专利名称：：一种樟芝菌丝体的新颖培养方法
技术领域：
：H一禾中tit(AntrodiacamphorataAntrodiacinnamomea)新颖培养方法。
背景技术：
：樟芝的型态樟芝又名牛樟菇、樟菰、樟窟内菰，台湾有称阴阳对口菇。樟芝子实体属多年生，具有强烈冲鼻的樟树香气，此与一般灵芝类有很大的差异，其外型呈板状或钟状。板状型态者，面为橘红(黄)色，整面全有菌孔，板底层有浅黄白色的木栓质，通过木栓质附着在牛樟树中空心材内壁上生长。钟状型态者，子实层(钟面)亦呈橘(黄)色，充满菌孔(45个菌孔/毫米)，内有孢子味极苦，新鲜时为橘红色，之后会成为橘褐色或褐色，钟体则呈暗绿褐色的皮壳。以显微镜观察其担孢子，其型态为平滑无色的透明微弯柱形。樟芝的生物特性野生的樟芝是生长在牛樟树干中空内壁上，因为这个特性，造成很多牛樟树倒伏。文献记载，樟芝是在牛樟树上目前唯一发现的木材腐杉菌，病征为褐色腐朽，故为褐腐菌。但是樟芝的病原性并不强，因此牛樟树很少因此死亡。虽然樟芝对牛樟树而言是病原菌，但因樟芝价格昂贵，超过牛樟树的经济价值，因此是不是牛樟树的病原菌已经不重要了。樟芝的培养技术樟芝的培养，人工栽培的技术，仍有待努力。所以，目前仍是以深山采集的方式来获得。但是采集樟芝不是件容易的事，因为首先要寻找牛樟树的产地。常有的困难是牛樟树与有樟，两者极为相似，不易分辨。目前最直接的方法已由藤田安二提出，有樟干油是以黄樟油(safrole)与十五烧醛为主，因而有沙士中黄樟素的味道。牛樟干油则以松油醇(d-terpinenol)为主，而有樟脑油的味道，由此即可区别牛樟与有樟。第二个困难是要从大片树林中找到有中空洞的树干才行，此相当不易。空洞中若有樟芝，则可定期采集。由于找寻中空洞的牛樟树干不易，不肖商人干脆将牛樟树砍倒，以期日后能长出樟芝，进而收集贩卖。因此，为环保及经济上的考虑，发展人工栽培樟芝是必要进行的方向。可惜的是人工栽培樟芝技术一直无法突破。樟芝在牛樟木屑上生长极为缓慢，甚至停滞。因此，若能改以现代生物技术，来培养樟芝菌丝体，将是最经济、最符合环保的人工培育法。目前培养樟芝菌丝体的人工方法亟需开发及改良，常见如液态培养、固态培养、段木培养、野生菌木复育等培育方法。其中又以液态培养菌丝体，产量快速，且成本低廉，可在相当短的时间培养出大量的菌丝体产物。然而，依然存在着以发酵槽培养时的常见问题，即发酵过程常产生大量泡沫。发泡常使很多发酵工程发生问题，原因多是因培养基中的蛋白质，使气相与培养液的界面变性，形成不易破坏的薄膜。当发酵槽充满泡沫便会降低每单位体积可培养的容量，并且导致培养液自发酵槽溢流等缺失。为抑制泡沫的形成，一般的方法是加入消泡剂到培养基中，已知的消泡剂例如聚氧化烯多元醇醚、聚氧化烯烷基醚、聚氧化烯脂肪酸酯、聚氧化烯烷基醚脂肪酸酯等。然而，这些传统发酵用消泡剂并不能自液体表面，同时具有破坏发泡的效果及抑制泡沫形成的效果，以致于其等消泡效果不够充分。另一方面，这些消泡剂伴亦会伴随抑制微生物生长及标的产物生产的问题。甚至，这些传统消泡剂是界面活性剂，多属化学物质，对于人体、动物的健康仍有其风险。由此可见，上述常用樟芝的发酵培养技术及消泡剂仍有诸多缺失及困难，实非良好的设计，而亟待加以改良。芝麻(SesamimindicumL.)属于胡麻科，为一年生自花授粉的油料作物。芝麻油占芝麻种子干重45%60%，因其特别的风味及所含芝麻木质酚(Iignan)的抗氧化特性，在东方食品中深受喜爱。芝麻酚(sesamin)是芝麻油中已知含量最丰富的木质酚抗氧化分子，经动物实验及人体研究中证实具有许多有益健康的功能，如保护肝脏、抗发炎、抗高血压、降低胆固醇、防老化、抗氧化、抗发炎反应、清除自由基、保护神经、抑制肝癌等作用。因此有鉴于1.樟芝唯一寄生物种-牛樟树，属于保育类一级木树种，且为有空心的牛樟树不易取得；2.樟芝子实体的试管内(irwitro)及离牛樟树心空洞外的培育的困难性；及3.樟芝菌丝体也有相似生物功能，且菌丝体的培养和扩大生产较可行；4.樟芝菌丝体发酵培养时伴随大量泡沫，严重影响其产量。
