专利名称：一种防治农作物细菌性病害的菌剂及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种防治农作物细菌性病害的菌剂及 其制备方法与应用。
背景技术：
近年来，我国农业迅速发展，随着集约化种植程度的提高， 一些常见细菌 性病害变得更加流行和顽固起来，过去行之有效的办法现在效果不佳，甚至以 往所谓的敏感药物也治疗无效。细菌性病害是由细菌病菌侵染所致的病害，如 水稻白叶枯病、软腐病、溃疡病、青枯病等，导致了农业生产的重大损失。特
别是水稻白叶枯病是水稻的三大病害之一，我国常年发生面积在1000万亩以 上， 一般减产10% 20%，严重者减产达50%。由于引起农作物细菌性病害的 的病原菌种类多，寄主范围广，对环境的适应力强，存活方式多样，所以防治 难度大。目前，相对于防治真菌性病害的农药药剂品种来说，防治农作物细菌 性病害的农药种类还比较少，现有农药品种如农用链霉素、叶青双和无机铜制 剂(氢氧化铜、硫酸铜、氧氯化铜、氧化亚铜)等药剂的防治效果一般也比较 差，抗性产生快，且污染严重，带来了严峻的"3R"问题，农产品安全性难以得 到保证。因此，细菌性病害己经成为农业可持续发展亟待解决的问题之一。
生物农药是防治农作物细菌性病害的有效方法，通过操纵管理农作物根际 土壤微生态环境，消灭病原菌，形成稳定、平衡的根际土壤生态系统，经过多 年探索，已经发现了用于防治农作物病害的生物农药，例如利用木霉菌来防治 恶苗病、细菌性谷枯病及细菌性立枯病；利用链霉菌产生的抗生素井冈霉素防 治小麦和水稻纹枯病；利用枯草芽孢杆菌防治水稻纹枯病、番茄叶霉病、大豆 根腐病、苹果霉心病、棉花立枯病和棉花枯萎病等。但是目前生物农药多用于 防治真菌性病害，而且只对病菌有抑菌作用，而无杀菌作用，因此无法使病害 消失。
具有寄生特性的蛭弧菌是一种近年来研究的用于消除环境病原菌的有效工 具，它以细菌为宿主，能够裂解消除病原菌，且裂解谱广泛，定植能力强，繁 殖快，利用它作为环境中的天然生物改良剂和"活性抗生素"，在防治农作物细菌性病害中具有广阔的发展前景。到目前为止，已经开发出蛭弧菌应用于水产 养殖中病原菌消除的产品，但尚未见蛭弧菌用于防治农作物细菌性病害的有效 方法。
发明内容
为了克服现有技术中未有利用蛭弧菌有效防治农作物细菌性病害的不足之 处，本发明的首要目的在于提供一种高效、无毒无副作用的防治农作物细菌性 病害的菌剂。
本发明的另一目的在于提供上述菌剂的制备方法。 本发明的再一 目的在于提供上述菌剂的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现 一种防治农作物细菌性病害的菌剂， 包含蛭弧菌和寡糖。
所述防治农作物细菌性病害的菌剂，优选每升溶液中含106 1012pfii (plaque-forming units,噬菌斑形成单位)的蛭弧菌和10 30g寡糖；
所述蛭弧菌优选为在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2009年8 月7日、保藏编号为CCTCC NO: M 209169的蛭弧菌(S^fe〃ov^n'o sp.)BDSOl、 保藏日期为2009年8月7日、保藏编号为CCTCC NO:M 209170的蛭弧菌 G5Je〃oW6r/osp.)BDS02或保藏日期为2009年8月7日、保藏编号为CCTCC NO:M 209171的蛭弧菌(3^//ov沾n》sp.) BDSM08中的至少一株；
所述蛭弧菌更优选蛭弧菌(BcM/ovAn'osp.) BDS01与蛭弧菌(Btfe/Zov/^/o sp.) BDSM08以细菌数比1:1混合；
所述寡糖优选为壳寡糖、琼胶寡糖、葡聚寡糖、褐藻胶寡糖或低聚麦芽糖
中的至少一种；
所述防治农作物细菌性病害的菌剂的制备方法，包括以下步骤将蛭弧菌 用DNB培养基、水、生理盐水或0.2mol/LpH值为7.2 7.6的磷酸盐缓冲液 调整浓度为1()S l(^pfU/L后加入寡糖，寡糖的加入量为10 30g/L，混匀， 得到防治农作物细菌性病害的菌剂；
所述蛭弧菌优选为蛭弧菌BDS01、蛭弧菌BDS02或蛭弧菌BDSM08中的 至少一株；
所述蛭弧菌优选通过申请号"200710031166.X"，名称为"高密度蛭弧菌游 泳体的发酵培养技术"国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方 法进行培养；
