昆虫组织酶解物及其在昆虫病原线虫人工培养上的应用的制作方法

专利名称：：昆虫组织酶解物及其在昆虫病原线虫人工培养上的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物害虫生物防治领域，具体地说涉及一种昆虫组织酶解物，以及昆虫组织酶解物在昆虫病原线虫人工培养上的应用，还涉及含有昆虫组织酶解物的昆虫病原线虫培养基。
背景技术：
：昆虫病原线虫是一类重要的生物杀虫剂，它随寄主昆虫的食物或从昆虫自然开口、节间膜进入昆虫体内，在昆虫血腔中释放自身携带的共生菌，共生菌分泌的毒性因子造成昆虫患败血症死亡。昆虫病原线虫寄主范围较广，能主动搜寻寄主，因此对土栖和钻蛀等隐蔽性害虫具独特防治优势；同时具有可大量人工培养和对人、畜、环境安全等优点。在工业化国家昆虫病原线虫制剂占生物农药巿场销售额的13%,仅次于苏云金杆菌产品。澳大利亚、美国、德国、荷兰、加拿大等国家均有一些昆虫病原线虫产品广泛用于防治农林、牧草、花卉、和卫生等重要害虫。昆虫病原线虫虽然在20多年前就实现了商业化生产，但由于存在线虫生产成本高和线虫质量不稳定等问题，限制了其在生产上的应用。线虫培养技术主要集中于线虫产量、质量和成本，一般通过优化培养基和培养条件可提高线虫产量，从而降低生产成本和提高线虫质量。如专利《酶解培养基培养昆虫病原线虫的方法》(专利号为ZL200410096044.5)公开了一种固体培养线虫的淀粉酶酶解培养基，主要是在以淀粉为主要成分的培养基中加入淀粉酶；此方法使线虫产量大幅提高、收获期提前，线虫的收获率和清洁度也得到提高。但是仍然存在生产成本高，且所生产的线虫质量不高等问题。另外，在培养基中加入昆虫物质或寄主物质可复壮菌株和提高产量(刘石泉等，微生物学通报，2008，35(7):1091-1095。吴友良，江苏蚕业，2003，3:10-11。常韶华等，中国生物防治，1998，14(3):105-106)。但是在培养基中昆虫表皮的存在会大大降低线虫清洁度，增加线虫收获时的清洗难度。
发明内容本发明目的在于提供一种昆虫组织酶解物。本发明另一目的在于提供上述昆虫组织酶解物在昆虫病原线虫人工培养上的应用。本发明还一目的是提供含有上述昆虫组织酶解物的昆虫病原线虫培养基。实现本发明的技术方案如下本发明一种昆虫组织酶解物，按照如下方法制备将昆虫组织和水加入到匀浆器中，匀浆，再加入蛋白酶进行水解反应，然后过滤，弃残渣，所得滤液即为昆虫组织酶解物。上述昆虫组织酶解物的制备方法，包括将昆虫组织和水加入到匀浆器中，匀浆，再加入蛋白酶进行水解反应，然后过滤，弃残渣，所得滤液即为昆虫组织酶解物。所述的蛋白酶的添加量因所添加蛋白酶的种类和蛋白酶的活性的不同而不同，一般蛋白酶的添加量占昆虫组织干物质重的重量百分比为0.520%。所述的昆虫组织干物质重可以通过计算得到，一般昆虫组织干物质重为昆虫鲜重的3040%或昆虫干粉重的9095%。上述蛋白酶进行水解反应的时间因蛋白酶的种类和蛋白酶活性的不同而不同；通常蛋白酶的水解反应时间为10180min。所述的蛋白酶是指可以催化分解蛋白质肽键的蛋白质水解酶，如酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等。所述的酶均可自市场上购买。上述蛋白酶进行水解反应的温度为所述酶活性最高时的温度；可按照所购酶说明书上所标明的温度进行。所述的昆虫组织可以是昆虫组织干粉或活体昆虫。所述的昆虫干粉是将昆虫幼虫干燥，然后粉碎即得。