发明内容本发明的目的即在于提供一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，通过添加芝麻油于樟芝培养基中，可达到消泡的功效。本发明的次一目的是在于提供一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，通过添加芝麻油于樟芝培养基中，可于较短的培养时间内产生较多的樟芝菌丝体及菌丝。本发明的另一目的是在于提供一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，通过添加芝麻油于樟芝培养基中，所得者的颜色近似天然樟芝且更富含芝麻酚。为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，包括有如下培养步骤(1)平板培养将樟芝菌丝体接种于平板上，于15-35°C下培养13-15天；(2)烧瓶培养取平板上的菌丝接种于烧瓶培养基内，于15-35°C，pH2_8下，振荡培养5-7天；(3)发酵槽培养将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基内，在15-35°C，pH2_8下，培养9-11天，即得樟芝菌丝体发酵液，包括菌丝体与澄清液；在步骤(3)的发酵槽培养基中按0.01lg/100ml的比例添加芝麻油进行樟芝菌丝体的培养。本发明所提供的一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，与现有技术相互比较时，更具有下列优点1)本发明所提供的一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，通过添加芝麻油于樟芝培养基中以取代常用化学消泡剂，亦可达到消泡现象，因此，本发明提供一种新颖的天然消泡剂。2)本发明提供的一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，其中添加芝麻油于樟芝培养基中用以培养樟芝，除可达到消泡的功效外，通过此方法所得的樟芝菌丝体，相较于现有培养方法，添加芝麻油可使樟芝菌丝体收槽天数缩短、干重增加，颜色近似天然樟芝的红色，更重要的是，通过此培养方法所得的樟芝菌丝体富含芝麻酚，相较现有方法所得者更富营养价值。3)本发明提供的一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，通过添加芝麻油于樟芝培养基中，可促使樟芝的菌丝生长。具体实施例方式白勺歹IJMffi白勺才章^(AntrodiacamphorataAntrodiacinnamomea)菌丝体是得自寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株CGMCCNO.0575、CGMCCN0.0543(现于台湾已有公开出售，具体可参见专利号01115869.7)，但本发明不限于该两种保藏菌种，本领域的技术人员可根据该发明，将所述樟芝菌丝体的新颖培养方法应用于所有的樟芝菌丝体。樟芝菌丝体的液体培养，基本上是采用现有技术来进行，请参考本案申请人于中华民国专利公告第1236480号、或中国专利公告第CN1352990号(
专利名称：樟芝菌丝体生物活性物质其制备方法及含其组成物)。其中包括将菌丝体接种于平板上，于适当温度如15-35°C，(较佳者周温约30°C)下培养约2周后，刮取菌丝接种于烧瓶内，用实施例中所列培养基，在约30°C，pH2-8，较佳者pH4_7，更佳者约pH4.5，及振荡速率50_250rpm下振荡培养到log期初期，亦即，约5-7天；最后，将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基(同烧瓶培养基)内，在15-35°C，(较佳者周温约30°C)，槽压0.1-1.5公斤/平方厘米，及pH约4.5下，以0.5-lvvm通气速率通入空气，或空气与氧气，二氧化碳或氮气的混合物，较佳者空气，在50-300rpm搅拌速率下培养约8_16天。即得樟芝菌丝体发酵液，包括菌丝体与澄清液。该樟芝菌丝体液体培养的培养基配方如下(100ml水中加入成分物质的克数)培养基配方浓度(g/100ml)综合性碳氮源0.015动植物来源蛋白及其水解物0.012无机盐类0.00010.05糖类0.0110酵母或麦芽抽出物(粉、膏)0.0012消泡剂0.0050.015其中该无机盐类可为硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸铁等；其中该动植物来源蛋白及其水解物可为蛋白胨；其中该糖类可为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等；其中该综合性碳氮源可为谷类(如麦粉类)和/或豆类(如黄豆粉、绿豆粉、大豆粉)；于发酵槽培养基中可额外添加消泡剂以抑制培养过程中大量泡沫的生成，其中该消泡剂可为市售的现有消泡剂，如每100ml培养基中添加0.0050.015g消泡剂(AntifoamingKM-72，为含硅油、硅树脂的水性消泡产品)，或每100ml培养基中添加0.01Ig芝麻油(市售)。以下通过具体实施例来详细说明本发明，但本发明不受下述实施例所限制。