专利名称：桫椤孢子的保存方法
技术领域：
本发明涉及蕨类植物孢子的一种保存方法，特别涉及桫椤G4^^^7a 5"A Vn/7osa(Wa11. ex Hook. )Tryon)孢子的一种保存方法。
背景技术：
全世界桫椤科(6y^力朋ce犯)植物约有6属500余种，产于热带和亚热带的 山地。绝大多数种类的桫椤科植物都具有树状的直立茎，呈乔木状，大型羽状叶子 簇生于茎干的顶端，形成伞状，故又称为树蕨。据化石记载，在地质历史上桫椤科 植物最早出现于中生代的早侏罗纪或晚三叠纪，在中生代中期曾广泛分布，极为繁 盛。后来由于地质变迁和气候变化，特别是第四纪冰川期的影响，大量种类灭绝， 分布区也大幅度收縮，因此常被人们称为植物界的"孑遗种"、"活化石"。该科 植物除了具有较高的园林观赏价值，还可药用，其根状茎具有清热解毒、驱风湿等 功效；我国兰花栽培者常用桫椤科植物的树干作为附生兰花的载体；此外，其有些 种类的树干还可制备笔筒，如笔筒树(&力aero/^eris 7e/w'/ers)等。
目前桫椤的数量已经非常稀少，只有在中亚亚热带以南低海拔地区保存较好的 常绿阔叶林的林缘才见生长，我国地处桫椤科植物分布地的北缘，种类不多，目前 已知的仅有2属14种和2个变种，主要分布于贵州、四川、广东和台湾等地。《国 家重点保护野生植物名录》将桫椤科所有种列为国家二级保护植物(国家林业局， 农业部，1999)，其中桫椤C4ho; 力^/a柳'/^固(Wa11. ex Hook.) Tryon)被列为国 家一级保护植物，在《濒危野生动植物种国际贸易公约》中桫椤科所有种被列为附 录II物种(1975)。其濒危的主要原因是种间遗传多样性降低导致了适应性和竞争力 下降，加上人类活动的干涉以及其自然条件下孢子寿命短，孢子萌发、配子体的形 成对环境条件要求严格。因此，需要对桫椤科植物进行人工繁殖，才能保护桫椤科 植物和满足实际需要。保护桫椤科植物的最佳途径是通过组织培养，而如何长期保 持孢子活性是其中的关键。
发明内容
本发明的一个目的是提供挱椤孢子的一种保存方法。
本发明所提供的挱椤孢子的一种保存方法，是将成熟的桫椤孢子置于液氮中避光保存。
其中，所述挱椤孢子在保存前可以先在室温下干燥2-5天。 所述桫椤具体为桫椤Cl^o;3/^7a 5"pi/2〃7osa(Wa11. ex Hook.) Tryon)。 实验结果表明，利用本发明方法保存桫椤孢子，原萌发率为90%的孢子保存12 个月后活力降低少。与其它现有保存方法相比，本发明方法具有简便易行、占用较 小空间、成本低廉、保存效率高的优点。本发明方法能更好地保持孢子结构的完整， 并使其维持更高的活力。本发明方法弥补了孢子寿命较短给挱椤的繁殖和生物学研 究带来的困难，为开展该物种遗传育种和保护生物学等方面的研究提供了便利。
图1为-196。C保存时使用液氮罐。
图2为-196。C保存时将孢子收集于纸包并存放于离心管中的示意图。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。 下述实施例中所用的桫椤孢子为挱椤U^op力^a印众Wo^(Wa11. ex Hook.) Tryon)孢子。
下述实施例中所述的孢子都是采摘时具有相同成熟度的孢子。成熟度从孢子囊 的颜色及开裂状况判断，桫椤成熟孢子囊呈深褐色， 一个叶片上有少量几个孢子囊 开始裂开时采摘最好。
实施例l、孢子的收集及保存前孢子活力的检测
选取叶背面布满棕褐色孢子囊群且大部分完整尚未开裂的孢子叶，从叶柄处剪 下，展开分装于洁净纸袋中；随机取其中的一部分成熟桫椤孢子，灭菌、制成孢子 悬浮液，计数；在无菌条件下，先用无菌水将1/2MS培养基的表面湿润，使其表面 形成一层薄薄的水膜(以倾斜三角瓶时汇集在底部的水不能让滴管吸上连续的水滴 为宜)，然后用滴管将上述获得的无菌孢子悬浊液均匀接种在培养基上，每个培养 皿接种2滴，接种3个培养皿；接种后，在25土2X:下，先暗培养24h，然后将其 转至光照下继续培养，光照强度为50陶o1 m—2 s—1 (光源为荧光灯)，光照时间为 12h/d，培养30天；从培养皿中随即选取400个孢子，分别统计萌发和未萌发的个 数，计算萌发率，萌发率的计算公式为萌发率=萌发的孢子数目/400。