5所述的蛭弧菌优选为由蛭弧菌BDS01与蛭弧菌BDSM08分别按照申请号 "200710031166.X",名称为"高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术"国家发明 专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵培养，发酵液按细菌 数l:l混合而得；
所述寡糖为壳寡糖、琼胶寡糖、葡聚寡糖、褐藻胶寡糖或低聚麦芽糖中的 至少一种；
所述防治农作物细菌性病害的菌剂的应用，是将所述防治农作物细菌性病 害的菌剂喷洒植株的茎、叶、穗、果实或灌根淋根；
所述防治农作物细菌性病害的菌剂中蛭弧菌的含量至少为103pfo/mL，优 选105 109pfo/mL;
所述防治农作物细菌性病害的菌剂喷洒植株的茎、叶、穗或果实，用量最 少为80mL / m2，优选用量为100 200mL / m2;
所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于灌根淋根，用量最少为lOOmL /株， 优选用量为150 250mL /株；
所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于防治十字花科蔬菜软腐病、黑腐病、 根腐病，使用方法为灌根淋根或喷洒茎叶；
所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于防治黄瓜和豆科植物细菌性角斑 病，使用方法为灌根淋根、喷洒茎、叶或果实；
所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于防治茄科蔬菜青枯病、软腐病、溃 疡病，使用方法为灌根淋根、喷洒茎、叶或果实；
所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于防治禾本科农作物细菌性条斑病、 白叶枯病，使用方法为喷洒茎、叶或穗。
本发明的原理蛭弧菌以细菌为宿主，能够裂解消除病原菌，且裂解谱广 泛，定植能力强，繁殖快。寡糖能够与农作物植株信号转导分子结合，是植物 获得性抗病诱导剂，使植株获得系统、长久、广谱的抗性。本发明在使用蛭弧 菌消除病原菌的同时，添加能够提高农作物获得性抗性的寡糖，使防效更加稳 定持久，解决了过去采用抗菌素防治细菌性病害带来的药残及抗性等问题。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果
l.本发明首次将蛭弧菌应用于农作物细菌性病害的防治，填补国内外蛭弧
菌研究开发的空白，增加了生物农药的新种类。蛭弧菌具有裂解谱广，生长迅 速的特点，对多种细菌病原菌具有优异的消灭能力。寡糖与之联用后，增强农 作物抗性，药效大幅提高，扩大了细菌性病害的防治谱，从而高效防治茄科、十字花科、豆科和单子叶农作物细菌性条斑病、角斑病、溃疡病、软腐病、白
叶枯病等病害。试验表明，用于防治黄瓜角斑病，施药10天后防效达到87.5%， 优于20%噻森铜防效(如图3所示)。
2.本发明所制备的菌剂无毒，无污染，对农作物病虫害天敌安全，而且病 原菌基本不对其产生抗性。作为生物制剂，不产生药害，克服了抗生素滥用带 来"3R"问题，也避免了当前化学农药污染严重，破坏生态平衡，危害天敌的 弊端。本发明所制备的菌剂在裂解完宿主细菌后，蛭弧菌会因饥饿而自动消亡， 因此对人和动物无毒副作用，提高农产品品质和安全性，符合人民对食品健康 绿色的需求和农业生产可持续发展的要求。
图1是实施例1制备的菌剂防治水稻白叶枯病效果图。 图2是实施例2制备的菌剂防治水稻条斑病效果图。 图3是实施例3制备的菌剂防治黄瓜角斑病效果图。 图4是实施例4制备的菌剂防治番茄溃疡病效果图。 图5是实施例5制备的菌剂防大白菜软腐病效果图。 图6是实施例6制备的菌剂防茄子青枯病效果图。 图7是实施例7制备的菌剂防大白菜黑腐病效果图。 图8是实施例8制备的菌剂防西葫芦根腐病效果图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。
实施例l 防治水稻白叶枯病 (1)蛭弧菌菌液的制备
