专利名称：：一种拟丽突线虫的培养方法
技术领域：
：本发明涉及生物培养，具体为一种拟丽突线虫的培养方法。
背景技术：
：线虫是土壤中最为丰富的无脊推动物，在土壤生态系统腐屑食物网中占有重要地位。线虫作为食物链中的重要成员广泛存在于土壤中，因其形态特殊性、食物专一性、分离鉴定相对简单，以及对环境的各种变化能做出较迅速的反应等特点，可将线虫作为土壤污染毒理效应研究的模式生物，为环境污染评价提供有价值的信息。拟丽突线虫(Jcra6e/o/cfeswam^)对土壤及水体中重金属污染具有很好的生物指示作用，采用室内培养该种线虫可用于污染环境的生物检测。拟丽突线虫是一种单性生殖的土壤居住的食细菌线虫(Laugsch,M.&Schierenberg,E.Differencesinmaternalsupplyandearlydevelopmentofcloselyrelatednematodespecies.InternationalJournalofDevelopmentalBiology,2004,48:655-662)。拟丽突线虫成虫体长0.5mm左右。在世界不同地区的土壤中，拟丽突线虫是线虫群落的主要组成部分，它占据了大范围的土壤生活环境，占线虫群落的20%左右(DeGoede,R.G.M.&Bongers，T.NematodeCommunitiesofNorthernTemperateGrasslandEcosystems.Focus,Giessen,Germany.1998)。拟丽突线虫以腐生和植物病原细菌为食，通过在土壤中传播细菌和病毒间接作用于有机质分解(Ikonen,E.K.LifehistorystudiesofthehermaphroditenematodeJcroZ>e/o/<iessp.withPsew(i国owas1cepaciaasafoodsourceonagar.Nematology,2001,3:759-766)。拟丽突线虫的培养一般釆用在培养基中加入EscherichiacoliOP50品系细菌菌株，此菌株的培养采用的是LB培养基。但由于EscherichiacoliOP50品系细菌菌株的继代培养和保存较难，而且易染杂菌，同时LB培养基较其他普通的营养基来说，成本较高。因此需要选择成本相对较低且易培养的菌株和培养基来培养拟丽突线虫。
发明内容3本发明的目的在于提供一种拟丽突线虫的培养方法；以大肠杆菌菌株为生长菌，接种培养得到细菌液，细菌液加入到线虫培养基，挑入拟丽突线虫，恒温培养得到纯种线虫。本发明操作简单，成本低廉，容易实施，解决环境污染的生物检测问题。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案如下一种拟丽突线虫的培养方法，将大肠杆菌Eco"菌株接入液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，在36.5~37.5。C下165~175次/分钟摇床振荡培养23~25小时得到细菌液；然后，将细菌液加入到线虫培养基，再挑入消过毒的无菌的拟丽突线虫，置于恒温恒湿培养箱，在湿度50~60%、温度20~30°C条件下培养511天，即可得到所培养的线虫。所述大肠杆菌五.//菌株为普通野生型大肠杆菌，菌株属于革兰氏阴性短杆菌，大小0.5x1~3微米，周身鞭毛，能运动，无芽孢。所述的细菌液是将大肠杆菌菌株用接种环挑取，接入40~60mL液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，每次接种大肠杆菌数量为^107~3><107个，放进具有恒温功能的摇床，调节摇床温度36.537.5。C、摇动次数设置为165~175次/分钟，振荡培养2325小时，得到细菌液。所述的液体牛肉膏蛋白胨培养基按重量计为牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaCl5g、蒸馏水1000mL,最后用2mol/LNaOH调节pH为6.5~7.5。所述的线虫培养基按重量计为3gNaCl、17g琼脂、2.5g蛋白胨，溶于975mL蒸馏水中，120122。