专利名称：：利用rna干扰技术培育直链淀粉含量提高的玉米的方法
技术领域：
：本发明涉及一种培育直链淀粉含量提高的玉米的方法，特别涉及一种利用RNA干扰技术培育直链淀粉含量提高的玉米的方法。
背景技术：
：玉米产业发展对我国农业经济具有重要的战略意义。开发高直链玉米可延伸玉米的精深加工产业链，对提高玉米种植的附加值和农民增产、增收具有深远的意义；同时也为新型可降解环保材料的开发、应用和推广有积极的促进作用。玉米中淀粉约占普通玉米籽粒干重的70%-75%，其中支链淀粉约占总淀粉含量的75%左右，而直链淀粉仅占25%左右。随着淀粉工业的迅速发展，直链淀粉被广泛地应用到各个领域(王凤格等，2002)。尤其在塑料行业，高直链淀粉使塑料制品具有生物降解性，是塑料工业的更新原料，是解决目前严重的"白色污染"的有效途径，应用前景十分广阔。直链淀粉属于抗消化淀粉，可用于制作糖尿病、肥胖、高血压、胆结石等病人的保健食品(王振华等，2002;张文青，2005;张志英和沈建福，2005)。从普通玉米淀粉中提取直链淀粉成本很高。目前我国的特用玉米资源中，尚无育成的高直链淀粉玉米品种在生产上推广，工业上需要的直链淀粉大部分从美国进口，每吨20002500美元，价格为普通淀粉的10倍，少部分由普通玉米淀粉加工提取而成(张瑛等，2005)。因此，开发出高直链淀粉含量的玉米品种十分必要。长期以来，广大科研工作者利用常规杂交技术在玉米新品种选育和品质改良方面做了大量的工作，培育出了一批具有较好应用前景的自交系。但是，常规杂交育种技术在玉米品质改良的过程中也暴露出了诸多缺点。玉米中淀粉的合成过程受到一系列酶的调控。淀粉分支酶(starchbranchingenzymes,SBE)是淀粉生物合成过程中的一个关键酶，它能切开a—l，4一糖苷键连接的寡糖片断，又能把切下的短链通过a—1，6—糖苷键连接于受体链上，形成分支结构(VisserandJacobsen,1993;Smitha丄，1997)。玉米淀粉分支酶有3种同工酶，SBEI、SBEIIa和SBEIIb。SBEI、SBEIIb主要在胚乳中存在，SBEIIa主要存在于叶片中(GuanHP，"，1994)。目前，对淀粉分支酶基因已从分子生物学水平和生物化学方面进行了一定的研究，对淀粉分支酶的生理功能基本清楚(Blauthets丄，2001;Blauthets义，2002;G羅"s丄，1994;ELbashireta丄，2001)。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是近年来兴起的基因表达调控技术。它作为一种新的技术方法，已经在各个不同的生物研究领域内广泛应用并取得了很多重要成果(ELbashireta7，2001;Ogitaeta7.，2003，Ogitaet，2004;Liueta丄，2002)，因此RNAi被人们认为是后基因组时代进行大规模基因功能验证及表达调控分析，以及遗传改良的最佳方法之一。
发明内容本发明的一个目的是提供一种培育直链淀粉含量提高的玉米的方法。本发明所提供的培育直链淀粉含量提高的玉米的方法，是将表达如下干扰RNA分子的重组载体导入玉米中，得到淀粉分支酶SBEIIb编码基因被沉默的玉米即为直链淀粉含量提高的玉米;所述干扰RNA分子的一条链序列如序列表中序列1所示，另一条链序列如序列表中序列2所示。所述重组载体的结构如图1所示。本发明方法通过在玉米自交系中表达^^//》基因的RNAi分子，沉默玉米淀粉分支酶基因^6//6的表达，降低支链淀粉合成量，从而提高直链淀粉含量。实验结果表明，通过本发明方法能使玉米中直链淀粉的含量提高15%。另外，本发明方法能够克服传统育种方法的局限，通过基因工程技术快速获得目标性状，再与常规育种结合，进而加快了高直链玉米淀粉的生产品种培育。图1为RNAi重组表达载体pBAC413的结构示意图。图2为玉米愈伤组织诱导、植株分化与移栽的图。图3为i/Lra/2的DNA点杂交结果。图4为/^ZZ^i/z^ro/2的PCR检测结果。图5为i/z^TOT的PCR—Southern检测结果。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。