专利名称：：分子标记辅助选择快速培育稻米直链淀粉含量中等的水稻品系的方法
技术领域：
：本发明属于水稻分子育种
技术领域：
，尤其涉及一种借助分子标记辅助选择培育稻米直链淀粉含量中等的水稻品系的方法。
背景技术：
：稻米是我国人民的主食,也是全世界一半以上人口的主要食物来源，随着人民生活水平的提高，人们对稻米的品质，特别是食用品质提出了更高的要求。直链淀粉含量是影响稻米食用品质的关键因素之一。如果稻米直链淀粉含量偏高则米饭偏硬，饭粒松散，口感差；反之，米饭过软，适口性也不好。尽管世界各产稻国的优质稻米指标有差异，但大多数消费者喜欢米饭软硬适中，适口性好的稻米，研究表明，这种稻米的直链淀粉含量为15%—22%，即其直链淀粉含量中等。当前，"三系"杂交稻主要保持系亲本中川香29B、II-32B、G46B、中九B、金23B、F32B等直链淀粉含量都偏高(^23%)，而IR58025B、宜香1B、博IIIB等直链淀粉含量都偏低(〇15%)。这导致"三系，，杂交稻的食用品质较差，严重影响了"三系"杂交稻的推广和利用。采用常规的育种方法，需在育种过程中，对每一代群体的植株进行稻米直链淀粉含量测定，操作麻烦且选择的准确性差，效率低，育种规模大，选育的时间长，育种成本高，从而严重影响了优质杂交稻的选育和推广运用。非杂交稻的选育也存在同样的问题。根据近年分子遗传学的研究结果，稻米的直链淀粉含量主要受蜡质基因『x控制。经测序发现，以上三系保持系亲本品系ffx基因存在多样性，即核苷^列中第1内含子上游存在碱基CT重复数不同。具体为川香29B、II-32B、G46B、中九B、金23B、F32B的CT重复凄t为11;IR58025B为17;宜香1B、博IIIB为18。而直链淀粉含量中等，稻米口感好的优质水稻品系K81，其『;c基因，即核苷^列中第1内含子上游存在4ttCT重复数为20。而现有的分子标记，其扩增产率和效率均太低，不能对『义基因型进行有效的标记，应用于育种选择的指导效果差，育种仍然只能采用传统的育种方法进^f亍。
发明内容本发明的目的是提供一种分子标记辅助选择培育稻米直链淀粉含量中等的水稻品系的方法，该方法能快速有效地选择含中等直链淀粉含量的水稻材料，减小育种规模，降低育种成本，高效地改良稻米直链淀粉含量，快速地培育出稻米直链淀粉含量中等的水稻品系。本发明解决其技术问题，所采用的技术方案是一种快速选择稻米中等直链淀粉含量的方法，其步骤是1、一种分子标记辅助选l奪培育稻米直链淀4分含量中等的水稻品系的方法，其作法是A、以K81水稻品系为供体亲本，以农艺性状优良但直链淀粉含量不是中等的水稻品种或品系为受体亲本进行杂交、同时也种植供体亲本和受体亲本；对Fi代群体单林进行分子标记辅助选择，即利用分子标记RA19分别对Fi代单林和供体亲本的基因组DNA进行聚合酶链式反应PCR扩增，扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；选择含供体亲本『x基因型的Ft代单林；B、将供体亲本和A步选择得到的F,代单林与受体亲本回交2~3次，同时也种植供体亲本和受体亲本；在第二次及第三次回交的过程中采用与A步相同的分子标记辅助选择方法对上一次回交后代的群体单林进行选择得到进行下一次回交的单林，最后选择得到回交2~3次后的含供体亲本『x基因型的回交后代单林；C、将B步选择得到的含供体亲本『义基因型的回交后代单林自交3~5次，同时也种植供体亲本和受体亲本；在第二次至第五次自交的过程中采用与A步相同的分子标记辅助选择方法对上一次自交后代的群体单抹进行选择得到进行下一次自交的初选单林，再对初选单株的稻米测定直链淀粉含量，再选出直链淀粉含量中等的初选单林，作为下一代自交的单抹；即可培育出稻米直链淀粉含量中等的水稻品系。