蛭弧菌液的发酵方法采用申请号"200710031166.X",名称为"高密度蛭弧 菌游泳体的发酵培养技术"国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发 酵方法进行分别在3个装有100mL LB (Luria-Bertani)液体培养基的锥形 瓶中接种嗜水气单胞菌(^eramom^ ^&op/^7fl，购于广东省微生物所菌种保藏 中心，编号GIMU72) ， 200rpm、 28匸摇床培养18小时，培养液分别于4。C、 8000rpm离心10min，弃上清。分别将沉淀加入到3个装有lOOraLDNB液体培 养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物O.lg， NaC130g，溶
7于lOOOmL蒸馏水中，pH值为7.2 7.6)的锥形瓶中，再分别接入蛭弧菌BDS01 (从双层平板上挑菌斑接入)、蛭弧菌BDS02 (从双层平板上挑菌斑接入)和 蛭弧菌BDSM08 (从双层平板上挑菌斑接入)恒温摇床250 rpm、 28 。C培养36 h。培养液分别于《C 6000卬m离心20min，取上清液，再将上清液分别于4°C 16000rpm离心20min，保留沉淀，加入无菌的DNB重新悬浮蛭弧菌沉淀物， 制成浓度为109 pfii / mL的蛭弧菌液。
蛭弧菌BDS01自泥样中分离得到，于2009年8月7日保藏于中国武汉市 武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M209169。对 其进行负染后于电子显微镜下形态观察蛭弧菌BDS01呈单细胞，弧形，大小 为0.9x0.25pm，端生鞭毛，鞭毛长度为4Mm;将其以双层平板法于28"C培养四 天可形成直径l-2mm的透明圆形噬菌斑。
蛭弧菌BDS02自泥样中分离得到，于2009年8月7日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO: CCTCCM 209170。对其进行负染后 于电子显微镜下形态观察蛭弧菌BDS02呈单细胞，弧形，大小为0.65x0.2pm， 端生鞭毛，鞭毛长度至少1.8tai;将其以双层平板法于28'C培养四天可形成直 径l-2mm的透明圆形噬菌斑。
蛭弧菌BDSM08由蛭弧菌BDS01进行紫外诱变得到，于2009年8月7曰 保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M209171。对其进行负染后于电子显微镜下形态观察蛭弧菌BDSM08呈 单细胞，弧形，大小为1.8xl.0)im,端生鞭毛，鞭毛长度为3.2pm;将其以双层 平板法于28'C培养三天可形成直径2-3mm的透明圆形噬菌斑。
(2) 防治农作物细菌性病害的菌剂的制备
将蛭弧菌BDSOl、蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDSM08的菌液分别用水调节 至107pfb / mL，分别加入壳寡糖使之浓度为30g / L，用磁力搅拌器震荡30s， 得到防治农作物细菌性病害的菌剂A、 B和C。
(3) 应用步骤(2)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂防治水稻白叶枯
病
施用菌剂对水稻白叶枯病进行防治试验田位于广州市天河区岑村水稻田， 肥力中等，试验所用水稻品种为晚稻协优85。水稻处于拔节期，试验田块为常 发病田块。试验期间日平均气温22.1 29.5。C，相对湿度90 95%。随机选择小 区，每个小区2m2，每小区种植水稻20穴。清水设三个小区，作为空白对照，对 照药剂为20%噻森铜稀释500倍液。在白叶枯病发病初期，即稻田出现零星病斑时按小区分别施用步骤(3)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂A、 B、 C和对 照药剂，用量分别为120mL/m2，使用手压喷雾器喷雾茎叶，叶面和叶背都均 匀喷到，每个处理2个重复小区。以后每隔10d喷洒l次，连续3次。第3次施药 后第7d、 14d和21d査防治效果。五点取样，每个取样点选取2株水稻，每株选取 旗叶及旗叶以下两片叶，参照农药田间药效试验准则进行试验调查和计算防效。 防效计算公式为