所述的昆虫病原线虫是指可进行人工培养的昆虫病原线虫，如芜菁斯氏线虫(5tez'wewe附a^/"ae)，d、巻娥斯氏线虫(Stez'wer打emacar/ocajosae)，格氏斯氏线虫g/osen')，大异刁、杆线虫(//eferor/^k^Y/s附egzV&)，嗜菌异小杆线虫(//"efe/wtoW他6""en'o//zora)等。所述的昆虫是指可进行人工培养或容易获得、繁殖成本低的昆虫，优选可人工饲养且蛋白质含量较高的昆虫；进一步优选为所培养线虫的寄主昆虫；如小木蠹蛾、蝇蛆、蚕蛹、玉米螟、大蜡螟、菜青虫、米蛾、棉铃虫、黄粉虫、桃小食心虫等。所述的组织匀浆器是指可以破碎昆虫组织的工具;匀浆器可自市场上购买。所述的过滤是指用孔径小于匀浆后昆虫组织的滤网进行，如尼龙网、绸布或纱布等。上述昆虫组织酶解物在昆虫病原线虫人工培养上的应用。所述的应用是指将昆虫组织酶解物作为昆虫病原线虫培养基的组份。含有昆虫组织酶解物的昆虫病原线虫培养基，按照如下方法制备在昆虫病原线虫培养基中加入昆虫组织酶解物，混匀后高压灭菌；所添加的昆虫组织酶解物的数量为匀浆前昆虫组织干物质重与培养基的质量比为1:2.5250。所述的昆虫病原线虫培养基是指可以人工培养线虫的固体或液体培养基等，如狗饲料培养基(House等.Natrue，1965，206:847)、鸡内脏培养基(Bedding等.Ann.appl.Biol.,1984，104:117-120)、鸭肠培养基(杨怀文等.中国生物防治，1991,2:87)、豆粉培养基(韩日畴等.昆虫天敌，1995，17(4):153-164)、动植物蛋白混合培养基(Yang等.Biologicalcontrol,1997，10,193-198)、蚕蛹培养基(常韶华等.中国生物防治，1998，14(3):105-106)等。本发明具有的优点利用本发明昆虫组织酶解物配制的培养基培养的线虫产量高、培养周期短、线虫毒力强、生产成本低；收获的线虫更清洁，简化了收获程序，降低了线虫贮存期污染的几率；操作简便易行，适于线虫的大规模生产。具体实施例方式实施例1芫菁斯氏线虫(5fez'f2^7zema/eto'ae)培养的对比试验1、昆虫大蜡螟组织酶解物的制备(1)选取实验室培养的营养、生理状况一致的大蜡螟末龄幼虫16g，加500g水后用组织匀浆器充分破碎昆虫组织，使大蜡螟组织内含物完全释放并均匀悬浮于混合液中；(2)在混合液中加入中性蛋白酶(北京奥博星公司)lg，在45'C下进行水解反应10分钟；然后用致密绸布滤去大蜡螟组织残渣，所得滤液即为大蜡螟组织酶解物。2、芜菁斯氏线虫培养基的制备(1)向步骤l(2)所得滤液中加入黄豆粉240g、面粉80g、蛋黄粉16g、蛋白胨8g、酵母膏24g、猪油80g、水500g,然后充分搅拌均匀，再用160g海绵吸附；(2)将步骤(1)的培养基以40g/瓶的量装入250ml三角瓶，在121。C下湿热灭菌45分钟后备用。3、芜菁斯氏线虫的对比培养试验(1)培养基为a.本发明的培养基，b.对照为豆粉培养基(组成成份为黄豆粉240g，面粉80g，蛋黄粉16g，蛋白胨8g，酵母膏24g，猪油80g，海绵160g，水1000g)。(2)在上述培养基中分别接种芜菁斯氏线虫的共生细菌(&"on^Z^^6oWem7)，于25。C下黑暗培养2天；(3)在步骤(2)培养细菌的培养基中接种芜菁斯氏线虫，于25"C下黑暗培养；(4)从第6天开始每2天检测培养基中昆虫病原线虫侵染期线虫的比例含量直到收获，每处理重复4次；(5)在侵染期线虫比例稳定到达95%以上时收获线虫，在解剖镜下对收获的侵染期昆虫病原线虫计数，每处理重复7次，计算得到每克培养基中侵染期线虫平均产量(IJs/g);以接种线虫到收获线虫所用的天数作为线虫的培养周期；用"沙柱法"(Yang等.Biologicalcontrol,1997,10，193-198)测定昆虫病原线虫对大蜡螟的侵入率，作为线虫质量检测标准。