专利名称：一种大麦黄矮病毒RNAi植物表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种大麦黄矮病毒RNAi植物表达载体及其应 用，特别涉及来源于大麦黄矮病毒GAV株系复制酶基因序列的双链RNAi双T-DNA植物表达载 体及其在抗禾谷类黄矮病基因工程中的应用。
背景技术：
禾谷类黄矮病毒病是由大麦黄矮病毒O^Wey ye7"^ ofer/ w'r"s, BYDVs)引起、断虫 介导，在小麦、大麦、燕麦和黑麦等多种作物上广为传播的一种毁灭性病毒病害[MillerWA, Rasochova L. 5ar7e/ye72cw oVarf Firw5e5". Annu Rev Phytopathol， 1997， 35:167~190]。 禾谷类黄矮病毒病的发病面积和危害程度呈逐年扩大和加重趋势，BYDV-GAV是当前我国流行 的病毒株系[Liu Y, Sun B, Wang XF, Zheng CL and Zhou GH. 7T ree o^curige"/"-Js6eJec/ cZ 似/y。Aes /hr 5^eci/!z'c ofetectJ'o" <xf t力e朋turaJ "op〃Ja fi朋。/* Aar/e/ "W置cfer/ w>,s j'" 6M朋d。f-Wot力/Z)"Wza"o". Virol Methods, 2007, 145(1): 22 29]。 栽培品种中的抗黄矮病基因极少，迄今没有发现来自普通小麦的抗病基因，即使在大麦中唯 一鉴定命名的抗、耐大麦黄矮病基因)W么其抗性水平还受遗传背景和栽培条件影响[Burnett PA， Comeau A and Qualset CO. /fost to7era/ ce or re67'5t朋ce /or co/^_roZ of力ar/ey
"/7w 6ferZ! In: Barley Yellow Dwarf: 40 Years of Progress (D' Arcy CJ and Burnett PAeds)， 1995. 32广343;钱幼亭，周广和，周希明.从麦类种质资源中筛选大麦黄矮病毒 抗原.植物保护学报，1993， 20(1): 71~75]，抗病资源短缺是抗黄矮病育种取得突破性进展 的限制性瓶颈因子。
近年来，植物抗病毒基因工程研究进展较快[Dupr印，Henry M， Posadas G ， et al. ( e"e"caJ7y ^ i'/ ee/"i"(g" w力eat /or Mr7e/ /e7i置oVar/ res7'st朋ce. ^fia 7e/
JWioir Zter/" Z^ease.'yPeceT^ JoVa/7ce51 ,i/ti/i-e 5"tra tegies. Henry M&Mc Nab A eds. CIMMYT, Texceco， Mexico, 2002. 27~28;张增艳，辛志勇.抗黄矮病小麦生物技术育 种研究进展.作物杂志，2005， 5: 19 22],然而，转化病毒复制酶基因、外壳蛋白(CP)和运 动蛋白基因正义链或负义链获得的转基因植株抗性水平不高，通常表现为延迟发病时间或减 轻症状[McGrath PF, Vincent JR, Lei CH, Pawlowski WP， Torbert KA， Gu W， Ka印pler HF, Wan Y, Lemaux PG, Rines HR， Somers DA, Larkins BA and Lister RM. Coat protein-mediated resistance to isolates of barley ye〗low dwarf in oats and barley. Eur J Plant Pathol. 1997, 103:695 - 710;成卓敏，吴茂森，夏光敏等.应用基因枪法获得抗大麦黄矮病毒转基 因小麦.植物病理学报，2000， 30(2): 16—121]。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是真 核生物中普遍存在的由双链RNA(dsRNA)介导的同源mRNA降解现象[Zamore PD, Tuschl T, Sharp P and Bartel DP. y A^'.. ob"Z Je "ra/70tec/ y 厕c/ii-e"51 t力e ofe/ e/ cfe"t c7eara《e 。/M"似at^-i^/wWeofjWeiy^arrah. Cell, 2000, 101:25~33]。在细胞中，长的dsRNA 被类似RNase的Dicer酶切割成21 26bp的小干扰RNA(siRNA) 。 siRNA与蛋白复合物结合后形成 RNA诱导沉默复合物RISC，同时解链。有活性的RISC与同单链siRNA互补的转录物结合后导致 特定mRNA的降解。