专利名称：：一种新型饲料添加剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属于微生物词料添加剂领域，涉及一种含有溶菌酶、益生菌菌粉、载体的新型饲料添加剂及其制备方法。
背景技术：
：近年来，畜禽疾病的发生日趋上升，由疾病造成的死淘率逐年增加，给畜牧业造成重大经济损失。目前，对动物疾病的预防和治疗药物基本仍采用抗生素，但由于长期、大量使用抗生素，耐药性、菌群失调、免疫力下降、疾病复发率高、药物残留等种种弊端日益严重，同时也严重危害动物机体及人类健康。当前，世界各国对抗生素各自采取了禁用或限制使用的措施，如欧盟从2006年全面禁止使用抗生素；世界卫生组织(WTO)提出了"在食用动物中减少抗生素使用的全球原则"；我国已启动"饲料安全工程"，并禁用了一批毒性和残留较大的药物。在此形式下，改变养殖观念、预防重于治疗，并开发应用无毒、无药残的新型绿色饲料添加剂是必然趋势。其中，酶制剂、微生态制剂等均是目前常用和研究较多的绿色、安全的饲料添加剂。溶菌酶(lysozyme)是一种专门作用于微生物细胞壁肽聚糖的水解酶。它能切断肽聚糖中N—乙酰葡萄糖胺和N—乙酰胞壁酸之间的P一l，4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下使细胞胀裂开，引起细菌裂解死亡。由于G+细菌的细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G一细菌只有内壁层为肽聚糖，因此溶菌酶只能破坏G+细菌的细胞壁，而对G—细菌作用不大。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人和动物的细胞无破坏作用。另外，溶解酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，同时作为动物和微生物自身的免疫因子，具有抗菌消炎、抗病毒、止血、镇痛及加快组织修复、减少腹泻、增强机体非特异性免疫力、促进双歧杆菌增殖等多种有益作用，目前已被广泛应用于医疗、食品工业、化妆品领域、体育领域和生物工程中。相比之下，溶菌酶在饲料添加剂方面的应用研究还很少，而且，溶菌酶本身具有抗菌谱窄、性能不稳定的缺点，这也是限制其在饲料上广泛应用的原因之一。专利CN1666635公布了一种含有溶菌酶的组合物及用途，该组合物含有溶菌酶、协同增效物、包衣材料和载体，该组合物经特殊的微囊工艺处理，并配以甘氨酸等其它组分制成产品，其工艺繁琐、成本高、规模生产难度大，且其制备方法不适合产业化应用。专利US6221404B1公布了一种能够增强益生菌一蜡状芽孢杆菌仏,"7/"sce^附CIP5832饲喂效果的方法，即同时添加益生菌和溶菌酶或其盐，能够显著提高益生菌的饲喂效果，但其局限性是益生菌菌种单一。
发明内容本发明首次将溶菌酶加入到益生菌制剂中并制成新型饲料添加剂，目的在于提供一种制备工艺简单、可产业化应用的、多种益生菌复合并含有溶菌酶的新型绿色饲料添加剂。此添加剂兼有并增强了微生态制剂和溶菌酶的优点，具有治疗、预防、保健、增强免疫力的多重功效。本发明的另一目的在于提供该新型饲料添加剂的制备方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的-本发明提供一种新型词料添加剂，该饲料添加剂中含有溶菌酶、益生菌菌粉和载体，溶菌酶、益生菌菌粉与载体的比例为1:115:84~98。进一步，本发明的词料添加剂中溶菌酶与益生菌菌粉的比例优选为1:6~15。其中，所述的溶菌酶可以通过常规方法制备或市售取得，但应保证其活力单位的存在并达到一定的量；本发明中所使用的溶菌酶，其活力单位为500万-1000万u/g，但活力单位可有所提高或降低。