实施例1樟芝菌丝体的培养菌丝体菌株为寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株CGMCCNO.0575、CGMCCNO.0543。平板培养将菌丝体接种于平板上，使用马铃薯糊精培养基(PotatoDextroseAgar,PDA),于30°C下培养约2周。饶瓶培养刮取平板上的菌丝接种于烧瓶内，用下列培养基，在约30°C，pH4.5下，于摇动机上以振荡速率50-250rpm振荡培养到log期初期，亦即，约5_7天；培养基配方成分浓度(100ml水中加入成分物质的克数)谷类(如麦粉类)1蛋白胨0.1硫酸镁0.05磷酸氢二钾0.05硫酸铁0.05蔗糖2酵母抽出物、粉、膏0.5豆类(如黄豆粉、绿豆粉、大豆粉等)0.2发酵槽培养培养基同上，将烧瓶培养物接种于80公升发酵槽培养基内(100公升发酵槽)，在30°C，槽压1.0公斤/平方厘米，及pH约4.5下，以80升/分通气速率通入空气，在60rpm搅拌速率下培养约10天，残糖降至500ppm以下收槽，即得樟芝菌丝体发酵液，包括菌丝体与澄清液。樟芝发酵液经冷冻干燥或喷雾干燥后，进行干重、多醣体及芝麻酚含量测定。上述发酵槽培养基中，另外分别按0.01g/100ml添加消泡剂(AntifoamingKM-72，为含硅油、硅树脂的水性消泡产品)，或按0.7g/100ml添加芝麻油(纯度，99.89%,丰利食品厂股份有限公司)于发酵槽培养基内。组别如下控制组上述发酵槽培养基中不添加消泡剂及芝麻油；消泡剂组上述发酵槽培养基中添加0.01g/100ml消泡剂；芝麻油组上述发酵槽培养基中添加0.7g/100ml芝麻油。实施例2樟芝菌丝体的干重、多醣体、Lab值及芝麻酚含量测定将实施例1中各组所得的樟芝发酵液经冷冻干燥或喷雾干燥后，进行干重、多醣体、Lab值及芝麻酚含量测定。多糖体测定多糖体分析以酚-硫酸法进行，请参阅Dubio等人的文献(Dubio，M.etal.，1956.Colorimetricmethodfordeterminationofsugarsandrelatedsubstances.Anal.Chem.28,350.)。1.样品处理取1克均质的粉末，加入99倍体积的蒸馏水，于121°C下加热萃取30分钟，上清液以1号滤纸过滤于浓缩瓶中，重复萃取步骤两次，收集滤液加以浓缩，定容至10ml。再以透析膜透析，以去除小分子多醣。透析后所留下的溶液，再定容至10ml，作为分析用。2.分析方法取样品及葡萄糖标准品100μ1，分别加入0.5ml的5%酚溶液，再加入2.5ml的浓硫酸，混合均勻后，静置使其回到室温，另取ΙΟΟμΙ的去离子水，进行空白试验，最后以490nm波长测定其吸光值，比较样品及标准品的吸光值，以算出多醣含量。Lab倌测定以SP60分光仪(X-rite公司，美国)测定菌丝体发酵液干燥粉的Lab值(L+偏浅，“偏深；a+偏红，-偏绿；b+偏黄，-偏蓝)。芝麻酚(Sesamin)测定请参阅王桂芳等人的文献(王桂芳等，1999，HPLC法测定北细辛中芝麻脂素和细辛脂素的含量，药物分析杂志，19(4)，251.)。1.芝麻酚测定样品处理取样品lg，加入IOml的MeOH。置于超音波震荡机，60min萃取，过滤后再以MeOH定容至10ml，取适量通过0.45μm滤膜供作检液。2.分析方法a.标准品溶液配制精确量取芝麻酚储备溶液适量，以MeOH分别调配一系列浓度，分别为芝麻酚0.072,0.096,0.12,0.144,0.168mg/ml。b.高效能液相层析法样品及标准品溶液，以下列条件分析管柱:C18(250X4.6_，5ym)rtCiI1.0ml/min，管柱温度室温。移动相条件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>比较样品及标准溶液的分析结果，以积分面积计算可得到样品中芝麻酚的含量。结果请参考表1所示，将实施例1中各组所得的樟芝发酵液经冷冻干燥或喷雾干燥后，进行干重、多醣体、Lab值及芝麻酚含量测定。其中添加消泡剂及芝麻油的培养基相较于控制组，于培养过程中消泡剂组及芝麻油组皆无起泡现象，因此，添加芝麻油可取代现有的化学类消泡剂。另，观察添加芝麻油的培养基(芝麻油组)可提前2天收槽天数(芝麻油组收槽天数9天；控制组及消泡剂组的收槽天数11天)。且测量干燥后的菌丝体重量，芝麻油组的菌丝体干重(2.83士0.15g/100ml)明显较高于控制组(2.05士0.21g/100ml)及消泡剂组(2.16士0.16g/100ml)所得者。更重要的，相较于控制组及消泡剂组，通过添加芝麻油以培养樟芝所得的菌丝体，经测量发现其菌丝体芝麻酚含量为1.41士0.09mg/g。