RNAi是植物在长期进化过程中形成的一种抗病毒机制，病毒在植物细胞内 繁殖产生的双链RNA诱导了植物固有的RNAi机制，然而在相对中性的自然界，天然的RNAi系统不能起到完全或较高水平地抵御某种病毒侵染的作用[Voinnet 0. Review, yP朋w7朋"y^ as a p7朋t /顺""e 57st柳a卵jV7st "/YAse51. Trends Gen, 2001， 17(8): 449~459]。转基因 大麦和烟草的研究表明，根据病毒的某一序列构建可在植物细胞内表达产生双链RNA (如发卡 RNA)的载体，强化植物体内天然的RNAi抗病毒机制，能够获得免疫水平的高抗转基因植物 [Waterhouse PM, Graham MW and Wang MB. Kz'r"s 7"a i"a"ce a"G^e/ e sj7e"d'"《i/ ; 2朋ts c朋力e /^"ceW sj'/7"7Z"朋eows e^oresw'o/ o/" se"se a/ c/朋"'se"se / 服Proc Natl Acad Sci， 1998, 95:13959 13964; Missiou A, Kal肌tidis K， Bouflal A， Tzortzakaki S， Martin Tabler M, Tsagris M. ( e"era"'o/7 of tra/75^e/ iCjDoL3t"op7a/ ts1/ 化/ 7/i-esj'st3"f to尸"ato K/r"s ^ro塔力/ 朋w7e"ci/^. Mol Breed, 2004， 14:185 197]。作为一种新的分
子育种技术，RNAi已成功用于植物抗病性、籽粒品质性状的改良实践。
转基因技术是作物性状改良的一种有效育种途径，由于转基因(尤其是除草剂和抗生素类 选择标记基因)潜在的安全性风险，转基因植物的环境和食用安全性问题越来越受到人们的 关注[Richard BF， Ed D, Roy LF, Robert TF. 5"e7e"a力Je鹏rAer ge"esv safe /br/ 7a/ ts1. Biotechnology, 1992, 10: 1441 1444]。剔除转基因植物中的选择标记基因是解决这一问 题的有力手段。目前，获得无选择标记的方法有多种，其中的有效方法之一是构建含双T一DNA 区的植物表达载体[Komari T, Hiei Y， Saito Y, Murai N and Kumashiro T. Vectors carrying two separate T-DNAs for Co-transformation of higher plants mediated by 4^ratectejrj'哪 Z""y/7e/acie"s and segregation of transformants free from selection markers. Plant J， 1996, 10: 165 - 174]，将目标基因与选择标记基因分开在不同的T一DNA区，通过转基因植 株后代基因的分离使标记基因与目标基因分离，从而获得仅含目标基因的安全转基因后代植 株[Matthews PR, Wang MB, Waterhouse PM， Thornton S， Fieg SJ, Gubler F and Jacobsen JV. Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transfor腿tion with adjacent 'twin T-DNAs' on a standard 4^ro力aci:arz'i/ffltransformation vector. Molecular Breeding, 2001， 7: 195-202]。
发明内容
本发明的目的是提供一种含双边界序列的BYDV-GAV株系复制酶基因双链RNAi植物表达 载体及其应用。
本发明提供的RNAi植物表达载体含有来源于BYDV-GAV复制酶基因0RF1碱基序列的发卡 RNA(hpRNA)表达盒或/和选择标记基因表达盒。hpRNA表达盒和选择标记基因表达盒分别位于 同一载体的2个独立的T-DNA区。hpRNA表达盒含有Ubi启动子驱动的复制酶基因反向重复 序列片段，是来自序列表1的5'端第32位核苷酸序列按照序列表1的核苷酸排列方式向3' 端延长，长度分别为824bp (GAVpol+，序列表1划线部分)和607bp (GAVpol-，序列表1阴 影部分)的脱氧核苷酸片段，在植物细胞内能转录形成发卡结构的双链RNA。选择标记基因 表达盒含有CaMV35S启动子、潮霉素基因hpt和Nos终止子。
上述hpRNA表达盒以及含有它的重组表达载体，包括构建的中间载体和具双边界序列的 RNAi表达载体，工程菌均属于本发明的保护范围。