本发明中所述的益生菌菌粉为枯草芽孢杆菌(fi""7/".s、、"M/")菌粉、乳酸杆菌(￡fl"0^ia7/"SS/0菌粉和酿酒酵母(Sfla'/"/AWM.VC"ce/rv/wVie)菌粉中的任一种、两种或三种。为达到本发明的发明目的，也应保证上述三种益生菌菌粉中活菌数的存在并达到一定的量;本发明中上述三种益生菌菌粉中的活菌数为l5Xl(Tcfu/g，但活菌数可有所提高或降低。本发明中所述的载体包含可溶性淀粉、轻质碳酸钙、次粉，上述成分在载体中的比例为1:1~5:13。本发明还提供了该新型饲料添加剂的制备方法，其特征在于步骤如下(1)制备益生菌菌粉；(2)按比例称取益生菌菌粉、溶菌酶和载体，混合，即得。上述步骤(1)制备益生菌菌粉在本发明中涉及到枯草芽孢杆菌(Bflc/〃"ssw^/to)、乳酸杆菌(Lfl"o6ttc/〃"s)和酿酒酵母(^icc/miwnj;cacerev/wW)三种菌的菌粉制备过程，具体过程如下枯草芽孢杆菌菌粉的制备过程，具体步骤1)平板培养复壮将枯草芽孢杆菌菌种接种于含有5—20()ug/ml溶菌酶的BPY平板培养基上，于35—37'C培养12—24h,使枯草芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落接种于斜面培养基上，35—37'C培养24—36h;2)—级种子的制备将步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌种转接茄子瓶斜面培养基上，于37'C培养12—16h，使其处于对数中后期，得一级种子；所述的斜面培养基为BPY固体培养基；3)二级种子的制备将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有1—1.6M3BPY种子培养基的2MJ种子罐中，温度35—37。C，转速200—250rpm，罐压0.05Mpa，通风比1:0.6—0.8(14.4~19.2M3/h)，培养10—14h，为二级种子液；4)发酵液的制备将步骤3)制备的二级种子液按照3—10%的接种量接种到装有12—16IV^发酵培养基的发酵罐中，温度35—37。C，转速220—300rpm，罐压0.05Mpa，通风比1:0.6—0.8，培养16—20h，至芽孢形成率90%以上，活菌数为l一2X10'"cfu/ml，则中止发酵，得发酵液；所述的发酵培养基为麸皮1-2%,豆粕1-2%，氯化钠0.2-0.8%，硫酸镁0.01-0.05%;5)枯草芽孢杆菌菌粉的制备在步骤4)制备的发酵液中加入20—25%的填充物，混匀，进行喷雾干燥，进风温度120130°C，排风温度405(TC，雾化器转速18000rpm,得到水分含量<5%的枯草芽孢杆菌菌粉。所述的填充物为米糠、沸石粉、稻壳粉中的任一种。乳酸杆菌菌粉的制备过程，具体步骤1)平板培养复壮将乳酸杆菌菌种接种于含有5—200ug/ml溶菌酶的MRS平板培养基上，于32—37。C培养12—24h，使乳酸杆菌复壮，并形成单菌落；挑取单菌落接种于斜面培养基上，32—37。C培养24—36h;2)—级种子的制备将步骤1)培养的乳酸杆菌斜面菌种转接到装有250ml—300mlMRS培养基的500mL三角瓶中，于32—37""C培养12—16h，转速1'00—150rpm，使其处于对数中后期，为一级种子；3)二级种子的制备将步骤2)培养的乳酸杆菌一级种子转接到装有1.2—1.6LMRS培养基的2.0L三角瓶中，于32—37。