一种灵芝菌丝体发酵的新型培养基配方和优化方法

文档序号:311774阅读:397来源:国知局

专利名称::一种灵芝菌丝体发酵的新型培养基配方和优化方法
技术领域
:本发明涉及一种灵芝菌丝体发酵的新型培养基配方和优化方法。属生物制药生产
技术领域

背景技术
:真菌入药在我国有悠久的历史,从我国最早的药物书《神农本草经》及以后的其他许多本草均有记载,如灵芝、茯苓、虫草等等,至今仍广泛应用。大量药用真菌都富含多种药用或保健功能组分,如多糖、三萜类、糖肽等,它们在提高人体免疫力、抑制肿瘤、治疗心血管疾病、抗病毒等诸多方面起着重要的生物活性作用。灵芝是一种珍贵传统药用真菌,具有双向免疫调节、降血脂、抗衰老和抗肿瘤等多种作用,这些功能来自于灵芝的多种生物活性物质,灵芝多糖就是其中的主要成分。灵芝多糖广泛应用在医药、食品等领域,市场需求量与日俱增。目前,灵芝多糖的生产几乎都是从子实体中提取。由于药用菌子实体生物活性物质含量和质量受产地环境、栽培基质等影响,导致从子实体中提取活性成分难度大、生产周期长、成本高等问题。而通过灵芝菌丝体的发酵技术进行工业化生产,规模化提取灵芝的生物活性功能组分,则为解决以上问题提供了崭新的途径。液体发酵技术属于现代生物技术之一。深层发酵技术直接生产食用菌菌体,同时获得富含氨基酸等营养成分的发酵液。食用菌液体深层发酵技术研究的关键是培养基。不同食用菌要用不同的培养基进行培养,因此,培养基的选择与配制是食用菌液体深层发酵技术的关键。培养基配方的合理性,直接影响到发酵产率和生产成本。根据培养基组成的不同,可分为天然培养基和合成培养基。天然培养基的组成均为天然有机物,合成培养基则是采用一些己知化合成分的营养物质作为培养基,无论哪一种培养基,其组成都离不开碳源、氮源、无机盐、微量元素、维生素和生长素等。目前,食用菌的深层液体发酵生产主要是采用了抗生素生产的工艺和设备,其工艺大致是母种——一级种子——二级种子——发酵罐深层发酵。药用菌菌丝体发酵的的培养基的组分结构很大程度上还沿用了氨基酸和抗生素发酵的配方。灵芝多糖发酵的培养基组分主要由碳源、氮源和无机盐等物质组成,一些微量因子对灵芝发酵的也有重要作用。目前,研究和生产上灵芝常规的培养基配方中碳源多为葡萄糖、蔗糖或果糖,氮源为酵母膏、玉米粉或豆饼粉,无机盐为MgS04、K2HP04等。这种常规培养基中的碳源成本较高,微量因子缺乏,对提高灵芝多糖发酵产量不利。
发明内容针对现有技术中存在的不足之处,本发明提供一种生产成本较低,微量因子丰富,营养结构合理的能有效提高灵芝多糖发酵产量的灵芝菌丝体发酵的新型培养基配方和优化方法。本发明为达到以上目的,是通过这样的技术方案来实现的提供一种灵芝菌丝体发酵的新型培养基配方,各组分最适质量分数为-苦荞麦0,8%—2.0%,薏苡栏0.5%—2.5%、葡萄糖0.5%—2.0°%,黄豆粉0.5%—3.0%,酵母膏0.1%—0.5%,磷酸二氢钾0.01%—0.2°%,硫酸镁0.01%—0.1%,水98.08%—89.70%,pH自然。所述的灵芝菌丝体发酵的新型培养基配方的优化方法是-1).确定灵芝菌种(f磨ofe擺2wc油历)2).确定常规培养基的最适配方(配方l)在先期的试验基础上,选择葡萄糖为碳源,豆饼粉和酵母膏为氮源,以磷酸二氢钾和硫酸镁为无机盐,通过四因素三水平的正交试验,观察胞外多糖的产量,进行常规培养基配方选择。3).确定荞麦培养基最佳配方(配方2)在配方l的基础上,以苦荞麦粉部分地替代葡萄糖,确定荞麦粉的最适添加分别以0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%等8个水平的苦荞麦粉替代葡萄糖,观察随着苦荞麦粉比重在配方中的变化对多糖发酵的影响,最后确定苦荞麦粉添加量。4).确定薏苡茌培养基最佳配方(配方3)在配方l的基础上,以薏苡芒粉部分地替代葡萄糖,确定荞麦粉的最适添加分别以0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1,5%、2.0%、2.5%等8个水平的薏苡芒粉替代葡萄糖,观察随着荞麦粉比重在配方中的变化对多糖发酵的影响,最后确定薏苡芒添加量5).确定在配方l中同时添加荞麦和薏苡茌两种新原料后的培养基最佳配方(配方4)。参照配方2和配方3的过程中苦荞麦和薏苡芒各自对灵芝多糖产量的影响走势,设计19(34)正交试验表,4个影响因素分别为苦荞麦(因素A)、薏苡茌(因素B)、黄豆粉(因素C)、酵母膏(因素D),每个因素设3个添加量水平。