本发明的RNAi植物表达载体通过使用Ti质粒、直接DNA转化、微注射、农杆菌介导等 常规生物学方法转化植物细胞或组织，在转化细胞内能转录形成hpRNA双链RNA分子，诱导 产生RNAi,导致浸染到植物细胞里的病毒同源mRNA分子特异性降解，病毒不能繁殖和再浸 染，转基因植株获得病毒抗性。被转化的植物宿主可以是小麦、大麦、燕麦和黑麦等禾本科 植物。上述含双边界的RNAi植物表达载体可借助根癌农杆菌介导的遗传转化，从转基因植株
4的分离后代中剔除选择标记基因，在培育无选择标记基因的抗黄矮病转基因安全作物方面具 有很好的应用前景。
图1为pMBW246-GAVpol+的EcoRI/BamHI酶切结果，其中1、 2、 3、 4为四个阳性克隆； M为lkb的marker;
图2为pMBW246-hP-GAVpol的EcoRI/BaraHI/Xbal酶切结果，其中1为阳性克隆；M为lkb 的marker;
图3为pWBVec8-2b-hpGAVpol的BamHI/EcoRI酶切结果，其中7、 11、 16为阳性克隆； M为llkb的marker;
图4为pWBVec8-2b-hpGAVpol的质粒图谱。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例1菌株、质粒的获得及PCR引物的合成
1. 菌株和质粒
质粒pTGAVpl-O提供载体构建所需的BYDV—GAV株系复制酶基因0RF1序列(见序列表1 )。 基础质粒pMBW246提供构建编码发卡RNA表达盒所需的Ubiqutin启动子和Tmr终止子；中 间载体pWBVec8-2B含有2个相邻的T-DNA区，其中一个T-DNA区携有选择标记基因Apt表达 盒。大肠杆菌菌株为machl-Tl，根癌土壤杆菌菌株为AGL1。
2. PCR引物序列
根据大麦黄矮病毒GAV株系聚合酶基因序列(序列表l)设计GAVpol+和GAVpo1-片段的上 下游引物，在GAVpol+序列的5'和3'端分别设有KpnI和FxoRI两个酶切位点，在GAVpol-序列 的5'端设有EcoRI—个酶切位点。
GAVpol+上游引物 5' CGG GGTACCAAGGCGGTCAAAGATTTCA3，(含KpnI酶切位点)
下游引物 5' CGGGAATTCGTCGACGTCCCCTACATTTTCAACGTA3，(含EcoRI酶切位点)
GAVpol-上游引物 5， CGGGAATTCCAAGGCGGTCAAAGATTTCA3，(含EcoRI酶切位点) 下游引物 5， CTTGGACGTCTCCACCTTCTTGACCT3，
实施例2具双T-DNA区的双链RNAi植物表达载体的构建
1. PCR扩增目的片段
提取质粒pTGAVp1-0DNA为模板，PCR扩增获得含相应酶切位点的片段GAVpol+ (824bp) 和GAVpol- (607bp)。
2. pMBW246-GAVpol+中间载体的构建
扩增产物GAVpol+经Kpnl和EcoRI完全双酶切，1%琼脂糖电泳分离回收酶切片段，与 经同样酶切得到的中间载体pMBW246回收大片段，在T4DNA连接酶的作用下16。C连接过夜， 连接产物电击转化大肠杆菌machl-Tl感受态细胞，挑选部分克隆子提取质粒DNA进行酶切鉴 定。重组质粒经EcoRI/BamHI双酶切产生900bp和5. 4kb的两个片段，与目的质粒的酶切图 谱吻合，将其命名pMBW246-GAVpol+ (图l)。3. 发卡RNA中间表达载体pMBW246-hp-GAVpol的构建
EcoRI单酶切PCR扩增得到的GAVpol-片段，将607bp的GAVpol-片段反向插入到经同样 酶切的中间载体pMBW246-GAVpol+中，挑选部分克隆子进行酶切鉴定，重组质粒经 EcoRI/BamHI/Xbal完全酶切产生3kb、 2kb、 800bp、 337bp、 240bp、 200bp的片段，与目的 质粒酶切图谱吻合，该重组质粒(命名为pMBW246-hp-GAVpo1，图2)含有由Ubiqutin启动 子、Tml'终止子以及GAVpol+ (824bp)和GAVpol- (607bp)反向重复序列构成的发卡RNA 表达盒，在细胞内能够转录形成loop长度为0.23kb、双链茎(stem)长度为1. 2kb的发卡 RNA结构。
4. 具双T-DNA区的GAV复制酶基因RNAi植物表达载体构建
Notl/Hindl11酶切pMBW246-hp-GAVpo1中间表达载体，电泳分离回收带有Ubi启动子、 发卡RNA编码序列和Tml'终止子的表达盒，将其连接到载体质粒pWBVec8-2B其中一个T-DNA 区的Notl/HindHI克隆位点，挑选部分重组子进行酶切鉴定，重组质粒经EcoRI/BamHI酶切 产生1. 4kb、 2. lkb、 3. 5kb、 9kb四条带，与预期结果一致，将其命名为pWBVec8-2b-hpGAVpo1 (图3)。该载体具有两个T-DNA区(图4),其中一个携带选择标记基因hpt表达盒，另一个 携带GAV复制酶基因hpRNA表达盒，hpRNA的反向重复序列转录产物可以通过分子内序列互 补形成发卡状(茎环结构)双链RNA，从而诱导植物RNAi。