C灭菌，29.5-30.5分钟后分别加入5mg/mL胆固醇贮存液1mL、1mol/LCaCl21mL、1mol/LMgS041mL、pH为5.9-6.1的lmol/L磷酸缓冲液25mL，摇动均匀，即得线虫培养基。所述的拟丽突线虫的培养步骤为，取干净的直径为6cm的培养皿，将线虫培养基46mL平铺在培养皿中，静置810小时，用微量移液器按细菌液/培养基为1/50的体积比例，将细菌液80~120pL倒入培养皿，静置3~5分钟，用接种针挑入无菌拟丽突线虫10~20条，均句放置在培养基上，盖上培养皿盖子；然后，将培养皿置于恒温恒湿培养箱，在湿度50~60%、203(TC培养511天，即可得到所培养的线虫。本发明具有如下优点1.本发明拟丽突线虫的室内培养方法，首先对大肠杆菌￡.//的培养，然后对拟丽突线虫进行大量培养，最后是对培养后的线虫进行毒理实验，确定此线虫的生物指示作用。本发明操作简单，成本低廉，容易实施。2.本发明釆用一般的野生型大肠杆菌菌株为生产菌，菌株培养基为普通的牛肉膏蛋白胨培养基。3.本发明中拟丽突线虫本身容易培养，特别是培养时间较短。4.本发明培养得到的拟丽突线虫，可作为环境污染生态毒理诊断的一种有效指示生物，解决环境污染的生物检测问题。具体实施例方式本发明以大肠杆菌E//菌株为生长菌，将大肠杆菌菌株接入液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，在36.537.5'C下165~175次/分钟摇床振荡培养23~25小时得到细菌液；然后，将细菌液加入到线虫培养基，再挑入经无菌消毒的拟丽突线虫，在湿度50~60%、203(TC培养5~11天，即可收获所培养的线虫。具体方法详述如下1)大肠杆菌获取本发明选用普通野生型大肠杆菌，菌株属于革兰氏阴性短杆菌，大小0.5xl3微米，周身鞭毛，能运动，无芽孢。大肠杆菌菌株在一般的微生物菌种实验室即可获取，也可以从巿场上购买到。2)细菌液的获取将步骤1)得到的大肠杆菌菌株用接种环挑取，接入40~60mL液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，每次接种大肠杆菌数量为lxl(T3xl(^个，放进具有恒温功能的摇床，调节摇床温度36.537.5。C、摇动次数设置为165~175次/分钟，振荡培养2325小时，得到细菌液(细菌液中大肠杆菌浓度为lxl()S5xl0S个/mL)。备用。所述的液体牛肉膏蛋白胨培养基按重量计为牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaCl5g、蒸馏水1000mL，最后用2mol/L的NaOH调节pH为6.5~7.5。3)线虫培养基的制备取1000mL实验用三角瓶，加入975mL蒸馏水、3gNaCl、17g琼脂、2.5g蛋白胨，用玻璃棒搅拌均匀，置入灭菌锅内，在120~122。C和常压条件下，灭菌29.5~30.5分钟后，加入5g/L的胆固醇贮存液lmL、lmol/LCaCl2lmL、lmol/LMgS04lmL、pH为5.9—6.1的1mol/L磷酸缓冲液25mL,摇动均勻，即得线虫培养基。4)拟丽突线虫的获取和表面消毒土壤线虫用改进的贝曼漏斗法分离提取，就是把土壤样品放在铺有2层面巾纸或纱布的小筛盘中，然后把小筛盘放入装满水的漏斗中，24小时后，用小培养皿或试管接在乳胶管下，松开止水夹，收集线虫悬浮液。然后在解剖镜下根据线虫的形态结构挑取拟丽突线虫，将其转入灭菌的离心管中，用消毒液处理20分钟，3000转/分钟离心5分钟，除去上清夜，再用无菌水反复清洗5次。每次清洗时充分震荡，3000转/分钟离心5分钟，弃去上清液。消毒剂用重量百分比为0.1%的硫酸链霉素和重量百分比为0.002%的放线菌酮的混合液(李辉信，陈小云，胡锋.土壤食细菌线虫的分离和富集培养方法.南京农业大学学报,2002，25(2):71-74)。5)拟丽突线虫的培养取干净的直径为6cm的培养皿，将步骤3)得到的线虫培养基4~6mL平铺在培养皿中，静置8~10小时，用微量移液器按细菌液/培养基为1/50的体积比例，将步骤2)得到的细菌液80-120^L倒入培养皿，静置3-5分钟，用接种针挑入步骤4)得到的无菌拟丽突线虫1020条，均勻放置在培养基上，盖上培养皿盖子。