结果(见表l)昆虫组织培养基线虫产量为对照豆粉培养基的1.52倍，培养周期由原来的22天缩短为16天，收获的侵染期线虫对大蜡螟的侵入率提高5.24%。表l芜菁斯氏线虫培养的对比试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2芜菁斯氏线虫培养的对比试验重复实施例l、但进行下述修改将实施例l步骤l(2)中的中性蛋白酶lg改为酸性蛋白酶(北京奥博星公司)lg，酶解反应条件改为在55'C下进行水解反应30分钟。结果(见表2)昆虫组织培养线虫产量为豆粉培养基的1.50倍，培养周期比豆粉培养基縮短了6天，收获的侵染期线虫对大蜡螟的侵入率提高了6.10%。表2芜菁斯氏线虫培养的刘t比试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3芜菁斯氏线虫培养的对比试验重复实施例l，但进行下述修改将实施例l步骤l(2)中的中性蛋白酶改为碱性蛋白酶(北京奥博星公司)0.5g，酶解反应条件为在5(TC下进行水解反应60分钟；结果(见表3)昆虫组织培养线虫产量为对照豆粉培养基的1.58倍，培养周期比对照豆粉培养基縮短了6天，收获的侵染期线虫对大蜡螟的侵入率提高了4.78%。表3芜菁斯氏线虫培养对比试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4小巻蛾斯氏线虫(Ste&ememacar;7oca戸ae)培养的对比试验重复实施例l，但进行下述修改将步骤l(1)中的大蜡螟末龄幼虫质量改为黄粉虫干粉320g;将步骤l(2)中的酶用量改为5g，酶解反应条件改为在45'C下进行水解反应60分钟；将步骤3(2)中修改为接种小巻蛾斯氏线虫(Sfe/"ememacfl^wca/M"e)的共生细菌(^Te"cWzaWw51"謡fl鄉fe7"51)。将步骤3(3)中修改为接种小巻蛾斯氏线虫5fe/"er"emac^r/oca/wae;结果(见表4)昆虫组织培养线虫产量为对照豆粉培养基的2.26倍，培养周期比对照豆粉培养基缩短6天，收获的侵染期线虫对大蜡螟的侵入率提高了9.78%。表4小巻蛾斯氏线虫培养对比试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例5小巻蛾斯氏线虫培养的对比试验重复实施例4，但进行下述修改将其中的黄粉虫干粉改为蛆干粉。结果(见表5)昆虫组织培养线虫产量为豆粉培养基的2.17倍，培养周期縮短6天，收获的侵染期线虫对大蜡螟侵入率提高了10.56%。表5/」、巻蛾斯氏线虫培养的对比试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例6小巻蛾斯氏线虫5"te/wememaca/poca/waei咅养基的制备重复实施例5，但进行下述修改将其中的中性蛋白酶改为酸性蛋白酶5g(北京奥博星公司)，酶解反应条件改为在55"C下进行水解反应120分钟。结果(见表6)昆虫组织培养基线虫产量为对照豆粉培养基的2.15倍，培养周期缩短6天，收获的侵染期线虫对大蜡螟侵入率提高了9.50%。