本发明使用的专用分子标记(SSR)引物RA19的序列表如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本发明方法中所采用的供体亲本K81水稻0品系，系申请人通过聚合回交育种技术将美国水稻品种Lemont的抗穗发芽和优质基因成功转移到籼稻保持系冈46B的遗传背景中而育成的具有中等直链淀粉含量的优良品系，在文献F.Y.Gao，G丄Ren，X丄Lu，etal.QTLanalysisfortheresistancetopre-harvestsproutinginrice(OryzasativaL.).PlantBreeding,2008,127:268—273中已有公开报道，可从申请人:处获得。与现有技术相比，本发明的有益效果是一、本发明使用的专用分子标记RA19为申请人发现的，是控制中等直链淀粉含量的『x基因内的分子标记，且其PCR扩增的产率和效率比现有的484/485有明显提高，标记搡作简单、观察与选择更为方便、准确，能对水稻的『x基因型进行有效的分子标记。1、利用国际权威软件Primer5.0分析，专用分子标记RA19的PCR扩增理论效率是484/485的1.7倍。2、分别用引物RA19和484/485对供试水稻材料的不同基因组DNA进行PCR扩增，引物RA19扩增产物条带的亮度要明显高于484/485扩增产物条带的亮度，表明特异引物RA19扩增产率要明显高于引物484/485。3、荧光定量PCR定量比较特异引物RA19与484/485在相同DNA模板条件下，荧光信号到达设定阀值所经历的循环数CT(Cyclethreshold),&值较小，扩增效率较高，反之亦然。分析显示，RA19和484/485以基因组DNA400ng为模板时，循环阀值CT分别为20.17和22.21;以基因组DNA40ng为模板时，CT值分别为22.47和25.38;以基因组DNA4ng为模板时，CT值分别为23.58和28.34;RA19的CT值比484/485提前2.04~4.76个循环。总之，特异引物RA19的扩增产率和效率明显高于484/485,能对水稻的『x基因型进行有效的分子标记。而现有的分子标记，其扩增产率和效率均太低，不能对『x基因型进行有效的标记，应用于育种选择的指导效果差。二、本发明开发出的是专用分子标记(微卫星SSR标记)RA19,具有多等位基因的特性，提供的信息量高；以孟德尔方式遗传，呈共显性；且其扩增产率和效率高，进行分子标记的成本低、准确性高，便于一般实验室利用，从而能使分子标记技术与常规育种相互结合。在56叶秧苗期即可采集叶片，在不影响植抹正常生长情况下，不需等待植林成熟即可在实验室对控制直链淀粉含量的基因型进行鉴定，不受环境条件影响，可在3~5天内获得结果，检测速度迅速，检测准确性高，实验证明它的选择准确性可达到100%。对于本代植林，检测出的不含中等直链淀粉含量基因的植林即可拔除，从而减少了土地肥水等资源的浪费；而选出进行下一代回交或自交的植^^，其选择准确性大大提高，所需种植的植林群体大大减少，从而明显降低育种规模，减少育种成本，加速育种进程，使育种者能更加高效快速地改良稻米直链淀粉含量，培育出直链淀粉含量中等的优质水稻。三、本发明使用的供体亲本K81，其控制直链淀粉含量的『x基因型CT重复数为20，利用专用分子标记RA19定向导入到籼型三系杂交稻的亲本中，有利于丰富籼型三系杂交稻亲本『x基因型的遗传多样性，和创造新『x基因型的籼型三系杂交稻亲本。下面结合具体的实施方式对本发明作进一步的详细说明。具体实施例方式实施例一本例以"三系"杂交稻的保持系川香29B为受体亲本，以K81水稻品系为供体亲本进行直链淀粉含量中等的水稻品系的培育。本例的一种分子标记辅助选择培育稻米直链淀粉含量中等的水稻品系的方法，其作法是A、以K81水稻品系为供体亲本(父本)，以"三系"杂交稻的保持系川香29B(CT重复数为11)为受体亲本(母本)进行杂交，得到杂交Fi代群体；同时也种植供体亲本和受体亲本；对F,代群体单抹进行分子标记辅助选择，即利用分子标记RA19分别对F:代单林和供体亲本的基因组DNA进行聚合酶链式反应PCR扩增，扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；选择含供体亲本『x基因型的F,代单林；B、将供体亲本和A步选择得到的F:代单林与受体亲本(川香29B)回交3次，同时也种植供体亲本和受体亲本；在第二次及第三次回交的过程中采用与A步相同的分子标记辅助选择方法对上一次回交后代的群体单林进行选择得到进行下一次回交的单林，最后选才奪得到回交3次后的含供体亲本『x基因型的回交后代单林。