实施例1、通过向玉米中导入^&//6基因的RNAi载体从而提高玉米中直链淀粉含量玉米自交系178、478、501、黄C和ZP501K为通用自交系材料，来源于国家种质资源库。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司(英国)，pGEM-Teasy载体购自Promega公司(美国)，TagDNA聚合酶购自TaKaRa公司(日本)，大肠杆菌(￡coA')菌株DH5a购于北京天根公司。一、We//6基因的RNAi载体pBAC413的构建1、淀粉分支酶基因sbellb的克隆在网络数据库(http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)中输入sbelib的mRNA序列(AF072725)后，得到一系列siRNA最佳作用位点，利用DNAMAN进行NotI、HindIII、EcoRI、BaraHI等常用酶切位点的分析。依上述步骤选定sbellbmRNA序列的899-2039共1162bp为目标序列(包含3个最佳siRNA位点区段1458-1480、1625-1647、1934-1956)，设计一对引物，Pl(5'GATCCTCCTGAAGAGGTAAAG3')和P2(5'GAATAAACTTACCACTTGGAAG3')。以玉米基因组DNA为模板，进行PCR扩增。25叱PCR反应体系为10XPCRbuffer2.5ML，dNTP(2.5mmol/L)2.0叱，Pl、P2(10Pm/叱)各l.OHL，基因组DNA1.0叱，TaKaRaTaq(5U/PL)0.5叱，以(1甜20补足到25叱。PCR扩增条件为94。C变性3min,50。C延伸1min，72°C退火2min;94°C变性45S，50.9。C延伸50S，72。C退火90S，循环35次；最后72。C延伸10min。PC財广增得到1162bpsbellb基因片段。将扩增产物与pGEM—Teasyvector连接。PCR阳性克隆(命名为pTsbenb)经限制性内切酶酶切初步确认后进行全序列测序，结果表明重组载体结构正确。2、sbellb启动子的克隆依据玉米sbelIb启动子序列(AF072725)设计l对引物，上游引物(P3)引入酶切位点HindIII，下游引物(P4)引入酶切位点BamHI和XmaI。P3:5，-AAGCTTATTTTTGATAATTCATCGGACCG-3'，P4:5'-GGATCCCGGGCCTTCGCAGCCGGATCGGATCG-3，(划线部分为酶切位点)。以玉米基因组丽A为模板，扩增得到3kb产物，将产物与pGEM—Teasyvector连接。阳性克隆(命名为pTsbelibPro)经限制性内切酶酶切初步确认后进行全序列测序，结果表明重组载体结构正确。3、FAD2基因intronl的克隆pHvector的构建以拟南芥菜基因组DNA为模板，设计FAD2基因第1个内含子的引物，上游引物(5GCGGCCGCAAGCTTCTCCAGGTCCGTCGCTTCTCTTCCAT3)和下游引物(5GAATTCTCGAGACCTGCACCTATGTTTCTGCAGAAAACCAAAAGCAA3)，扩增得到l.lkb产物，将产物用NotI和EcoRI双酶切，插入到载体质粒pBluescript(+)(Stratagene，USA)。阳性克隆(命名为pHvector)经限制性内切酶酶切初步确认后，进行测序分析。4、玉米RNAi干扰载体的构建(1)带sbelIb基因反向重复序列结构的pBAC404的构建用限制性内切酶EcoRI酶切步骤l得到的载体pTsbeIIb，回收sbellb目标片段，并将其插入同样经限制性内切酶EcoRI酶切的pHvector载体，将得到的重组质粒命名为pBAC403。pBAC403进行EcoRI酶切检测，利用pHvector的下游引物和sbeIIb的上游引物P1对酶切检测阳性的重组质粒进行PCR扩增，再将经PCR检测连接方向正确的重组质粒(PCR扩增得到2.2kbDNA片段的质粒)进行序列测定，确认其插入方向的正确性。