从正交实验结果观察产生的胞外多糖产量产量最大的发酵培养基,确定最佳配方4。6).优化后的最终配方(配方5)。在配方4的基础上,微调葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁三种组分的比重,观察记录多糖产量,确定该培养基最终的新型培养基配方(配方5)。原理灵芝菌丝体具有丰富的酶系,能在发酵过程中利用多种粗粮类底物,而一些粗粮类的底物中的大量的活性因子又可以被这些酶系吸收,转入代谢产物中,并剌激一些活性组分的大量产生。苦养麦粉除含碳水化合物以外,还含有19种氨基酸,比例接近鸡蛋的氨基酸组成。其维生素的含量极为丰富,维生素B和烟酸显著高于大米。此外,苦荞麦中含有丰富的被称作维生素P的黄酮类化合物,还含有多种矿物质营养元素,其中镁元素含量极高,钾含量分别是小麦粉的2倍、大米的23倍,铁元素含量是大米的3倍4倍,还含有其它谷类中不具备的人体必需的微量元素一硒。薏苡芒的营养价值很高,含蛋白质16.2%,脂肪4.65%,碳水化合物79.1%,还富含多种维生素、氨基酸、薏苡素、薏苡脂、三萜化合物等,这些微量因子对灵芝菌丝生长和灵芝发酵产物清除自由基有重要的促进作用。是刺激药用菌丝体多糖和三萜类物质生成的特殊功效因子。优点1、以苦荞麦、薏苡茌原料作为碳源的主体,既降低了培养基的成本又丰富了底物营养结构。2、以苦荞麦、薏苡芒原料形成的复合型碳源的底物配方,在生产中,操作方便,发酵中活性组分产量、灵芝多糖产量明显提高。3、以苦荞麦、薏苡芒的可溶性淀粉部分替代单糖和双糖为碳源。同时加入对发酵结果产生明显影响的辅助成分,明显改善了发酵液物理条件7的表面活性。具体实施方式实施例l、1).选用代号为"赤芝6号"(fe/70^27Z7ah"^/ZZ)的灵芝菌种,由浙江省林业科学研究院保存。2).确定常规培养基的最适配方(配方l)在先期的试验基础上,选择葡萄糖为碳源,豆饼粉和酵母膏为氮源,以磷酸二氢钾和硫酸镁组合为分析因素,通过四因素三水平的正交试验,观察胞外多糖的产量,进行常规培养基配方选择。发酵条件为接种量为10%,在250ffll三角瓶中装液量80ml,在转速为180r/min、温度为28。C的恒温摇床中培养7天,pH自然。多糖的提取方式为发酵完成后,将发酵液离心去除菌丝体,上清液以3倍体积的95%乙醇浸提1次,真空干燥后获胞外粗多糖,称量。四因素三水平正交试验完成后,确定常规的培养基配方(简称配方l)各组分最适质量分数为葡萄糖3.5%,黄豆粉1.0%,酵母膏0.2%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,水95.15%,pH自然。用配方l进行灵芝液体发酵,其胞外粗多糖产量为1.65g/L。3).确定苦荞麦培养基最佳配方(配方2)在配方l的基础上,以苦荞麦粉部分地替代葡萄糖,确定苦荞麦粉的最适添加量。分别以0.1%、0.3%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%等8个水平的苦荞麦粉替代葡萄糖,观察随着苦荞麦粉比重在配方中的变化对多糖发酵的影响,最后确定当苦荞麦粉添加量为1.0%时,灵芝液体发酵的胞外粗多糖产量最高,达至'j2,12g/L。因此,配方2各组分质量分数为苦荞麦粉1.0%,葡萄糖2.5%,黄豆粉1.0%,酵母膏0.2%,磷酸二氢钾O.l%,硫酸镁0.05%,水95.15%,pH自然。4).确定薏苡芒培养基最佳配方(配方3)在配方l的基础上,以薏苡栏粉部分地替代葡萄糖,确定荞麦粉的最适添加分别以0.1%、0,3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%等8个水平的薏苡茌粉替代葡萄糖,观察随着薏苡芒比重在配方中的变化对多糖发酵的影响,最后确定当薏苡芒添加量为1.5%时,灵芝液体发酵的胞外粗多糖产量最高,达至廿2.33g/L。因此,配方3各成分质量分数为薏苡栏1.5%,葡萄糖2.0%,黄豆粉1.0%,酵母膏0.2%,磷酸二氢钾0.1Q^,硫酸镁0.05%,水95.15%,pH自然。5).确定在配方l中同时添加苦荞麦和薏苡芒两种新原料后的培养基最佳配方(配方4)。