序列表l: BYDV—GAV株系复制酶基因部分序列
TAT,YrATTA'n'(:Trr(:A,v'、(x,YrGGn'(;ATG(;.vv' TAT(:T(;(;(;(:v'订TTAA(;na:(:AT(;A「(;nTn'(,T「v、('AT(;T(;n、
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AGTCCTGAAGCACGTGCCAGGCGGGAACGCATGGACGTGCTTGACTCTGTGGGTTTTTAGGTCGSEQUENCE LISTING 〈110〉中国科学院成都生物研究所
〈120〉 一种大麦黄矮病毒RNAi植物表达载体及其应用
〈130〉 说明书
<160〉 5
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
<211> 1025
〈212〉 腿
〈213> Barley yellow dwarf virus
〈400〉 1
atgttcttcgaaatact cat鄉agctagtgc認ggcggtcaaagstttcatcagccac60
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<210> 2
7〈211> 〈212〉 〈213>
28 腿
Barley yellow dwarf virus
<400> 2
cggggt3cc3 3ggcggtcaa agatttca
〈210〉 3 <211> 36 <212> DNA
<213> Barley yellow dwarf virus 〈400〉 3
cgggaattcg tcgacgtccc ctacattttc aacgta 36
<210> 4
〈211〉 29
<212> DNA
〈213> Barley yellow dwarf virus
〈210〉 5 〈211〉 26 〈212〉 DNA
〈213> Barley yellow dwarf virus 〈400〉 5
cttggacgtc tccaccttct tgacct 26
<400> 4
cgggaattcc aaggcggtca aagatttca
权利要求
1、一种大麦黄矮病毒基因发卡RNA表达盒，其特征在于含有来自序列表1的5′端第32位核苷酸序列按照序列表1的核苷酸排列方式向3′端延长、长度分别为824bp和607bp的反向重复脱氧核苷酸片段。
2、 一种大麦黄矮病毒RNAi植物表达载体，其特征在于含有权利要求l 所述的大麦黄矮病毒基因发卡RNA表达盒。
3、 一种大麦黄矮病毒RNAi植物表达载体，其特征在于含有双T-DNA 区，其中一个T-DNA区含有权利要求1所述的大麦黄矮病毒基因发卡RNA表 达盒；另一个T-DNA区含有选择标记基因表达盒。
4、 根据权利要求3所述的一种大麦黄矮病毒RNAi植物表达载体，其特 征在于所述的选择标记基因为知L
5、 根据权利要求1或2或3或4所述的大麦黄矮病毒RNAi植物表达载 体，其特征在于所述载体能在转化细胞内转录形成发卡RNA结构的双链RNA 分子，诱导转化细胞产生RNAi。
6、 含有权利要求1所述大麦黄矮病毒基因发卡RNA表达盒的重组表达载 体、工程菌或转基因细胞系。
7、 权利要求1所述的大麦黄矮病毒基因发卡RNA表达盒在培育抗禾谷类 黄矮病植物中的应用。
8、 权利要求2或3或4或5所述的大麦黄矮病毒RNAi植物表达载体在 培育抗禾谷类黄矮病植物中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种大麦黄矮病毒基因发卡RNA表达盒、RNAi植物表达载体及其应用。本发明大麦黄矮病毒基因发卡RNA表达盒、RNAi植物表达载体含有来自序列表1的5′端第32位核苷酸序列按照序列1的核苷酸排列方式向3′端延长，长度分别为824bp和607bp的反向重复脱氧核苷酸片段，能在转化细胞内转录形成发卡RNA结构的双链RNA分子，从而诱导转化细胞产生RNAi，寄主获得高抗病毒的能力。本发明的载体在培育抗禾谷类黄矮病植物或抗禾谷类黄矮病的无选择标记转基因安全植物方面具有很好的应用前景。
文档编号A01H1/00GK101684464SQ200810046119
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者孙文瑜, 磊 王, 静 陈 申请人:中国科学院成都生物研究所