用限制性内切酶NotI酶切步骤l得到的载体pTsbeIIb，回收sbellb目标片段，插入到pBAC403经Notl酶切的位点，将得到的重组质粒命名为pBAC404(即新插入的sbelIb基因片段的转录方向与FAD2intron转录反向相反)。并进行NotI酶切分析鉴定和序列分子鉴定，以确认其插入方向的正确性。(2)sbellb基因启动子与选择标记基因的插入将sbeIIb基因启动子用HindIII和Sma:[酶切，然后插入到pBluescript(+)的HindIII和SmaI位点之间，获得的质粒命名为pBAC407。以木糖异构酶基因(xyW)为筛选标记的表达载体pBAC405的构建a、木糖异构酶基因(xyW)的克隆与序列分析提取大肠杆菌DH5a的基因组DNA，根据已发表￡coh'的xj^4基因序列(GenBankAccessionNo.X04691,2011535，1335bp)设计上下游引物，上游引物P!(5'-gM7TCATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3')、下游引物Pz(5'-6^007X4TTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3')。上下游引物分别引入酶切位点fe/dH和5^1，并在下游引物上加入两个连续的终止密码子，以确保木糖异构酶正确表达并及时终止。以所设计的x/W基因特异引物进行PC財广增，克隆出^f7^基因片段，然后进行电泳检测，电泳结果表明得到了1.4kb的木糖异构酶基因(xyW)片段。凝胶回收并纯化1.4kb的木糖异构酶基因UyZ4)片段，与pGEM-TeasyVector进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切鉴定。将酶切检测结果正确的质粒送到上海生工进行Sp6/T7双向测序。测序结果表明，所克隆序列与GenBankAccessionNo.X04691的自5'端第201位至1535位脱氧核糖核苷6酸相同。将含有该XJ^4片段的重组载体命名为pTxylA。b、1)用&cI和AcoRI从p35SGFP(美国Clontech公司)切下260bp的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(Nos)的终止子(Nos3，)，插入到克隆载体pSP72(2462bp)(购自美国Promega公司的)的5"acI和fcoRI位点，得到重组载体pBPC18。2)以质粒p35SGFP为模板，用上游引物5，-CTGAAGCTTGCGGCCGCTTCGGCCGTCTAG;与下游引物5，-GGCCTGCAGGTCGTCCTCTCCAAATGAAAT，进行PCR，扩增得到460bp大小的CaMV35S启动子。将该扩增产物用^z'"dlll和/^rt双酶切后插入到pBPC18的Zz7dlII和尸WI酶切位点之间，得到重组载体pBPC25。3)以玉米基因组DNA为模板，用玉米脱氢酶基因第l个内含子的上游引物5，-CAGGTCGACGGATCAAGTGCAAAGG;与下游引物5，-GATGGATCCGTCCGCAGCTGCACGGGT，进行PCR，扩增得到560bp大小的Adhl基因第l个内含子。将该PCR产物用5^I和万3/dn双酶切后插入到pBPC25的&JI和万3/zHI酶切位点之间，得到重组载体pBPC28。4)将质粒pBPC28用ffi/^in酶切，用DNA聚合酶Klenow大片段补平后，与含有^bo贝酶切位点的连接子(linker,5'-CCGGAATTCCGG)连接，得到重组载体pBPC29。5)凝胶回收pTxylA经勘/dH、5^cl双酶切产生的约1.4kb目标片段xy7A插入到质粒pBPC29的fe/^I和&cI识别位点之间，将两片段连接并转化ADH5a，获得的阳性克隆命名为pBAC405。对pBAC405进行酶切检测。用EcoRI酶切质粒pBAC405，用DNA聚合酶大片段klenow片段补平，与合成的HindIIIlinker(5CCCAAGCTTGGG3)连接，在EcoRI位点引入HindIII位点，产物定名为pBAC406H3。