参照配方2和配方3的过程中苦荞麦和薏苡栏各自对灵芝多糖产量的影响走势,设计"(34)正交试验表,4个影响因素分别为苦荞麦(因素A)、薏苡芒(因素B)、黄豆粉(因素C)、酵母膏(因素D),它们的添加量水平分别如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从实验结果可知,A^CA组合的发酵培养基胞外多糖产量达2.78,产量最大,因此,配方4的最佳组分应为苦荞麦1.0%、薏苡芒1.00%、葡萄糖1.5%,黄豆粉1.2%,酵母膏0.1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,水95.05%,pH自然。6).优化后的最终配方(配方5)。在配方4的基础上,微调葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁三种组分的比重,观察记录多糖产量,最高产量达3.36g/L,与常规培养基配方(配方l)的产量1.65g/L相比,提高了一倍以上。"赤芝6号"的灵芝菌种(fe/700fe/T^A/C2V〃历)的发酵培养基最终的新型培养基配方(配方5)为苦荞麦1.0%、薏苡芒1.0%、葡萄糖1.8%,黄豆粉1.2%,酵母膏0.1%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.02%,水94.83%。实施例2、1).选用代号为"赤芝18号"的灵芝菌种(fe7^flfe力腿7"cid加),由浙江省林业科学研究院保存。2).确定常规培养基的最适配方(配方l)在先期的试验基础上,选择葡萄糖为碳源,豆饼粉和酵母膏为氮源,以磷酸二氢钾和硫酸镁为无机盐,通过四因素三水平的正交试验,观察胞外多糖的产量,进行常规培养基配方选择。发酵条件为接种量为10%,在250ml三角瓶中装液量80ml,在转速为180r/min、温度为28。C的恒温摇床中培养7天,pH自然。多糖的提取方式为发酵完成后,将发酵液离心去除菌丝体,上清液以3倍体积的95%乙醇浸提1次,真空干燥后获胞外粗多糖,称量。四因素三水平正交试验完成后,确定常规的培养基配方(简称配方l)各组分最适质量分数为葡萄糖3.0%,黄豆粉1.8%,酵母膏0.1%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.03%,水95.02%,pH自然。用配方l进行灵芝液体发酵,其胞外粗多糖产量为1.04g/L。3).确定苦荞麦培养基最佳配方(配方2)在配方l的基础上,以苦荞麦粉部分地替代葡萄糖,确定荞麦粉的最适添加分别以0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%等8个水平的苦荞麦粉替代葡萄糖,观察随着苦荞麦粉比重在配方中的变化对多糖发酵的影响,最后确定当苦荞麦粉添加量为1.5%时,灵芝液体发酵的胞外粗多糖产量最高,达至Ul.36g/L。因此,配方2各组分质量分数为苦荞麦粉1.5%,葡萄糖1.5%,黄豆粉1.8%,酵母膏0.1%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.05%,水95.02%,pH自然。4).确定薏苡芒培养基最佳配方(配方3)在配方l的基础上,以薏苡芒粉部分地替代葡萄糖,确定薏苡栏粉的最适添加量。分别以0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%等8个水平的薏苡茌粉替代葡萄糖,观察随着薏苡栏比重在配方中的变化对多糖发酵的影响,最后确定当薏苡茌添加量为1.0%时,灵芝液体发酵的胞外粗多糖产量最高,达至廿1.23g/L。因此,配方3各成分质量分数为薏苡栏粉1.0%,葡萄糖2.0%,黄豆粉1.8%,酵母膏0.1%,磷酸二氢钾0.05,硫酸镁0.03%,水95.02%,pH自然。5).确定在配方l中同时添加苦荞麦和薏苡芒两种新原料后的培养基最佳配方(配方4)。参照配方2和配方3的过程中苦荞麦和薏该芒各自对灵芝多糖产量的影响走势,设计"34)正交试验表,4个影响因素分别为苦荞麦(因素A)、薏苡芒(因素B)、黄豆粉(因素C)、酵母膏(因素D),它们的添加量水平分别如下影响因素水平l(%)水平2(%)水平3(%)苦荞麦(A)1.01.52.0薏苡栏(B)0.81.01.2黄豆粉(C)1.01.82.4酵母膏(D)0.10.20.3从实验结果可知,A^dD2组合的发酵培养基胞外多糖产量达1.78,产量最大,因此,配方4的最佳组分应为苦荞麦1.0%、薏苡芒1.2%、葡萄糖0.8%,黄豆粉1.0%,酵母膏0.2%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.03%,水95.72°%,pH自然。