病情指数-[i:(各级病叶数x相对级数值)/(调查总数x9)]x100 防治效果(％)=[(空白对照区病情指数-处理区病情指数)/空白对照区 病指指数]xlOO
试验显示，对照组水稻白叶枯病蔓延迅速，沿叶脉一侧或两侧或中脉发展 成波纹状的黄绿或灰绿色病斑；5 7d后病斑转为灰白色，叶片向内巻曲。14d 后少数严重者全株枯死。使用蛭弧菌防治水稻白叶枯效果显著，施用蛭弧菌-寡 糖后仅在第一天出现少量病斑，2d后，病斑不再扩大，病情得到控制，以后病 害几乎不再发展。蛭弧菌BDSOl、蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDSM08分别与壳 寡糖联用喷药21d后的防效分别为72.3%、 68.7%、 74.1%，均优于20%噻森铜 500倍液的防效(60.4%)，防治效果如图l所示。所有处理均不见药害产生， 植株挺拔健壮，叶子舒展，长势良好，生长状况优于喷洒20%噻森铜500倍液。
实施例2防治水稻条斑病
(1) 蛭弧菌菌液的制备，同实施例l步骤(1)。
(2) 防治农作物细菌性病害的菌剂的制备
将蛭弧菌BDSOl、蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDSM08分别按细菌数1:1两 两(即BDS01与BDS02， BDS01与BDSM08， BDS02与BDSM08)混合，并 向每升混合菌液中分别加入15g琼胶寡糖与15g葡聚寡糖，用磁力搅拌器震荡 30s，得到防治农作物细菌性病害的菌剂A、 B和C;
将蛭弧菌BDSOl、蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDSM08按细菌数1:1:1混合， 在每升混合菌液中加入15g琼胶寡糖与15g葡聚寡糖，用磁力搅拌器震荡30s, 得到菌剂D。
(3) 应用步骤(2)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂防治水稻条斑病 施用菌剂对水稻条斑病进行防治试验田位于广州市天河区岑村水稻田，
肥力中等，试验所用水稻品种为晚稻协优85。水稻处于拔节期，试验田块为常 发病田块。试验期间日平均气温22.1 29.5。C，相对湿度90 95%。随机选择小区，每个小区2m2，每小区种植水稻20穴。清水设三个小区，作为空白对照。对 照药剂为20%噻森铜500倍液，在条斑病发病初期，即稻田出现零星病斑时按小 区分别施用步骤(3)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂A、 B、 C、 D和对照 药剂，用量分别为120mL/m2，使用手压喷雾器喷雾茎叶，叶面和叶背都均匀 喷到，每个处理2个重复小区。以后每隔7d喷洒1次，连续3次。第3次施药后第 7d、 14d和21d査防治效果。五点取样，每个取样点选取2株水稻，每株选取旗叶 及旗叶以下两片叶，参照农药田间药效试验准则进行试验调査和计算防效。
试验显示，对照组水稻条斑病病蔓延迅速，叶脉间病斑增多，5-10d内病 斑初呈暗绿色水渍状，后呈黄褐色至红褐色，长度从0.5mm扩大到lcm。 14d 后少数严重者出现菌脓。使用蛭弧菌-寡糖防治水稻条斑病效果显著，所有处理 仅在第一天出现少量病斑，2d后，病斑不再扩大，病情得到控制，以后病害几 乎不再发展。如图2所示，菌剂D (即BDSOl、 BDS02与BDSM08三种菌液 1:1:1混合，并添加琼胶寡糖、葡聚糖各15g/L)在喷药21d后的防效为81.8%， 优于20%噻森铜500倍液(75.3%)，菌剂B (即BDS01与BDSM08菌液1:1 混合，并添加琼胶寡糖、葡聚糖各15g/L)在喷药14d后的防效为82.4"5/。，喷药 21d后防效为84.6。/。，优于其他三种菌剂及20%噻森铜500倍液，防效最好。菌 剂A、 B、 C、 D对水稻的处理均不见药害产生，植株挺拔健壮，叶子舒展，长 势良好，生长状况优于喷洒20%噻森铜500倍液。
实施例3 防治黄瓜细菌性角斑病
(1) 蛭弧菌菌液的制备，同实施例l步骤(1)。
(2) 防治农作物细菌性病害的菌剂的制备