上述操作步骤均在无菌超净工作台上进行。然后将培养皿置于恒温恒湿培养箱，在湿度50~60%、温度203(TC培养511天，即可得到所培养的线虫。所述牛肉膏为巿售产品。是用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓縮而得到的一种棕黄色的膏状物，含有肌酸、肌酸肝、氨基酸类、矿物质类及维生素的水溶性物质。所述蛋白胨为巿售产品。是用新鲜牛骨及牛肉混合提取，经过消化、过滤、浓缩、喷雾干燥而得到的一种浅黄色至类白色的干燥粉末。易溶于水，水溶液呈淡黄色。所述NaCl为实验室用分析纯NaCl。所述2mol/L的NaOH的制备取100mL烧杯，加入8g实验室用分析纯NaOH,加入50mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌，使之充分溶解，溶液转移到100mL容量瓶，每次用68mL蒸馏水清洗烧杯45次，清洗液转移到容量瓶，最后定容至100mL,摇动均匀。备用。所述摇床为具有温度控制功能装置的实验用摇床，如东联电子技术开发有限公司产的HZQ-R型摇床。所述琼脂为巿售产品，是从石花菜、江蓠等红藻植物提制的多糖。其主要成分为多聚半乳糖的硫酸脂。制成的商品有的为条状，有的为粉状。琼脂的最有用特性是它的凝点和熔点之间的温度相差很大。它在水中需加热至95'C时才开始熔化，熔化后的溶液温度需降到4(TC时才开始凝固，所以它是配制固体培养基的最好凝固剂。所述胆固醇贮存液制备取1000mL实验用容量瓶，加入800900mL乙醇，将5g胆固醇溶入乙醇中，摇动容量瓶使胆固醇溶解，用乙醇定容至1000mL,摇动均勻。备用。所述lmol/LCaCl2的制备取lOOOmL实验用容量瓶，加入800~900mL蒸馏水，称量lllg分析纯无水CaCl2,摇动容量瓶使CaCV溶解，用蒸馏水定容至1000mL，摇动均匀。备用。所述的1mol/LMgS04备取1000mL实验用容量瓶，加入800~900mL蒸馏水，称量120g分析纯无水MgS04,摇动容量瓶使MgS04溶解，用蒸馏水定容至1000mL,摇动均勾。备用。所述lmol/L磷酸缓冲液的制备取1000mL实验用容量瓶，加入800~900mL蒸馏水，加入136g分析纯KH2P04,摇动容量瓶使KH2P04溶解，用蒸馏水定容至1000mL，摇动均勻。备用。所述0.1%的硫酸链霉素和0.002%的放线菌酮混合液制备取100mL实验用容量瓶，加入80~90mL蒸馏水，加入10g(精确到O.Olg)医用白色粉末状硫酸链霉素，摇动容量瓶使硫酸链霉素溶解，用蒸馏水定容至100mL,摇动均匀。得重量比为10%硫酸链霉素。取100mL实验用容量瓶，加入8090mL蒸馏水，加入0.5g(精确到O.OOlg)放线菌酮，摇动容量瓶使放线菌酮溶解，用蒸馏水定容至100mL，摇动均匀，配制成重量比为0.5%放线菌酮溶液。取1000mL容量瓶，加入800900mL蒸馏水，加入重量比为10%硫酸链霉素溶液10mL、重量比为0.5%放线菌酮溶液4mL,用蒸馏水定容至1000mL,摇动均匀，得重量比为0.1%的硫酸链霉素和重量比为0.002%的放线菌酮混合液。所述放线菌酮化学名称为3-[2-(3,5-二甲基-2-氧代环己基)-2-羧基乙基]戊二酰胺，分子式C15H23N04,分子量281.35。所述微量移液器范围为100~500|iL,如上海求精生化试剂仪器有限公司生产的100500nL微量移液器。所述的拟丽突线虫的培养步骤中，放入培养箱前的各搡作步骤需要在无菌工作台上进行，所述的无菌工作台为实验室进行微生物实验所用的常规无菌超净工作台。实施例1:细菌液制备:用接种环挑取大肠杆菌菌株接入50mL液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，所釆用接种环直径为2.5mm,每次接种大肠杆菌数量为2><107个，在37。C下170转/分钟摇床振荡培养24小时得到细菌液(细菌液中大肠杆菌浓度为3xl()S个/mL),备用。