯坦伯格,艾尔姆加德·艾米格,莫滕·费希尔申请人:诺维信公司;DsmIp资产公司