将蛭弧菌BDS01菌液和蛭弧菌BDSM08菌液按细菌数1:1混合，用生理 盐水稀释，浓度分别为103pfU/mL、 105pfti/mL、 107pfb / mL和109pfU / mL 四个浓度等级，接着分别在不同浓度的蛭弧菌溶液中，每升混合菌液加入10g 壳寡糖和20g葡聚寡糖，用磁力搅拌器震荡30s，得到防治农作物细菌性病害的 菌剂A、 B、 C和D;将蛭弧菌BDSOl 、 BDS02、和BDSM08菌液按细菌数1:1:1 混合，用生理盐水稀释，浓度分别为103pfu/mL、 105pfU/mL、 107pfo/mL 和10、fU/mL四个浓度等级，接着分别在不同浓度的蛭弧菌溶液中，每升混合 菌液中加入10g琼胶寡糖和20g褐藻胶寡糖，用磁力搅拌器震荡30s，得到防 治农作物细菌性病害的菌剂E、 F、 G和H。
(3) 应用步骤(2)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂防治黄瓜角斑病
10施用菌剂对黄瓜苗期角斑病进行防治试验试验在广州白云区良田镇大棚 内进行，供试品种为宝杨五号老黄瓜。随机选择小区，每个小区3m2，每小区 种植黄瓜10株。当黄瓜长至3 4片真叶时，正值阴雨天气，大棚内温度高湿 度大，试验期平均温度22.8 26.3T:，相对湿度为97 100%，大棚内黄瓜苗开 始有零星角斑病出现。清水设三个小区，作为空白对照。对照药剂为20%噻森 铜200倍液，在角斑病发病初期，即出现零星病斑时按小区分别施用步骤(3) 制备的防治农作物细菌性病害的菌剂A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H和对照药剂， 用量分别为120mL / m2，使用使用手压喷雾器喷雾茎叶，叶面和叶背都均匀喷 到，每个处理2个重复小区。以后每隔10d灌施1次，连续3次。第3次喷 药后5d、 10d和15d后调查防效。五点取样，每个取样点选取一株黄瓜幼苗， 每株黄瓜选取上、中两片叶子，参照农药田间药效试验准则进行试验调查和计 算防效。
施药后，对照组发病率持续上升，病斑增加扩大，沿叶脉蔓延呈六角形， 叶背部出现菌脓，严重者叶片穿孔，干枯脱落，植株死亡。而第2次施用蛭弧菌 混合液2d后，施用混合蛭弧菌液组病斑不再扩大，新病斑产生少，黄瓜苗长势 良好，仅是低浓度(蛭弧菌含量10 fo/mL)的混合液产生相对多的新病斑， 但病斑发展缓慢，病情不严重。且蛭弧菌浓度为10ifb/mL的高浓度混合液施 用两次后未见药害产生。试验表明，效果最优的为菌剂C，菌剂C施用10d和15d 后防效分别为87.5%和85.3%，防效略高于菌剂G和2(P/。噻菌铜200倍液，如图3 所示。
实施例4 防治番茄溃疡病
(1) 蛭弧菌菌液的制备，同实施例l步骤(1)。
(2) 防治农作物细菌性病害的菌剂的制备
将蛭弧菌BDS01菌液和蛭弧菌BDSM08菌液按细菌数1:2混合，用磷酸 盐缓冲液(0.2 mol/L， pH7.2 7.6)调整菌液浓度为107pfii/mL，在每升混 合菌液中加入12g壳寡糖和18g褐藻胶寡糖，用磁力搅拌器震荡30s，得到防 治农作物细菌性病害的菌剂A;将蛭弧菌BDSOl、 BDS02、和BDSM08菌液按 细菌数1:1:2混合，用磷酸盐缓冲液调整菌液浓度为107pfo/mL，在每升混合 菌液中加入12g琼胶寡糖和18g葡聚寡糖，用磁力搅拌器震荡30s，得到防治 农作物细菌性病害的菌剂B。
(3) 应用歩骤(2)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂防治番茄溃疡病用金氏B (KB)固体培养基培养番茄溃疡病病原菌密执安棍状杆菌 (C/av化acfer m!'cWga"erafs)(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC， 菌株号CGMCC 1.1909)，在27'C培养24h后将菌苔刮下，稀释成浓度为107 1()ScfU/mL单位的菌悬液，待用。
施用菌剂对番茄溃疡病进行防治试验试验在广州白云区良田镇大棚内进 行，供试品种为佳红4号。试验期平均温度22.8 26.3-C，相对湿度为100%。随 机选择小区，每个小区3m2，每小区种植番茄10株。对照药剂为20%噻菌铜300 倍液，清水设三个小区，为空白对照。番茄坐果期将0.5 lcm完好幼果用保鲜 袋套住，袋口用细绳系牢。待番茄长至直径2 3cm时，解开保鲜袋。用手压喷 雾器喷洒植株密执安杆菌菌悬液100mL/m2，使整个植株表面湿润，自然晾干 后将步骤(3)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂A、 B和对照药剂按小区用 手压喷雾器均匀喷洒植株，用量分别为180mL/m2。隔8天再喷药一次，连喷2 次。第2次喷药后7d、 14d和21d调査病果率和发病程度，参照农药田间药效试验 准则进行试验调査和计算防效。