培养基配方为牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaC15g、蒸馏水1000ml，最后调节pH为7。7拟丽突线虫的培养取18个干净的直径为6cm的培养皿，将步骤3)得到的线虫培养基5mL平铺在培养皿中，静置10小时，按细菌液/培养基为1/50的体积比例，将上述得到的细菌液100pL倒入培养皿，静置5分钟，在每6个培养皿中分别用接种针挑入步骤4)得到的无菌拟丽突线虫10条、15条和20条，均匀放置在培养基上，盖上培养皿盖子。上述操作步骤均在无菌工作台上进行。然后将培养皿置于恒温恒湿培养箱，在湿度50%、20°C培养11天，即可得到所培养的线虫。实施例2细菌液制备:用接种环挑取大肠杆菌菌株接入40mL液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，所釆用接种环直径为2.5mm,每次接种大肠杆菌数量为1><107个，在36.5t:下175转/分钟摇床振荡培养25小时得到细菌液(细菌液中大肠杆菌浓度为lxl()S个/mL),备用。培养基配方为牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaC15g、蒸馏水1000ml，最后调节pH为6.5。拟丽突线虫的培养取18个干净的直径为6cm的培养皿，将步骤3)得到的线虫培养基4mL平铺在培养皿中，静置8小时，按细菌液/培养基为1/50的体积比例，将上述得到的细菌液80|iL倒入培养皿，静置3分钟，在每6个培养皿中分别用接种针挑入步骤4)得到的无菌拟丽突线虫10条、15条和20条，均匀放置在培养基上，盖上培养皿盖子。上述操作步骤均在无菌工作台上进行。然后将培养皿置于恒温恒湿培养箱，湿度55%、21°C培养10天，即可得到所培养的线虫。实施例3细菌液制备:用接种环挑取大肠杆菌菌株接入60mL液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，所釆用接种环直径为2.5mm，每次接种大肠杆菌数量为3><107个，在37.5'C下165转/分钟摇床振荡培养23小时得到细菌液(细菌液中大肠杆菌浓度为5xl()S个/mL),备用。培养基配方为牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaC15g、蒸馏水1000ml,最后调节pH为7.5。拟丽突线虫的培养取18个干净的直径为6cm的培养皿，将步骤3)得到的线虫培养基6mL平铺在培养皿中，静置9小时，按细菌液/培养基为1/50的体积比例，将上述得到的细菌液120nL倒入培养皿，静置4分钟，在每6个培养皿中分别用接种针挑入步骤4)得到的无菌拟丽突线虫10条、15条和20条，均匀放置在培养基上，盖上培养皿盖子。上述操作步骤均在无菌工作台上进行。然后将培养皿置于恒温恒湿培养箱，湿度60%、22°C8培养10天，即可得到所培养的线虫。实施例4~11:具体实施方式同实施例1，不同之处在于线虫培养温湿度和培养时间有所差别(见表1)。表1编号培养湿度(％)培养温度(°c)培养时间(天)45123952249653258754268856279572810582961159305应用例1:本应用例釆用实施例1(20。C)的培养方法，培养后得到线虫数量如表2(表中数据为取lcn^平面，观测线虫数量，根据培养皿面积，以观测数据乘以25得到，下同)。表2加入IO条线虫加入15条线虫加入20条线虫培养皿1310034002600培养皿2217538253425培养皿3232523501950培养皿4290032753025培养皿5267528752725培养皿6197516003100平均252528882804根据表2结果，培养前加入拟丽突线虫IO条、15条和20条处理，经11天培养后平均分别达到2525条、2888条和2804条。9应用例2:本应用例釆用实施例6(25t:)的培养方法，培养后得到线虫数量如表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>根据表3结果，培养前加入拟丽突线虫10条、15条和20条处理，经5天培养后平均分别达到3604条、3738条和3954条。