更具体而言就是首先将A步选择得到的含供体亲本『;c基因型的F:代单抹与川香29B回交得回交后代Fd即BCA。种才直BC,Fi单才朱，通过采用与A步相同的分子辅助标记选择方法，选择出含供体亲本『x基因型的单林作父本，再与川香"B第二次回交得二次回6交后代Fi，即BCA。种植BCA单林，采用同样的分子辅助标记方法选择出含供体亲本,基因型的单林作父本，然后与川香29B第三次回交得第三次回交后代F"即BC3FU种植BC3F,单林，再采用同样的分子辅助标记方法选择出含供体亲本『x基因型的第三次回交后的BCA单抹。C、将B步选择得到的含供体亲本『x基因型的回交后代单抹即BCA单抹自交4次，同时也种植供体亲本和受体亲本。在第二次至第四次自交的过程中采用与A步相同的分子标记辅助选择方法对上一次自交后代的群体单林进行选择得到进行下一次自交的初选单株，再对初选单林的稻米测定直链淀粉含量，再选出直链淀粉含量中等的初选单抹，作为下一代自交的单株；即可培育出稻米直链淀粉含量中等的水稻品系。更具体而言就是将C步得到的回交3代的含供体亲本『x基因型的BCA单林先自交1次，得到自交1次的后代BC3F2群体。在BC3F2群体中，再采用同样的分子辅助标记方法选择出含供体亲本『;c基因型的BC3F2初选单抹，再对初选单林的稻米测定直链淀4分含量，再选出直链淀粉含量中等的BC3F2初选单株进行第二次自交，得到自交二次后代的BC3F3群体。在该自交二次后代BC3F3群体中采用同样的分子辅助标记方法选择出含供体亲本『x基因型的BC3F3初选单林，再对初选单抹的稻米测定直链淀粉含量，再选出直链淀粉含量中等的BC3F3初选单抹进行第三次自交，得到自交三次后代的BCA群体。在该自交三次后代BC3F4群体中采用同样的分子辅助标记方法选择出含供体亲本『x基因型的BC3F,初选单林，再对初选单林的稻米测定直链淀粉含量，再选出直链淀粉含量中等的BC3F4初选单林进行第四次自交，得到自交四次后代的BC3F5群体。在自交四次后代的BC3Fs群体中，再结合基因是否纯合的鉴定，直链淀粉含量的测定，林高、穗数、抹叶形态等农艺性状的考查，即选择得到27个优良的直链淀粉含量中等的水稻品系。通过本例方法培育得到的27个水稻品系，其直链淀粉含量变幅为18.0%~21.45°/，平均值为19.4"/。。供体亲本K81的直链淀粉含量变幅为18.7%~20%，平均值为19.5%。受体亲本川香29B的直链淀粉含量变幅为22.5%23.2%，平均值为23%。受体亲本的平均直链淀粉含量由改良前的23.0%降到改良后的19.4%,降低幅度达极显著水平，而改良系与供体亲本的直链淀粉含量在同一水平。这表明利用本发明方法，对川香进行定向改良使其直链淀粉含量中等获得了7成功。实施例二本例以国际水稻所培育的IR58025B水稻品系为受体亲本(母本)，以K81水稻品系为供体亲本(父本)进行直链淀粉含量中等的水稻品系的培育。A、以K81水稻品系为供体亲本(父本)，以IR58025B为(CT重复数为17)受体亲本(母本)进行杂交，得到杂交F,代群体；同时也种植供体亲本和受体亲本；对F:代群体单;f朱进行分子标记辅助选择，即利用分子标记RA19分别对R代单林和供体亲本的基因组DNA进行聚合酶链式反应PCR扩增，扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；选择含供体亲本f^基因型的Fi代单抹；B、将供体亲本和A步选择得到的F,代单林与受体亲本(IR58025B)回交2次，同时也种植供体亲本和受体亲本；在第二次回交过程中采用与A步相同的分子标记辅助选择方法对上一次回交后代的群体单林进行选择得到进行下一次回交的单林，最后选择得到回交2次后的含供体亲本fT;c基因型的回交后代单抹。