表1培养基中添加芝麻油对于樟芝生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>另，请参考表2及表3所示，表2为添加芝麻油于培养基所得的樟芝菌丝体发酵液，经冻干后观察其颜色的变化，如表2的结果，相较于控制组及消泡剂组，芝麻油组所得的干燥粉，其颜色有增加红色度现象(a值12.08士0.05)，近似天然樟芝的颜色。表2添加芝麻油的樟芝发酵液干燥后的颜色变化<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>此外，表3为添加芝麻油于培养基所得的樟芝菌丝体发酵液，经喷雾干燥后观察其颜色的变化，如表3的结果，相较于控制组及消泡剂组，芝麻油组所得的干燥粉，其颜色有增加红色度现象(a值16.54士0.05)，近似天然樟芝的颜色。因此，通过添加芝麻油以培养樟芝可得近似天然樟芝颜色的产物。表3添加芝麻油的樟芝发酵液干燥后的颜色变化<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3樟芝固体培养将木屑、黄豆粉、米糠及小麦麸皮(重量份为7111的比例)与适量水混合均勻，再装进耐热太空包袋内(每包约1公斤的固体培养基，包含木屑、黄豆粉、米糠及小麦麸皮(重量份为7111的比例)及适量水)，套上套环，塞住棉花；另一组为相同固体培养基配制成的太空包，并额外添加0.7%芝麻油，再将太空包送进灭菌釜内灭菌(121°C，1小时)。冷却后于无菌操作台各接种5%樟芝发酵液，置于25°C，7585RH(相对湿度)环境下培养。3个月后取出评估菌丝生长情形。结果由菌丝生长情形评估，添加0.7%芝麻油组的菌丝显著较未添加组好，添加芝麻油有助于樟芝固体培养生长。上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，例如现有培养基的成分、现有消泡剂种类等实施例，均应包含于本发明的专利范围中。权利要求一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，其培养步骤如下(1)平板培养将樟芝菌丝体接种于平板上，于15-35℃下培养13-15天；(2)烧瓶培养取平板上的菌丝接种于烧瓶培养基内，于15-35℃，pH2-8下，振荡培养5-7天；(3)发酵槽培养将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基内，在15-35℃，pH2-8下，培养9-11天，即得樟芝菌丝体发酵液，包括菌丝体与澄清液；其特征在于按0.01～1g/100ml添加芝麻油于步骤(3)的发酵槽培养基中进行樟芝菌丝体的培养。2.如权利要求1所述的樟芝菌丝体的新颖培养方法，其特征在于所述樟芝菌丝体为寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株，其保藏号为=CGMCCNO.0575、或CGMCCN0.0543的樟芝菌丝体。3.如权利要求1所述的樟芝菌丝体的新颖培养方法，其特征在于所述震荡培养的震荡速率为每分钟50-250转。4.如权利要求1所述的樟芝菌丝体的新颖培养方法，其特征在于所述发酵槽培养的槽压为0.1-1.5公斤/平方厘米。5.如权利要求1所述的樟芝菌丝体的新颖培养方法，其特征在于所述发酵槽培养以0.5-1VVM通气速率通入空气。6.如权利要求1所述的樟芝菌丝体的新颖培养方法，其特征在于所述烧瓶培养基和发酵槽培养基分别都包含有0.01-5衬％综合性碳氮源、0.01-2wt%动植物来源蛋白及其水解物、0.0001-0.05wt%无机盐类、0.Ol-IOwt%糖类、0.001_2wt%酵母或麦芽抽出物。7.如权利要求6所述的樟芝菌丝体的新颖培养方法，其特征在于所述无机盐类为硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸铁中的一种或多种。8.如权利要求6所述的樟芝菌丝体的新颖培养方法，其特征在于所述糖类为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖中的一种或多种。9.如权利要求6所述的樟芝菌丝体的新颖培养方法，其特征在于所述综合性碳氮源为谷类和/或豆类。全文摘要本发明公开了一种樟芝菌丝体的新颖培养方法，该培养方法为培养过程中在发酵槽培养基中添加芝麻油，取代现有的化学消泡剂，本发明提供了一种新颖的天然消泡剂，通过此培养方法所得的樟芝菌丝体发酵液，使樟芝菌丝体收槽天数缩短、干重增加，颜色近似天然樟芝的红色，富含芝麻酚，相较现有方法所得者更富营养价值。文档编号A01G1/04GK101803528SQ20091000771公开日2010年8月18日申请日期2009年2月16日优先权日2009年2月16日发明者林定威,许胜杰,陈劲出申请人:葡萄王生技股份有限公司