6).优化后的最终配方(配方5)。在配方4的基础上,微调葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁三种组分的比重,观察记录多糖产量,最高产量达2.11g/L,与常规培养基配方(配方l)的产量1.04g/L相比,提高了一倍以上。灵芝菌种"赤芝18号"(fe加0fei7^2"cjW腿)的发酵培养基最终的新型培养基配方(配方5)为苦荞麦1.0%、薏苡茌1.2%、葡萄糖1.0%,黄豆粉1.0%,酵母膏0.3%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.1%,水95.35%,pH自然。最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的两个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。权利要求1.一种灵芝菌丝体发酵的新型培养基配方和优化方法,其特征在于各组分最适质量分数为苦荞麦0.8%--2.0%,薏苡芢0.5%--2.5%、葡萄糖0.5%--2.0%,黄豆粉0.5%--3.0%,酵母膏0.1%--0.5%,磷酸二氢钾0.01%--0.2%,硫酸镁0.01%--0.1%,水98.08%--89.70%,pH自然。2.—种按照权利要求1所述的灵芝菌丝体发酵的新型培养基配方的优化方法,其特征在于1)确定灵芝菌种;2)确定常规培养基的最适配方1在先期的试验基础上,选择葡萄糖为碳源,豆饼粉和酵母膏为氮源,以磷酸二氢钾和硫酸镁为无机盐,通过四因素三水平的正交试验,观察胞外多糖的产量,进行常规培养基配方选择;3)确定荞麦培养基最佳配方2在配方l的基础上,以苦荞麦粉部分地替代葡萄糖,确定荞麦粉的最适添加量,分别以0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%等8个水平的苦荞麦粉替代葡萄糖,观察随着苦荞麦粉比重在配方中的变化对多糖发酵的影响,最后确定苦荞麦粉添加量;4)确定薏苡茌培养基最佳配方3在配方l的基础上,以薏苡芒粉部分地替代葡萄糖,确定荞麦粉的最适添加量,分别以0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%等8个水平的薏苡芒粉替代葡萄糖,观察随着荞麦粉比重在配方中的变化对多糖发酵的影响,最后确定薏苡芒添加量;5)确定在配方l中同时添加荞麦和薏孩茌两种新原料后的培养基最佳配方4参照配方2和配方3的过程中苦荞麦和薏苡芒各自对灵芝多糖产量的影响走势,设计"(34)正交试验表,4个影响因素分别为苦荞麦(因素A)、薏苡芒(因素B)、黄豆粉(因素C)、酵母膏(因素D),每个因素设3个添加量水平,从正交实验结果观察产生的胞外多糖产量产量最大的发酵培养基,确定最佳配方4;6)优化后的最终配方5在配方4的基础上,微调葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁三种组分的比重,观察记录多糖产量,确定该培养基最终的新型培养基配方5。全文摘要本发明涉及生物制药生产技术,具体地说是一种灵芝菌丝体发酵的新型培养基配方和优化方法,按质量百分比计,其成分由苦荞麦0.8%-2.0%,薏苡芢0.5%-2.5%、葡萄糖0.5%-2.0%,黄豆粉0.5%-3.0%,酵母膏0.1%-0.5%,磷酸二氢钾0.01%-0.2%,硫酸镁0.01%-0.1%,水98.08%-89.70%;其优化方法按以下顺序操作确定灵芝菌种;确定常规培养基的最适配方1;确定荞麦培养基最佳配方2;确定薏苡芢培养基最佳配方3;确定在配方1中同时添加荞麦和薏苡芢两种新原料后的培养基最佳配方4;优化后的最终配方5。其目的在于提供一种生产成本较低,微量因子丰富,营养结构合理的能有效提高灵芝多糖发酵产量的灵芝多糖发酵的新型培养基配方和优化方法。文档编号C05F11/00GK101560118SQ20091000791公开日2009年10月21日申请日期2009年2月26日优先权日2009年2月26日发明者李卫旗申请人:浙江大学
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