更具体而言就是首先将A步选择得到的含供体亲本『x基因型的F,代单抹与IR58025B回交得回交后代F,，即BdF,。种植BdF,单林，通过采用与A步相同的分子辅助标记选择方法，选择出含供体亲本『jc基因型的单抹作父本，再与IR58025B第二次回交得二次回交后代Fi，即BC^。种植BC2Fi单抹，采用同样的分子辅助标记方法选择出含供体亲本『x基因型的二次回交后代BCA单林。C、将B步选择得到的含供体亲本『x基因型的二次回交后代BCA单林自交3次，同时也种植供体亲本和受体亲本。在第二次至第三次自交的过程中采用与A步相同的分子标记辅助选4奪方法对上一次自交后代的群体单林进行选择得到进行下一次自交的初选单林，再对初选单抹的稻米测定直链淀粉含量，再选出直链淀粉含量中等的初选单抹，作为下一代自交的单株；即可培育出稻米直链淀粉含量中等的水稻品系。更具体而言就是将C步得到的回交2代的含供体亲本『x基因型的BCA单株先自交1次，得到自交1次的后代BC2Fz群体。在BC2F2群体中，再采用同样的分子辅助标记方法选择出含供体亲本『义基因型的BC2F2初选单抹，再对初选单抹的稻米测定直链淀粉含量，再选出直链淀粉含量中等的BC2F2初选单抹进行8第二次自交，得到自交二次后代的BCzF3群体。在该自交二次后代BC2F3群体中采用同样的分子辅助标记方法选择出含供体亲本『x基因型的BC2F3初选单抹，再对初选单抹的稻米测定直链淀粉含量，再选出直链淀粉含量中等的BC2F3初选单林进行第三次自交，得到自交三次后代的BC!F4群体。再采用分子辅助标记选择方法选择出含供体亲本『x基因型的纯合单抹，再结合直链淀粉含量的测定，林高、穗数、抹叶形态等农艺性状的考查，即选择得到13个优良的直链淀粉含量中等的水稻品系。本例选育的13个水稻品系，其直链淀4分含量变幅为17.65%21.5%，平均值为19.6%。供体亲本K81的直链淀粉含量变幅为18.7%~20%，平均值为19.5°/。受体亲本IR58025B的直链淀粉含量变幅为13.5°/~14.5%,平均值为14.3°/。。受体亲本的平均直链淀粉含量由改良前的14.3%提高到改良后的19.6%，提高幅度达极显著水平，而改良系与供体亲本的直链淀粉含量在同一水平。这表明利用本专利的发明方法对水稻品系IR58025B的直链淀粉含量的快速定向改良获得了成功。实施例三本例以广西省博白县农业科学研究所培育的水稻品系博niB为受体亲本，以K81水稻品系为供体亲本进行直链淀粉含量中等的水稻品系的培育。本例的一种分子标记辅助选择培育稻米直链淀粉含量中等的水稻品系的方法，其作法是A、以K81水稻品系为供体亲本(父本)，以"三系"杂交稻的保持系博IIIB(CT重复数为18)为受体亲本(母本)进行杂交，得到杂交F,代群体；同时也种植供体亲本和受体亲本；对F^^群体单4朱进行分子标记辅助选择，即利用分子标记RA19分别对&代单抹和供体亲本的基因组DM进行聚合酶链式反应PCR扩增，扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；选择含供体亲本『;c基因型的F:代单林；B、将供体亲本和A步选择得到的仏代单林与受体亲本(博IIIB)回交2次，同时也种植供体亲本和受体亲本；在第二次回交的过程中采用与A步相同的分子标记辅助选择方法对上一次(第一次)回交后代的群体单林进行选择得到进行下一次(第二次)回交的单林，最后选择得到回交2次后的含供体亲本附基因型的回交后代BC^单抹。C、将B步选择得到的含供体亲本『x基因型的回交后代单林即BCA单抹自200910058555.0说明书第8/8页交5次，同时也种植供体亲本和受体亲本。在第二次至第五次自交的过程中采用与A步相同的分子标记辅助选择方法对上一次自交后代的群体单抹进行选择得到进行下一次自交的初选单抹，再对初选单林的稻米测定直链淀粉含量，再选出直链淀粉含量中等的初选单抹，作为下一代自交的单4朱；最后即在第五次自交的后代BC2F6植^^，选育得到15个稻米直链淀粉含量中等的水稻品系。本例方法得到的15个优良的水稻品系，其直链淀粉含量变幅为15.9°/。