表6'」、巻蛾斯氏线虫培养对比试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例7异小杆线虫(//e/m^/za^/fe^rc&n'o//7ora)培养对比试验重复实施例5，但进行下述修改将其中的黄粉虫质量改为1600g;将其中的蛋白酶(北京奧博星公司)用量改为3g;将其中接种的共生细菌修改为接种异小杆线虫的共生细菌(i^oto^Wc/附/"m/M^"m);将其中接种的线虫修改为接种异小杆线虫。结果(见表7)昆虫组织培养线虫产量为豆粉培养基的2.15倍，培养周期縮短4天，收获的侵染期线虫对大蜡螟侵入率提高了6.42%。表7异小杆线虫培养对比试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例8异小杆线虫(//efera^7flZ^to6ac^7'o//zoraJ培养对比试验重复实施例7，但进行下述修改将其中的酶解反应条件改为在45'C下进行水解反应180分钟；结果(见表8)昆虫组织培养线虫产量为豆粉培养基的2.10倍，培养周期縮短为18天，收获的侵染期线虫对大蜡螟侵入率提高了10.57%。表8异小杆线虫培养对比试验<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1、一种昆虫组织酶解物，其特征在于按照如下方法制备将昆虫组织和水加入到匀浆器中，匀浆，再加入蛋白酶进行水解反应10～180min，然后过滤，弃残渣，所得滤液即为昆虫组织酶解物。2、按照权利要求l所述的昆虫组织酶解物，其特征在于所添加蛋白酶的数量占昆虫组织干物质重的重量百分比为0.520%。3、按照权利要求1或2所述的昆虫组织酶解物，其特征在于所述的蛋白酶是指酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶或胰蛋白酶之一种。4、按照权利要求3所述的昆虫组织酶解物，其特征在于所述的昆虫组织是指昆虫组织干粉或活体昆虫。5、按照权利要求4所述的昆虫组织酶解物，其特征在于所述的昆虫是小木蠹蛾、蝇蛆、蚕蛹、玉米螟、大蜡螟、菜青虫、米蛾、棉铃虫、黄粉虫或桃小食心虫之一种。6、权利要求1所述的昆虫组织酶解物在昆虫病原线虫人工培养上的应用。7、按照权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用是指将昆虫组织酶解物作为昆虫病原线虫培养基的组份。8、按照权利要求6所述的应用，其特征在于所述的昆虫病原线虫是指芜菁斯氏线虫、小巻蛾斯氏线虫、格氏斯氏线逸、大异小枉线虫或嗜菌异小杆线虫。9、含有权利要求15任一所述的昆虫组织酶解物的昆虫病原线虫培养基，按照如下方法制备在昆虫病原线虫培养基中加入昆虫组织酶解物，混匀后高压灭菌；所添加的昆虫组织酶解物的数量为匀浆前昆虫组织干物质重与培养基的质量比为1:2.5250。10、按照权利要求9所述的昆虫病原线虫培养基，其特征在于所述的昆虫病原线虫培养基是指人工培养线虫的固体培养基或液体培养基。全文摘要本发明公开了一种昆虫组织酶解物，主要是利用蛋白酶对昆虫组织进行水解，然后过滤，所得滤液即为昆虫组织酶解物。本发明还公开了昆虫组织酶解物在人工培养病原线虫上的应用，即将昆虫酶解物作为组份加入到常规培养基中，混匀灭菌即可。利用本发明昆虫组织酶解物配制的培养基培养的线虫产量高、培养周期短、线虫毒力强、生产成本低；收获线虫更清洁，简化了收获程序，降低了线虫贮存期污染的几率；操作简便易行，适于线虫的大规模生产。文档编号A23K1/18GK101411405SQ20081022728公开日2009年4月22日申请日期2008年11月26日优先权日2008年11月26日发明者倩刘,曹翠玲,王金利,恒简申请人:中国农业大学