应用例3:本应用例采用实施例11(3(TC)的培养方法，培养后得到的线虫数量如表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>根据表4结果，培养前加入拟丽突线虫10条、15条和20条处理，经5天培养后平均分别达到3725条、3592条和3654条。权利要求1.一种拟丽突线虫的培养方法，其特征在于将大肠杆菌E.coli菌株接入液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，在36.5～37.5℃下165～175次/分钟摇床振荡培养23～25小时得到细菌液；然后，将细菌液加入到线虫培养基，再挑入消过毒的无菌的拟丽突线虫，置于恒温恒湿培养箱，在湿度50～60％、温度20～30℃条件下培养5～11天，即可得到所培养的线虫。2.根据权利要求l所述的拟丽突线虫的培养方法，其特征在于所述大肠杆菌五."//菌株为普通野生型大肠杆菌，菌株属于革兰氏阴性短杆菌，大小0.5xl3微米，周身鞭毛，能运动，无芽孢。3.根据权利要求l所述的拟丽突线虫的培养方法，其特征在于所述的细菌液是将大肠杆菌菌株用接种环挑取，接入4060mL液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，每次接种大肠杆菌数量为1"07~3><107个，放进具有恒温功能的摇床，调节摇床温度36.537.5"C、摇动次数设置为165-175次/分钟，振荡培养2325小时，得到细菌液。4.根据权利要求l所述的拟丽突线虫的培养方法，其特征在于所述的液体牛肉膏蛋白胨培养基按重量计为牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaCl5g、蒸馏水1000mL,最后用2mol/LNaOH调节pH为6.5~7.5。5.根据权利要求l所述的拟丽突线虫的培养方法，其特征在于所述的线虫培养基按重量计为3gNaCl、17g琼脂、2.5g蛋白胨，溶于975mL蒸馏水中，120122。C灭菌，29.5-30.5分钟后分别加入5mg/mL胆固醇贮存液1mL、1mol/LCaCl21mL、1mol/LMgS041mL、pH为5.9~6.1的lmol/L磷酸缓冲液25mL,摇动均勾，即得线虫培养基。6.根据权利要求1所述的拟丽突线虫的培养方法，其特征在于所述的拟丽突线虫的培养步骤为，取干净的直径为6cm的培养皿，将线虫培养基46mL平铺在培养皿中，静置810小时，用微量移液器按细菌液/培养基为1/50的体积比例，将细菌液8012(HiL倒入培养皿，静置35分钟，用接种针挑入无菌拟丽突线虫10~20条，均匀放置在培养基上，盖上培养皿盖子；然后，将培养皿置于恒温恒湿培养箱，在湿度50~60%、20~3(TC培养511天，即可得到所培养的线虫。全文摘要本发明涉及生物培养，具体为一种拟丽突线虫的培养方法。培养步骤为以大肠杆菌E.coli菌株为生长菌，将大肠杆菌菌株接入液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，在36.5～37.5℃下165～175次/分钟摇床振荡培养23～25小时得到细菌液，然后将细菌液加入到线虫培养基，再挑入经无菌消毒的拟丽突线虫(Acrobeloidesnanus)，置于恒温恒湿培养箱，在湿度50～60％、温度20～30℃条件下培养5～11天，即可得到所培养的线虫。本发明操作简单，成本低廉，容易实施；本发明培养得到的拟丽突线虫，可作为环境污染生态毒理诊断的一种有效指示生物，解决环境污染的生物检测问题。文档编号A01K67/00GK101485300SQ20081001016公开日2009年7月22日申请日期2008年1月18日优先权日2008年1月18日发明者勇姜,琪李,梁文举,伟郝申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所