18.9%:平均值为17.4%。供体亲本K81的直链淀粉含量变幅为18.7%~20%，平均值为19.5%。受体亲本博IIIB的直链淀粉含量变幅为13.8%14.8%，平均值为14.5%。受体亲本的平均直链淀粉含量由改良前的14.5%提高到改良后的17.4%，尽管改良系与供体亲本的直链淀粉含量不在同一水平，但与博IIIB的直链淀粉含量相比提高幅度仍达极显著水平。这表明利用本专利的发明方法对水稻保持系博IIIB的直链淀粉含量的快速定向改良获得了成功。本发明方法中所采用的供体亲本K81，系申请人通过聚合回交育种技术将美国水稻品种Lemont的抗穗发芽和优质基因成功转移到籼稻保持系冈46B的遗传背景中而育成的具有中等直链淀粉含量的优良品系(F.Y.Gao,G丄Ren，X丄Lu，etal.QTLanalysisfortheresistancetopre-harvestsproutinginrice(OryzasativaL.).PlantBreeding,2008,127:268-273)。以上实施例中的受体亲本川香29B、IR58025B、博IIIB为已公知公用多年的品种，川香29B可以从申请人处购得，IR58025B可以从国际水稻所(IRRI)按照协议StandardMaterialTransferAgreement(SMTA)免费获得，博IIIB可以从广西省博白县农业科学研究所购得。本发明在实施时，受体亲本不局限于以上实施例的三个受体亲本，而可以是任何现有的农艺性状优良，但直链淀粉含量不是中等的现有水稻品种或品系。本发明使用的专用分子标记(SSR)引物RA19的序列表如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1、一种分子标记辅助选择快速培育稻米直链淀粉含量中等的水稻品系的方法，其作法是A、以K81水稻品系为供体亲本，以农艺性状优良但直链淀粉含量不是中等的水稻品种或品系为受体亲本进行杂交、同时也种植供体亲本和受体亲本；对F1代群体单株进行分子标记辅助选择，即利用分子标记RA19分别对F1代单株和供体亲本的基因组DNA进行聚合酶链式反应PCR扩增，扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；选择含供体亲本Wx基因型的F1代单株；B、将供体亲本和A步选择得到的F1代单株与受体亲本回交2～3次，同时也种植供体亲本和受体亲本；在第二次及第三次回交的过程中采用与A步相同的分子标记辅助选择方法对上一次回交后代的群体单株进行选择得到进行下一次回交的单株，最后选择得到回交2～3次后的含供体亲本Wx基因型的回交后代单株；C、将B步选择得到的含供体亲本Wx基因型的回交后代单株自交3～5次，同时也种植供体亲本和受体亲本；在第二次至第五次自交的过程中采用与A步相同的分子标记辅助选择方法对上一次自交后代的群体单株进行选择得到进行下一次自交的初选单株，再对初选单株的稻米测定直链淀粉含量，再选出直链淀粉含量中等的初选单株，作为下一代自交的单株；即可培育出稻米直链淀粉含量中等的水稻品系。全文摘要一种分子标记辅助选择培育稻米直链淀粉含量中等的水稻品系的方法，其作法是以K81水稻品系为供体亲本，以农艺性状优良但直链淀粉含量不是中等的水稻品种或品系为受体亲本进行杂交；杂交后进行2～3次回交，再进行3～5次自交；同时每代也种植供体亲本和受体亲本。在各代选择中，均进行分子标记RA19进行辅助选择，选择含供体亲本Wx基因型的当代单株为下一次回交或自交的单株，且在第二次及以后的自交植株的选择中，还测定直链淀粉含量进行选择。该方法能快速有效地选择含中等直链淀粉含量的水稻材料，减小育种规模，降低育种成本，高效地改良稻米直链淀粉含量，快速地培育出稻米直链淀粉含量中等的水稻品系。文档编号A01H1/04GK101491212SQ20091005855公开日2009年7月29日申请日期2009年3月10日优先权日2009年3月10日发明者任光俊,刘光春,曾礼华,李治华,陆贤军,高方远申请人:四川省农业科学院作物研究所