C静止培养12-16h，为二级种子液；4)发酵液的制备将步骤3)制备的二级种子液按照3—6%的接种量接种到装有12—16IV^发酵培养基的发酵罐中，温度35-37°C，转速120—160rpm，罐压0.05Mpa，培养16—20h，至活菌数为2—5X109cfu/ml，中止发酵；所述的发酵培养基为葡萄糖1-2%，大豆蛋白胨1-2%，硫酸铵0.5-1.0%，氯化钠0.2-0.8%，硫酸镁0.01-0.05%;5)乳酸杆菌菌粉的制备:将步骤4)制备的发酵液，3500-5000rpm离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量/体积百分比为15—20%的冻干保护剂，混匀，于-25'C-45'C冷冻干燥，得到水分含量<5%的乳酸杆菌菌粉；所述的冻干保护剂为脱脂奶粉、甘油、蔗糖、麦芽糊精和谷氨酸钠的混合物，按照脱脂奶粉甘油蔗糖麦芽糊精谷氨酸钠=2:1:1:1:l的比例混合而成。酿酒酵母菌粉的制备过程，具体步骤1)平板培养复壮将酿酒酵母接种于98号平板培养基上，28一32'C培养24—36h,使酿酒酵母复壮，并形成单菌落；挑取单菌落接种于98号斜面培养基上，于28—32。C培养24—36h;2)—级种子的制备将步骤1)培养的酿酒酵母斜面菌种转接到装有250ml—300ml98号培养基的500mL三角瓶中，于28—32°C培养12—16h，转速150—200rpm，使其处于对数中后期，为一级种子；3)二级种子的制备将步骤2)培养的酿酒酵母一级种子转接到装有1.2—1.6L98号培养基的2.0L三角瓶中，于28—32。C静止培养12—16h，为二级种子液；4)发酵液的制备将步骤3)制备的二级种子液按照3—10%的接种量接种到装有12—16MS发酵培养基的发酵罐中，温度28—32。C，转速150—200rpm，罐压0.05Mpa，培养16—20h，至活菌数为2—5X109cfu/ml，中止发酵；所述的发酵培养基为红糖1-2%，大豆蛋白胨1-2%，酵母膏0.2-1%，氯化钠0.2-0.8%,硫酸镁0.01-0.05%，磷酸氢二钾0.2-1.0%;5)酿酒酵母菌粉的制备将步骤4)制备的发酵液，3000-4000rpm离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量/体积百分比为15—20o/(,的冻干保护剂，混匀，-25卩~-45°(:冷冻干燥，得到水分含量<5%的酿酒酵母菌粉；所述的冻干保护剂为脱脂奶粉、甘油、麦芽糊精的混合物，按照脱脂奶粉甘油麦芽糊精=2:1:l的比例混合而成。本发明首次将溶菌酶加入到益生菌制剂中并制成新型饲料添加剂，产品兼有并增强了微生态制剂和溶菌酶的优点，比各自单独添加效果均好，能显著促进增重，提高饲料转化率；改善肠道菌群的平衡,提高免疫力和抗病力，具有治疗、预防、保健、增强免疫力的多重功效。该词料添加剂，在使用中添加量占词料的0.5-5Q/^即可，且可替代抗生素，抗菌谱广，防治效果显著，从而改善动物产品品质，达到绿色、安全、无药物残留。另外，本发明的新型饲料添加剂，其制备工艺简单、适合产业化应用。通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。具体实施例方式实施例l枯草芽孢杆菌菌粉的制备1)平板培养复壮将冰箱保藏的枯草芽孢杆菌斜面菌种采用划线接种的方法在含有200ug/ml溶菌酶的BPY平板培养基上划线接种，于37"C培养24h，使枯草芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；挑取单菌落于新鲜的斜面培养基上，于37'C培养36h，放置冰箱备用；2)—级种子的制备将步骤1)培养好的枯草芽孢杆菌新鲜斜面菌种转接茄子瓶新鲜斜面培养基上，于37-C培养12h，使其处于对数中后期，为一级种子；所述的斜面培养基为BPY固体培养基；3)二级种子的制备将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有1.6IV^BPY种子培养基的2MS种子罐中，温度37°C，转速250rpm，罐压0.05Mpa，通风比1:0.8，培养10h，为二级种子液。