接种ld-2d，各组均出现新的溃疡病病斑，但是处理组明显少于对照组，5d 后，对照组病情蔓延加重，幼果上病部溢出菌脓，病斑向幼果内部扩展，少数 病果早落。施用菌剂组抗病力与20%噻菌铜200倍液相当，仅有少数病斑，2d 后病斑不再扩大，罕见病斑连片危害果肉。实验结果表明，菌剂A第二次施药 后14d防效为71.4%,与20%噻菌铜200倍液防效相近，且未见药害发生。在 番茄生长过程中继续使用菌剂，病害极少发生，成熟时品质优良，色泽碧绿光 滑，极少有病斑。施用菌剂的平均单果重量重于清水对照组，比清水对照组增 产32.5%。同时实验显示，菌剂B对番茄溃疡病也具有良好的防治效果，具体 防效如图4所示。
实施例5 防治大白菜软腐病
(1) 蛭弧菌菌液的制备，同实施例l步骤(1)。
(2) 防治农作物细菌性病害的菌剂的制备
将蛭弧菌BDS01菌液与蛭弧菌BDSM08菌液按细菌数1:3混合。在每升 混合菌液中加入10g壳寡糖、10g琼胶聚糖和10g低聚麦芽糖，用磁力搅拌器 震荡30s，得到防治农作物细菌性病害的菌剂A;在每升混合菌液中加入3.3g 壳寡糖、3.3g琼胶聚糖和3.3g低聚麦芽糖，用磁力搅拌器震荡30s，得到防治 农作物细菌性病害的菌剂B。(3)应用步骤(2)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂防治大白菜软腐
病
含有欧文氏菌土壤的制备用普通营养肉汤(NB)培养基，160rpm28 °C培养12 16h，增殖欧文氏菌(五rWm》sp.)(购于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，菌株号CGMCC1.1215)使菌液浓度为105cfb / mL， NB悬浮，按菌悬液与无菌土壤按重量比为l:4的比例混匀。
对大白菜软腐病进行防治试验在广州市天河区岑村进行，试验期间平均温度为22.8 26.3'C、相对湿度为100%。实验所用大白菜品种为山东2号。对照药剂为75%百菌清可湿性粉剂500倍液，清水做空白对照。采用无菌土壤温室盆栽白菜幼苗，待大白菜培育至5 6片叶时将白菜移入上述含有欧文氏菌的土壤中进行试验，每小区0.5m2，每小区20株。移栽后立即按小区用手压喷雾器喷洒步骤(3)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂A、 B和对照药剂，每个处理2个重复小区，用量分别120mL/m2。 10d后再重复施药一次。第2次施药7d、 14d和21d后观察发病情况，参照农药田间药效试验准则进行试验调査和计算防效。
施药后，对照组3d后开始出现软腐病病症，基部先发病，出现水渍状微黄色病斑，随后叶柄基部或根茎处溃烂，流出粘液，严重者腐烂死亡。处理组的发病率显著低于对照组，该组大白菜发病少，茎叶茁壮，色泽碧绿，长势良好。实验结果表明，菌剂A的效果最佳，第2次施药21d后达到82.6n/。，如图5所示。菌剂B的效果稍次，但是在大白菜生长过程中继续使用菌剂B，病害极少发生，成熟时品质优良，平均单株重量重于对照组和蛭弧菌单独使用组，与对照组相比平均单棵增重23.7%。
实施例6 防治茄子青枯病
(1) 蛭弧菌菌液的制备，同实施例l步骤(1)。
(2) 防治农作物细菌性病害的菌剂的制备
将BDS01蛭弧菌液和BDSM08蛭弧菌液按细菌数2:3混合。在每升混合菌液中加入5g壳寡糖、10g琼胶寡糖和15g褐藻胶寡糖，用磁力搅拌器震荡30s，得到防治农作物细菌性病害的菌剂。
(3) 应用步骤(2)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂防治茄子青枯病施用菌剂对茄子青枯病进行防治试验在广州市天河区岑村进行，所用茄