实验重复3次，结果取其平均数。结果表明保存前孢子的萌发率为90%。
实施例2、桫椤孢子的保存及保存后活力检测一、 20 t:保存
保存将实施例1中所述分装于洁净纸袋中的孢子叶，置于室温下干燥2-5天 至孢子囊自然弹开，轻微揉搓纸袋使孢子完全脱落，用硫酸纸收集孢子，过200目
筛子去除杂质，置于20 t:环境中黑暗储存。
保存后孢子活力的检测12个月后，从中随机取出一小部分孢子，按照实施例
1中所述方法进行孢子培养，并统计萌发率。
实验设3次重复，结果全部死亡。
二、 4 'C保存
保存将实施例l中所述分装于洁净纸袋中的孢子叶，置于室温下干燥2-5天 至孢子囊自然弹开，轻微揉搓纸袋使孢子完全脱落，用硫酸纸收集孢子，过200目
筛子去除杂质，置于4 r冰箱中黑暗储存。
保存后孢子活力的检测
保存12个月后，从中随机取出一小部分孢子，按照实施例1中所述方法进行 孢子培养，并统计萌发率。
实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，孢子萌发率为57%，比保存前降 低33%。
三、 -18 。C保存
保存将实施例1中所述分装于洁净纸袋中的孢子叶，置于室温下干燥2-5天 至孢子囊自然弹开，轻微揉搓纸袋使孢子完全脱落，用硫酸纸收集孢子，过200目 筛子去除杂质，置于-18 "C冰箱中黑暗储存。
保存后孢子活力的检测
保存12个月后，从中随机取出一小部分孢子，按照实施例1中所述方法进行 孢子培养，并统计萌发率。
实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，孢子全部死亡。
四、 液氮保存
保存将实施例1中所述分装于洁净纸袋中的孢子叶，置于室温下干燥2-5天 至孢子囊自然弹开，轻微揉搓纸袋使孢子完全脱落，用硫酸纸收集孢子，过200目 筛子去除杂质，用滤纸包成lXlcm2大小的纸包，作上标记，装入10ml离心管(图 2)，置于-196 。C液氮罐中黑暗储存(图l)。
保存后孢子活力的检测保存12个月后，从中随机取出一小部分孢子，室温化冻30 min，按照实施例 1中所述方法进行孢子培养，并统计萌发率。
实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，孢子萌发率为76%，比保存前降 低14%。
权利要求
1. 桫椤孢子的一种保存方法，是将成熟的桫椤孢子置于液氮中避光保存。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述桫椤孢子在保存前先在室 温下干燥2-5天。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述桫椤为桫、椤""op力Ws 柳'/ i/7os3(Wa11. ex Hook. )Tryon)。
全文摘要
本发明公开了桫椤孢子的一种保存方法。本发明所公开的桫椤孢子的一种保存方法，是将成熟的桫椤孢子置于液氮中避光保存。实验结果表明，利用本发明方法保存桫椤孢子，原萌发率为90％的孢子保存12个月后活力降低少。与其它现有保存方法相比，本发明方法具有简便易行、占用较小空间、成本低廉、保存效率高的优点。本发明方法能更好地保持孢子结构的完整，并使其维持更高的活力。本发明方法弥补了孢子寿命较短给桫椤的繁殖和生物学研究带来的困难，为开展该物种遗传育种和保护生物学等方面的研究提供了便利。
文档编号A01C1/00GK101283642SQ20081011190
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月19日 优先权日2008年5月19日
发明者东 李, 杨 李, 雷 石 申请人:中国科学院植物研究所