4)发酵液的制备将步骤3)制备的二级种子按照10%的接种量接种到装有16M3发酵培养基的发酵罐中，温度37°C，转速300rpm，罐压0.05Mpa，通风比1:0.6，培养20h中止发酵，此时芽孢形成率卯％以上，活菌数为2.0X101GCfWml;所述的发酵培养基为麸皮2%，豆粕2%，氯化钠0.2"/。，硫酸镁0.01%;5)枯草芽孢杆菌菌粉的制备在步骤4)制备的发酵液中加入20%的米糠载体，混匀，进行喷雾干燥，进风温度13(TC,排风温度50'C，雾化器转速18000rpm，得到水分含量为4%的枯草芽孢菌粉。实施例2乳酸杆菌菌粉的制备1)平板培养复壮将冰箱保藏的乳酸杆菌斜面菌种采用划线接种的方法在含有200ug/ml溶菌酶的MRS平板培养基上划线接种，于37"C培养24h，使乳酸杆菌复壮，并形成单菌落；挑取单菌落于新鲜的MRS斜面培养基上，于37'C培养36h，放置冰箱备用；2)—级种子的制备将步骤1)培养好的乳酸杆菌新鲜斜面菌种转接到装有300mlMRS培养基的500mL三角瓶中，于37。C培养12h，转速100rpm，使其处于对数中后期，为一级种子；3)二级种子的制备将步骤2)培养好的乳酸杆菌种子液按照10%接种量接种到装有1.6LMRS培养基的2.0L三角瓶中，于37°C静止培养16h，为二级种子液；4)发酵液的制备将步骤3)制备的二级种子液按照6"/。的接种量接种到装有16IV^发酵液的发酵罐中，温度35-C,转速120rpm,罐压0.05Mpa，培养16h中止发酵，此时活菌数为5Xl()9cfu/ml;所述的发酵培养基为葡萄糖2%，大豆蛋白胨1%，硫酸铵1.0%，氯化钠0.2%，硫酸镁0.05%;5)乳酸杆菌菌粉的制备将步骤4)制备的发酵液，5000rpm离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量/体积百分比为15。/。的冻干保护剂，混匀，-251:-45°。冷冻干燥，得到水分含量<5%的乳酸杆菌菌粉；所述的冻干保护剂为脱脂奶粉、甘油、蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠按照2:1:1:1:1比例混合而成。实施例3酿酒酵母菌粉的制备1)平板培养复壮将冰箱保藏的酿酒酵母斜面菌种采用划线接种的方法在98号平板培养基上划线接种，于28。C培养36h，使酿酒酵母复壮，并形成单菌落；挑取单菌落于新鲜的98号斜面培养基上，于28'C培养24-36h，放置冰箱备用；2)—级种子的制备将步骤1)培养好的酿酒酵母新鲜斜面菌种转接到装有250ml98号培养基的500mL三角瓶中，于28。C培养12h，转速150rpm，使其处于对数中后期，为一级种子；3)二级种子的制备将步骤2)培养好的酿酒酵母种子液转接到装有1.2L98号培养基的2.0L三角瓶中，于28。C静止培养16h，为二级种子液；4)发酵液的制备将步骤3)制备的二级种子按照3%的接种量接种到装有16IVe发酵培养基的发酵罐中，温度28'C，转速200rpm，罐压0.05Mpa，培养16h中止发酵，此时活菌数为2X109cfu/mh所述的发酵培养基为红糖2%,大豆蛋白胨1%，酵母膏0.2%，氯化钠0.8%，硫酸镁0.01%，磷酸氢二钾0.2%;5)酿酒酵母菌粉的制备将步骤4)制备的发酵液，3000rpin离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量/体积百分比为15%的冻干保护剂，混匀后于-25。C-45。C冷冻干燥，得到水分含量<5%的酿酒酵母菌粉；所述的冻干保护剂为脱脂奶粉、甘油、麦芽糊精按照2:1:1比例混合而成。实施例4本发明的新型饲料添加剂的制备及其对防治仔猪腹泻的影响。本发明的新型词料添加剂的制备:将实施例2和3中制备的乳酸杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉与溶菌酶和载体按照如下重量比(wt%)进行混合乳酸杆菌菌粉10wt%，酿酒酵母菌粉10wt%，溶菌酶1.3wt%，可溶性淀粉20wt。