子品种为新龙紫长茄，试验期间平均温度为22.8 26.3'C，相对湿度为100%，对照药剂为75°/。百菌清可湿性粉剂500倍液，清水为空白对照。采用无菌土壤温室盆栽茄子幼苗，待茄子育至5 6片叶时移入大棚中，每个小区lm2，种植茄子20株。移栽后立即按小区分别用步骤(3)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂和对照药剂灌根，每株用量150ml，每个处理2个小区。隔10d再重复施药一次。第2次施药7d、 14d和21d后调查每小区病株数。参照农药田间药效试验准则进行试验调查和计算防效。
施药后，对照组3d后开始出现软腐病病症，发病植株叶片呈现萎垂，后逐渐扩展到整株枝条上。初呈淡绿色，变褐焦枯，病叶脱落或残留在枝条上。将茎部皮层剥开木质部呈褐色。严重者褐变延伸到上面枝条的木质部。枝条里面的髓部大多腐烂空心。处理组的发病率显著低于对照组，该组茄子幼苗发病少，茎叶茁壮，色泽碧绿，长势良好。实验结果表明，菌剂第2次施药21d防效达到73.5%,如图6所示。在茄子生长过程中继续使用菌剂，病害极少发生，成熟时品质优良，平均单个重量重于对照组和蛭弧菌单独使用组，与对照组相比平均单个增重10.8%。
实施例7 防治大白菜黑腐病
(1) 蛭弧菌菌液的制备，同实施例1步骤(1)。
(2) 防治农作物细菌性病害的菌剂的制备
将BDS01蛭弧菌液和BDSM08蛭弧菌液按细菌数1:4混合。在每升混合菌液中加入5g壳寡糖、5g琼胶寡糖、5g褐藻胶寡糖和5g低聚麦芽糖，用磁力搅拌器震荡30s，得到防治农作物细菌性病害的菌剂A;在每升混合菌液中加入5g壳寡糖、5g琼胶寡糖、5g葡聚寡糖、5g低聚麦芽糖，用磁力搅拌器震荡30s，得到防治农作物细菌性病害的菌剂B。
(3) 应用步骤(2)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂防治大白菜黑腐
病
施用菌剂大白菜黑腐病进行防治本试验设在历年发病较重的广州市天河区岑村，白菜品种为山东2号。试验区的土壤类型为沙壤土， 土质肥沃。试验期平均温度21.5 25.3匸，相对湿度为91 95%。对照药剂为72%农用链霉素4000倍液，清水为空白对照。试验设每小区lm2，种植大白菜15株。大白菜定植时分别按小区用手压喷雾器喷洒步骤(3)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂A、B和对照药剂，用量120mL/m2。之后隔10天1次，连续防治2次。第2次药后5d、10d和15d后观察发病情况，参照农药田间药效试验准则进行试验调査和计算防效。
14参照农药田间药效试验准则进行试验调査和计算防效。
实验显示清水组在白菜生长期出现黑腐病的症状，染病子叶呈水浸状，发
病后2-5d叶斑从叶缘向内扩展，7d后根髓部变黑，10d后发现幼苗枯死。处理组的发病率显著低于对照组，该组大白菜只有零星发病，病情不严重，无枯死的幼苗。实验结果显示，施用菌剂A的植株色泽碧绿，长势良好。菌剂A第2次施药15d后防效达到79.2。/。。在大白菜生长过程中继续使用蛭弧菌-寡糖，病害极少发生，成熟时品质优良，平均单株重量重于对照组和农用链霉素4000倍液组，与对照组相比平均单棵增重15.1%。
实施例8防治西葫芦根腐病
(1) 蛭弧菌菌液的制备，同实施例l步骤(1)。
(2) 防治农作物细菌性病害的菌剂的制备
将BDS01蛭弧菌液和BDSM08蛭弧菌液按细菌数1:1混合，用磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L， pH7.2 7.6)调节菌体数至107pfh/mL，在每升混合菌液中加入5g壳寡糖、5g琼胶寡糖、5g葡聚寡糖、5g褐藻胶寡糖和5g低聚麦芽糖，用磁力搅拌器震荡30s，得到防治农作物细菌性病害的菌剂。
(3) 应用步骤(2)制备的防治农作物细菌性病害的菌剂防治西葫芦根腐
病
施用菌剂对西葫芦根腐病进行防治本试验设在历年发病较重的广州市天河区岑村，试验区的土壤类型为沙壤土， 土质肥沃。试验期平均温度21.5-25.3°C，相对湿度为91%-95%。西葫芦品种为寒玉。试验设每小区3m2，种植西葫芦12株。对照药剂为75%百菌清可湿性粉剂500倍液，清水设三个小区，作为空白对照。大田定植时分别按小区用以上蛭弧菌寡糖混合液和百菌清溶液均匀灌于植株根部，每株灌150mL，每个处理三个重复小区。以后每隔15d灌施l次，连续2次。第2次施药后5d、 10d和15d后统计每小区病株数，参照农药田间药效试验准则进行试验调査和计算防效。