pBAC406H3经HindlII酶切获得3kb大小的片段，插入到pBAC407的HindIII位点，经酶切分析鉴定筛选出方向与sbellb基因启动子一致的克隆，命名为pBAC409。(3)完整RNAi干扰载体的构建用限制性内切酶X历sI对pBAC404进行酶切，获得含有sbellb目标片段反向重复序列(sbellb+FAD2intron+反向sbelib)3.6kb的片段，插入用X/aal完全酶切后的pBAC409，构建成最终的RNAi表达载体，命名为pBAC413，其结构示意图如图l所示。对重组质粒pBAC413进行XmaI、KpnI、SacI及HindlII等4个单酶切检测，确定其结构正确性。得到的重组载体8八0413能够作为^6//力基因的1^八1载体，其表达的双链RNA的一条链的序列如序列表中序列l所示，另一条链的序列如序列表中序列2所示。二、将重组RNA干扰载体导入玉米以五个玉米自交系178、478、501、黄C和ZP501K作为实验材料。取各玉米自交系授粉后10-11d的玉米幼胚(大小为l2mm)，放入幼胚愈伤诱导培养基中，26。C下暗培养l周。按文献(ZhangXD，LiangRQ，ChenXQ，YangFPandZhangLQ.TransgeneinheritanceandqualityimprovementbyexpressingnovelHMWgluteninsubunit(HMW-GS)genesinwinterwheat(J).C力i/7ese5We/ce^/Wez^7，2003，48(8):771776)中所述的方法进行基因枪微弹的制备。基因枪PDS1000/He转化后的愈伤组织恢复培养l周，转入含有15g/LD-木糖和15g/L蔗糖的愈伤组织诱导培养基，暗培养23周，然后转入分化筛选培养基上筛选培养，分化的绿苗转入壮苗生根培养基上，炼苗35d后，带基质移栽至大田，培养得到再生植株(图2，其中，A为愈伤组织的诱导；B为愈伤组织的分化；C为植株的再生。)。结果，最终获得12株移栽成活的转基因玉米植株，其中，玉米自交系178的5株，玉米自交系478的1株，玉米自交系501的3株，玉米自交系黄C的1株，玉米自交系ZP501K的2株。三、转入重组表达载体的玉米再生植株的检测1、转基因再生玉米植株的点杂交按CTAB法提取再生玉米植株叶片DNA，通过^4ZZ^^iwt基因的引物上游引物为5，-AGCAGATCTATCGTGAGCGG-3，和下游引物为5，-GAAGACTCTCTTGAATCGTTACC-3，进行PCR扩增。按照Roche公司PCRDIG探针标记试剂盒的方法对l.2kb的/^M众&0/2基因进行DIG标记，并以标记后的Dig-^tro77基因作探针，对12株再生植株进行DNA点杂交检测，按Bio-Rad公司Bio-Dot点杂交仪的使用手册进行点膜，按Roche公司的DIGDNA标记与检测试剂盒的使用手册进行杂交和检测。实验设3次重复，结果如图3所示。表明有6株信号较强(图3中，A8表示质粒pBAC413;A7表示转pBAC404的玉米(ckl);A6表示受体玉米自交系(ck2);A5为空白对照；其余为转入pBAC413的玉米)。上述初步筛选的6株阳性植株再利用/^/^^&朋基因的引物进行PCR检测，实验设3次重复，结果如图4所示(其中，泳道l表示分子量标准；泳道2表示转pBAC404的玉米即阴性对照；泳道3表示空白对照；其余为转pBAC413的玉米)。结果表明，除了阴性对照及空白对照没有扩增出目标条带，其它转入pBAC413的玉米植株均有1.2kb目标条带。综合以上结果表明，外源基因已经整合到点杂交初筛的6株转基因玉米基因组中。2、转基因再生玉米的PCR—Southern检测以DIG标记后的Dig-^&ot基因作探针，对步骤1中初步筛选后的6株转基因玉米株系的T。叶片进行PCR-Southern杂交检测。对转基因植株基因组丽A进行PCR反应的反应体系同步骤1中所述i/7^o/7基因PCR鉴定所用的体系。按照785型真空吸印仪(Bio-Rad)使用手册进行DNA转膜，信号检测按照Roche公司的DIGDNALabelingandDetectionKit的使用手册提供的方法进行。