/。，轻质碳酸转38.7wt。/。，次粉20wt。/。。试验动物选用35日龄断奶，体重在9kg左右的长白x大白杂交仔猪作为试验动物，共120头，试验猪来源于饲养管理规范、防疫措施严格的北京全利民猪场，一批选齐，出生日期相差不超过7天。试验设计采用随机单因子设计。试验分四组，每组有三个重复，每个重复10头断奶仔猪，组间和重复间体重差异不超过平均体重的5%。试验日粮采用玉米一豆粕型日粮作为基础日粮，对照组饲喂基础日粮，试验组I为在基础日粮上添加1%。乳酸杆菌菌粉和酿酒酵母菌粉的混合物，试验组II为在基础日粮上添加100g/T预防拉稀的抗生素阿散酸，试验组111为在基础日粮中添加5^本实施例制备的新型饲料饲料添加剂，试验组IV为在基础日粮上添加5mg/kg的溶菌酶。基础日粮组成及营养水平见表1。表l饲喂基础日粮组成及营养水平曰粮组成含量(％)营养指标^^p^<image>imageseeoriginaldocumentpage12</image>鱼粉5赖氨酸(。/0)0.91预混剂4蛋氨酸+胱氨酸(％)0.63测试指标及方法在试验开始和结束时早晨空腹对猪只称重，分别以重复组为单位进行全群称重、计算耗料量、日增重、料肉比、腹泻率等指标，并进行差异性显著检验。试验结果试验仔猪的生产性能见表2。从表2可见在平均日增重仔猪试验组i、试验组n、试验组m和试验组iv比对照组分别提高6.7%、7.5%、9.5%、7.2%;在料肉比方面试验组I、试验组II、试验组m和试验组IV比对照组分别降低7.5%、5.2%、8.0%、6.0%;在腹泻率方面试验组i、试验组n、试验组m和试验组iv比对照组分别降低67.3%、47.7%、70.1%、62.6%。试验组m在日增重、料肉比、腹泻率均比试验组i、试验组n与验组iv好，且差异显著，说明本发明的新型饲料添加剂完全能够替代抗生素，益生菌和溶菌酶有协同增效作用。表2试验仔猪的生产性能<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例5本发明的新型饲料添加剂的制备及其对矮小蛋鸡的影响本发明的新型饲料添加剂的制备将实施例l、2和3制备的枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉与溶菌酶和载体按照如下百分比进行混合枯草芽孢杆菌菌粉lwt%,乳酸杆菌菌粉5wt%，酿酒酵母菌粉lwt%，溶菌酶0.47wt。/。，可溶性淀粉15wt"/。，轻质碳酸钙32.53wt%，次粉45wt%。试验动物随机选用60周龄矮小蛋鸡3000只，随机分为2个试验组，每个试验组1500只，按照随机分组安排试验。基础日粮的组成和营养成分见表l。试验鸡为三层笼养，每笼3只，自由采食和饮水，按常规进行饲养管理。对照组饲喂基础日粮，试验组I为在基础日粮上添加1%。枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸杆菌菌粉和酿酒酵母菌粉的混合物，试验组II为在基础日粮上添加1%。本实施例制备的新型饲料词料添加剂，试验组m为在基础日粮上添加200mg/kg的溶菌酶。表l基础日粮组成和营养成分成分(%)营养成分玉米56.0代谢能(MJ/kg)12.59豆粕14.6粗蛋白(％)17.06菜粕3.4转(％)3.57花生饼3.0总磷(％)0.55鱼粉2.0蛋氨酸(％)0.738玉米蛋白粉2.0蛋氨酸+胱氨酸(％)0.676酒精蛋白粉5.0石粉5.8沸石1.0磷酸氢钙1.8预混料5注每千克日粮中维生素A12000IU，维生素D3150(HU，维生素E25IU，维生素K31.0mg，硫胺素5.5mg，核黄素5.0mg，泛酸16mg，维生素B68.0mg，生物素0.3mg，胆碱500mg，叶酸1.8mg，维生素B120.008mg，铁90mg，铜20mg，碘0.45mg，锰80mg，锌80mg，硒0,2mg，DL-蛋氨酸l.SOg.