定植后，大田西葫芦开始发生根腐病。在本试验中，清水组发病较重，发病植株最初呈现水浸状，茎縮小干枯，8d后病处开始有腐烂现象，维管束变褐，后期严重的萎蔫枯死。处理组西葫芦长势良好，少见染病。发病株病斑没有蔓延，并且有逐渐消失迹象。实验显示，第2次施用15d后防效为82.0^，优于75%百菌清可湿性粉剂500倍液。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1权利要求
1、一种防治农作物细菌性病害的菌剂，其特征在于所述菌剂包含蛭弧菌和寡糖。
2、 根据权利要求1所述的防治农作物细菌性病害的菌剂，其特征在 于每升所述菌剂中含106 1012pfU的蛭弧菌和10 30g寡糖。
3、 根据权利要求2所述的防治农作物细菌性病害的菌剂，其特征在 于所述蛭弧菌为蛭弧菌(^fe//ov/6n'osp.) BDSOl、蛭弧菌(B&〃ov/6n'o sp.) BDS02或蛭弧菌(^fe〃oW6n'osp.) BDSM08中的至少一株。
4、 根据权利要求2所述的防治农作物细菌性病害的菌剂，其特征在 于所述蛭弧菌为蛭弧菌BDSOl与蛭弧菌BDSM08以细菌数比1:1混合。
5、 根据权利要求2所述的防治农作物细菌性病害的菌剂，其特征在 于所述寡糖为壳寡糖、琼胶寡糖、葡聚寡糖、褐藻胶寡糖或低聚麦芽糖 中的至少一种。
6、 权利要求2 5任一项所述防治农作物细菌性病害的菌剂的制备方 法，其特征在于将蛭弧菌用DNB培养基、水、生理盐水或0.2 mol / LpH 值为7.2 7.6的磷酸盐缓冲液调整至菌液浓度为106 1012pfU/L后加入 寡糖，寡糖的加入量为10 30g/L，混匀，得到防治农作物细菌性病害的 菌剂。
7、 权利要求1 5任一项所述防治农作物细菌性病害的菌剂的应用， 其特征在于将所述防治农作物细菌性病害的菌剂喷洒植株的茎、叶、穗、 果实或灌根淋根；所述防治农作物细菌性病害的菌剂中蛭弧菌的含量至少 为103pfU/mL。
8、 根据权利要求7所述防治农作物细菌性病害的菌剂的应用，其特 征在于所述防治农作物细菌性病害的菌剂喷洒植株的茎、叶、穗或果实； 或者所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于灌根淋根。
9、 根据权利要求8所述防治农作物细菌性病害的菌剂的应用，其特 征在于所述防治农作物细菌性病害的菌剂喷洒植株的茎、叶、穗或果实， 用量最少为80rnL / m2;所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于灌根淋根，用量最少为100mL /株。
10、 根据权利要求7所述防治农作物细菌性病害的菌剂的应用，其特征在于所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于防治十字花科蔬菜软腐病、黑 腐病、根腐病，使用方法为灌根淋根或喷洒茎或叶；所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于防治黄瓜和豆科植物细菌性角斑病，使用方法为灌根淋根、喷洒茎、叶或果实；所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于防治茄科蔬菜青枯病、软腐 病、溃疡病，使用方法为灌根淋根、喷洒茎、叶或果实；所述防治农作物细菌性病害的菌剂用于防治禾本科农作物细菌性条 斑病、白叶枯病，使用方法为喷洒茎、叶或穗。
全文摘要
本发明公开了一种防治农作物细菌性病害的菌剂及其制备方法与应用。本发明通过蛭弧菌液中加入寡糖，混匀，得到防治农作物细菌性病害的菌剂。本发明首次将蛭弧菌应用于农作物细菌性病害的防治，填补国内外蛭弧菌研究开发的空白，增加了生物农药的新种类。由于蛭弧菌具有裂解谱广，生长迅速的特点，对多种细菌病原菌具有优异的消灭能力。寡糖与之联用后，增强农作物抗性，药效大幅提高，扩大了细菌性病害的防治谱。本发明所制备的菌剂无毒，无污染，对农作物病虫害天敌安全，而且病原菌基本不对其产生抗性，克服了抗生素滥用带来“3R”问题，也避免了当前化学农药污染严重，破坏生态平衡的弊端。
文档编号A01N63/02GK101637186SQ20091004226
公开日2010年2月3日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者蔡俊鹏, 韩晓宁 申请人:华南理工大学