实验设3次重复，结果如图5所示(其中，泳道l为pBAC413质粒；泳道2为转pBAC404的玉米即阴性对照(ckl);泳道3为未转入任何载体或基因的玉米(ck2);泳道4-9为转pBAC413的玉米)。杂交结果表明，泳道l的阳性对照质粒有1.2kb的特异条带，而泳道2和泳道3的非转基因植株及泳道4的空白对照没有出现特异杂交信号，其余泳道转基因植株经检测有特异条带,分别为后代株系T3-3、T3-4、T3-7、T2-2、T8和T5。PCR-Southern检测进一步表明外源基因已经整合到这6株再生植株的基因组中。3、玉米籽粒的总淀粉含量和直链淀粉含量的测定将转基因玉米株系成熟果穗单株脱粒，根据近红外谷物分析仪(INFRATEC)使用说明进行玉米整粒总淀粉含量的测定。参照农业标准数据库《谷物籽粒粗淀粉测定法》(GB7648-87)测定玉米直链淀粉含量。实验设3次重复。结果表明，上述6株阳性转基因玉米株系有4株正常结实，分别为自交系ZP501k中的T2-2株系、自交系178中的T3-4株系和T8株系、自交系黄C中的T5株系。其籽粒的总淀粉含量与转基因受体材料各成分的比较如表1所示。表明，阳性再生玉米株系总淀粉含量与受体对照的总淀粉含量基本没有显著差异。根据标准曲线得到以吸光度为x值，直链淀粉毫克数为y值，建立的回归方程Y=4.283x—0.2386(R2二0.9994)。阳性再生玉米直链淀粉含量如表1，4个阳性转基因玉米株系的直链淀粉含量提高了015.6%。表l、3牵基因玉米籽粒的总淀粉含量和直链淀粉含量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*表示经分子水平检测为阳性的再生玉米株系.直链淀粉含量提高幅度为015.6%，变化较大，可能是siRNA沉默的效果不同，具体原因有待于进一步研究；阳性再生株系T3-4的直链淀粉含量与对照相比没有变化的原因可能是RNAi载体插入在异染色质上，未能进行有效的转录，没有siRNA分子形成。<160〉2<210〉1<211〉1162<212〉RNA<213〉人工序列<220〉<223〉<400>1gauccuccuguugcggauaugU333CUUU3auaauggcaauuugcgccaacaugagcuugcuggauggguggccaucacuuuucuucucugauggugugauucaaugaguaugccu3cauauggcuguggggugauauuggaaagucauggauauguauguucaugggaacuuccaaguggggaugaaguuccaagagcaguagucguuuguuugcuaguugaaugguuuggaugugggaccaaugcuagccuccsugauauuuuggcuuuucauggacuuugcccuucccugacaaaugugc3C3cacu3uc3agcauuauuucauggcagaugauuagaugsguuuggguaaguuuauguauguguucugucgga_a_ugccuccc33g3ugguaccccaucucauggauugaugguacauucucgccuaaugguggcucgU3C3CUC3Uugccaccgauuuauccugaguguucacgaugauugaccuugacaaauaggagucggcgacccucgauagaaggcaugcgcaguagcccggggaagcuuuggaagaauugagugguucauagaggaauauacacggauuacguagaugcaggcuguaaccaggugggguagaggugguuagaagacuauugccuucaacucauggguuuaguggauagauuaaccgaagauuuggauacaagauaccauguagucuuugaugucaugcgucacuuucscsgggaacugggaaguuugauggugguuuacuuuuggugaagaguuuugacuagugaugaaacagaagugugucguuuugguucu3CC3uugsgaggagaggguuccaagaggugcagugcaaugauagagcaugguccacguaguuuuaagauuuccguuuuuacggggaacgaugcugguauguuaguggaucggaugcauuuggaagauggauggacaagucgugggsuaCU3UCUU33Uuccgcaaaga116260120180240300360420480540600660720780840900960102010801140〈210〉2<211>1162〈212〉RNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉2guccaaacucgucu33ucaugggccaugaacuaaugcuugucaguguguguccauuugucaccacuuggasuuucccaugCUU3UgU33U3UC3Ug3CUU3gccscagccagucuuugcggcuaucccscuccuuguccsucagcauaagCCC3UCUUCC3U3UgC3UCCgaccucuuggaigcccucuccUU3CaC3CUU3sguuucaucUCCU333CCCaggaguugsscgcaauagucCUCU33CC3Cacuuugcuug3ccuaccccscauucaggauggucuaucgauugucgccgacuccu3uuugagaaggucaaccaucgugaa601201802403〇0360420caggasgggcaaaguccaugacaucauggasucusgc3uugaacuagcaaagugcucuugggacuucauccauguguuuc3CUUU3CCUCaaauguaggc3U3CUC3UUggguc3caicc3ccagugauggC33CCC3UCCsccsagcuc3acuuggcgcagauugccauuccuassguuusu3U3uccgcuucaggaggaUUU3CC3gC3aaguuccccgucaaaacggaccacguggacagaguauuacugugcucuauauuugcacugaaugauuuugC3UCUUC3CCU333UguU3Ccuucccaguucacugugaaauugacgcauguuacaugguacsuuguauccuuaucuucgggucguuuaggaaugguuacacscugc3ucuuuguasuccgCUU3U3UUCCcccausguusguaauguguaCUUC33UUCUasguuuuuuuuuccgggcuauugcgcaugcgccucaggau480scaucggugg540ugaugagugu600ucgagccacc660aauaggcgag720ucugusccau7803C3uccsuga840ucugggguac900960amicuuggga1020cuc3uuccgs10801140116权利要求1、一种培育直链淀粉含量提高的玉米的方法，是将表达如下干扰RNA分子的重组载体导入玉米中，得到淀粉分支酶SBEIIb编码基因被沉默的玉米即为直链淀粉含量提高的玉米；所述干扰RNA分子的一条链序列如序列表中序列1所示，另一条链序列如序列表中序列2所示。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组载体的结构如图l所示。全文摘要本发明公开了一种培育直链淀粉含量提高的玉米的方法。本发明所提供的培育直链淀粉含量提高的玉米的方法，是将表达如下干扰RNA分子的重组载体导入玉米中，得到淀粉分支酶SBEIIb编码基因被沉默的玉米即为直链淀粉含量提高的玉米；所述干扰RNA分子的一条链序列如序列表中序列1所示，另一条链序列如序列表中序列2所示。实验结果表明，通过本发明方法能使玉米中直链淀粉的含量提高15％。另外，本发明方法能够克服传统育种方法的局限，通过基因工程技术快速获得目标性状，再与常规育种结合，进而加快了高直链玉米淀粉的生产品种培育。文档编号A01H1/00GK101591654SQ20081011325公开日2009年12月2日申请日期2008年5月28日优先权日2008年5月28日发明者张晓东,张立全,杨凤萍,梁荣奇,郭新梅,陈绪清申请人:北京市农林科学院