测定指标每天观察记录每重复产蛋数、蛋重、不合格蛋数和鸡只死淘情况;每周末统计耗料量;分别统计每组鸡产蛋后期的产蛋率、蛋重、破损率、死亡率、采食量和料蛋比。试验结果如表2所示，在产蛋后期，试验组产蛋率分别比空白对照组提高2.53%，蛋重有所增加；在蛋鸡死亡率和蛋壳破损率方面下降。试验组I、II、111产蛋率分别比空白对照组提高1.79%、2.81%、1.61。/。；试验组I、II、m蛋鸡死亡率分别比空白对照组分别降低0.3%、0.35%、0.32%;可见添加本发明的新型饲料添加剂效果最佳。表2矮小蛋鸡生产性能li日耗量产蛋率u组别料蛋比g/个g/只%%<1对照组试验组I55.5655.61126.1124.62.272.2470.7972.580.210.230.50.2试验组II55.72119.82.1573.600.200.15试验组m55.65122.432.2072.400.210.18实施例7本发明的新型词料添加剂的制备及其临床治疗效果本发明的新型词料添加剂的制备，将实施例2制备的乳酸杆菌菌15粉与溶菌酶和载体按照如下重量比进行混合乳酸杆菌菌粉5wt%，溶菌酶5wty。，可溶性淀粉10wt。/。，轻质碳酸钙50wtV。，次粉3(hvt%。将上述制备的饲料添加剂用做诊断患有细菌系腹泻的仔猪试验。试验对象150头经诊断患有细菌性腹泻的仔猪。试验设计将150头患病仔猪随机分为两组，每组三个重复，每个重复25头，试验组I词喂2.5Q4本实施例制备的新型伺料添加剂，试验组II:大剂量的痢菌净；观察患病仔猪的恢复情况及治愈后的情况。试验结果试验组I的治愈率为95.8%，试验组II治愈率为75.%，说明本发明的新型饲料添加剂对细菌性仔猪腹泻有很好的治疗效果，完全能够替代抗生素。权利要求1、一种新型饲料添加剂，其特征在于含有溶菌酶、益生菌菌粉和载体，溶菌酶、益生菌菌粉与载体的比例为1∶1～15∶84～98。2、如权利要求1所述的新型饲料添加剂，其特征在于溶菌酶与益生菌菌粉的比例优选为1:615。3、如权利要求1所述的新型饲料添加剂，其特征在于所述的益生菌菌粉为枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸杆菌菌粉和酿酒酵母菌粉中的任一种、两种或三种。4、如权利要求1所述的新型饲料添加剂，其特征在于所述的载体包含可溶性淀粉、轻质碳酸钙、次粉，上述成分在载体中的比例为1:1~5:13。5、一种如权利要求1一4任一项所述的新型饲料添加剂的制备方法，其特征在于步骤如下(1)制备益生菌菌粉；(2)按比例称取益生菌菌粉、溶菌酶和载体，混合，即得。全文摘要本发明属于微生物饲料添加剂领域，涉及一种含有溶菌酶、益生菌菌粉和载体的新型饲料添加剂及其制备方法。其中，益生菌菌粉为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌粉和/或乳酸杆菌(Lactobacillussp.)菌粉和/或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌粉。该新型饲料添加剂首次将溶菌酶加入到益生菌制剂中并制成新型饲料添加剂，产品兼有并增强了微生态制剂和溶菌酶的优点，比各自单独添加效果均好，能显著促进增重，提高饲料转化率；改善肠道菌群的平衡，提高免疫力和抗病力，具有治疗、预防、保健、增强免疫力的多重功效，且制备工艺简单、适合产业化应用。文档编号A23K1/165GK101530161SQ200810101608公开日2009年9月16日申请日期2008年3月10日优先权日2008年3月10日发明者宇刘,琨姚,孙占敏,张玳华,白玉卿,云莫,贾秋英,军赵,赵雁青申请人:北京大北农科技集团股份有限公司