专利名称：生防细菌b579与杀菌剂协同应用技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生防细菌菌株与杀菌剂的协同应用的方法，具体涉及一种枯草芽孢杆 菌菌株与杀菌剂(多菌灵、甲霜灵)的相协同作用及其施用技术。
背景技术：
近年来，随着棚室农作物种植密度及复种指数的增加，土壤养分失衡，致使黄瓜猝 倒病、立枯病、枯萎病等土传病害(soil-bronedisease)发生严重，每年给农业生产造成的 直接经济损失达40%-60%，严重地块甚至达到80%以上。引起该病害的病原菌一般为多 寄主微生物，可以侵染数种乃至数百种农作物和杂草植物，具有很强的生活能力和侵染能 力，并且在恶略的环境下有特殊的生存方式，因此被植物界认定为最难防治的病害之一。目 前该病害的防治方法主要是利用抗病品种和化学药剂防治为主，使用抗病品种可以达到经 济有效的防治效果，但要获得一个理想的抗病品种，并不是一件容易的事情，而且抗病品种 往往推广几年以后容易丧失抗性。化学药剂防治是主要的防治手段，但是其效果不令人满 意，而且严重破坏环境，作为病害防治方法之一的生物防治，在某些情况下具有良好的防治 效果，并成为当今研究和开发的热点。生防细菌在土传病害的防治中起着非常重要的作用，无论是自然发生的生物防治 现象还是人们用于生物防治的生物类型中，细菌的作用是非常明显的，其主要优势在于细 菌的种类和数量众多，具有惊人的繁殖速度、许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的 生态比较适宜、细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作、有些细菌不仅能防 治病害而且可以增加作物产量。因此生防细菌在生物防治中占有重要地位，越来越引起人 们的重视。芽孢杆菌存在于植物根围，在长期的进化过程中与植物建立了密切的关系，它不 仅可以促进植物生长、抑制病原菌，而且本身繁殖速度快，可以通过人工大量繁殖施入土壤 中，以调节植物根部微生境，限制有害生物、增加有益微生物类群。其生防机制可归纳为 (1)营养基质的竞争和空间位点的排斥。生防细菌通过快速繁殖占领植物根部，减少了病原 菌孢子所必需的营养和空间。(2)分泌的嗜铁素。由于嗜铁素结合了根际有限的F:限制 了病原菌对F广的利用，最终抑制病原菌的生长。(3)产生抗生素。国内外关于芽孢杆菌的研究较多，美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌 株开发出活菌杀菌剂seuenade TM,并于2000年通过环保局的登记，用于防治多种作物的 白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等。此外，澳大利亚研究开发的B，subtilis A-13对麦类和胡 萝卜立枯病和土传病害具有很好的防病增产作用(David M ffeller,1998)；日本东京技术 研究所的 B. subtilis RB14 和 B. subtilisNB22 分别对 Rhizoctoni solanii 和 Fusarium oxysporum与Pseudomonas solanacearum弓I起的番爺病害也有良好的防效(Orie禾口 Makoto, 1996 ；Makoto和Takashi，1996)。近年来，虽然拮抗细菌的研究工作在我国十分活 跃，但大多停留在拮抗细菌的筛选和对某种病原菌的抑菌效果测定等阶段，真正将其商品 化，并应用于实际生产的很少，归纳起来主要原因是这些生防细菌在田间施用后往往定殖能力弱，形不成足够的生物群体，或者效果不稳定，忽高忽低。因此，探讨生防细菌的应用技 术，使其发挥更大的生防效果已成为瓶颈问题。因而为解决生防制剂应用中所面临的问题，同时减少化学农药的施用剂量，提出 生防细菌菌株与化学药剂混合使用，通过施用对植物病原菌有特异性的杀菌剂并引进对该 药剂不敏感的生防细菌，实现控制植物病害的有益互作。对于提高生防制剂的防治效果，减 少化学农药的使用剂量及农药残留将有一定的帮助。
发明内容
本发明旨在研究一种生防细菌菌株与化学杀菌剂协同应用的方法。本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的。主要包括生防细菌菌株B579与杀菌剂的混合施用的方法，包括防治植物病原微 生物尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia Solani)、瓜果腐霉菌 (pythium aphanidermatum)效果最佳的化学药剂的筛选；多菌灵、甲基托布津、福美双、恶 霉灵、甲霜灵、百菌清、霜霉威七种化学药剂对生防细菌菌株B579生长的影响；杀菌剂(多 菌灵、甲霜灵)与生防细菌B579的协同作用及其田间施用技术，本发明的特征在于生物制 剂中引入特异性化学药剂，旨在提高对植物病害的防效，减少化学药剂的用量，更环保、更 安全、更有效。
具体实施例方式下面进一步详述本发明。1、化学药剂对三种植物病原菌的防治效果采用含药介质法对三种病原菌进行毒力测定。以药剂浓度的对数值为X，抑菌率的 机率值为Y，计算回归方程及药剂的EC5tl值和EC9tl(使50%和90%菌丝生长受到抑制的药 剂浓度)。1. 1化学药剂对立枯丝核菌(Rhizoctonia Solani)的毒力测定见表1表1化学药剂对立枯丝核菌的毒力测定 由以上试验可知抑制黄瓜立枯病菌效果最好的药剂依次为多菌灵>福美双>恶 霉灵> 甲基托布津> 甲霜灵>百菌清(EC5tl)多菌灵>福美双> 甲基托布津>恶霉灵>甲 霜灵>百菌清(EC9tl)1. 2化学药剂对瓜果腐霉菌(pythium aphanidermatum)的毒力测定见表2表2化学药剂对瓜果腐霉菌的毒力测定结果 由表2可知抑制瓜果腐霉菌效果最好的药剂依次为甲霜灵>恶霉灵>福美双> 霜霉威(EC5tl)；甲霜灵>福美双>恶霉灵>霜霉威(EC9tl)151. 3化学药剂对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的毒力测定见表3表3化学药剂对尖孢镰刀菌的毒力测定 由表3可知抑制黄瓜枯萎病菌效果最好的药剂依次为多菌灵>恶霉灵>福美双 >百菌清> 甲霜灵> 甲基托布津(EC5tl)；多菌灵>恶霉灵>百菌清>福美双> 甲霜灵>甲 基托布津(EC9tl)有以上试验可知对于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia Solani)、效果最好的化学药剂为多菌灵，对于瓜果腐霉菌(pythium aphanidermatum)效果最好的化学药剂为甲霜灵。2.化学药剂对生防细菌B579生长的影响采用平板涂布法测试化学药剂对生防细菌B579生长的影响，将生防细菌在肉汁 胨斜面培养基上28°C培养24-48h后，加入无菌水摇勻，制备成菌悬液，分别在制备好的PDA 带毒平板上滴加B579悬浮液lOOul，后刮平、涂勻，以无药培养基为对照，每处理重复3次， 置于28°C培养箱中培养24h观察菌落生长情况，菌落数与对照无差异为能正常生长，平板 上只有少数菌落，与对照有显著差异为零星生长，平板上无菌落即为不能生长。表4七种化学药剂对生防细菌B579生长的影响 X 表示不生长，-稍有抑制，+ 表示正常生长由上表可以看出只有福美双对生防细菌B579生长影响较大，而福美双近年来由 于比较容易出现药害，生产上使用较少，而其他6种化学药剂在低浓度下对B579生长无任 何影响，在高浓度下虽然出现抑制作用，但是生产上使用量根本达不到这么高的浓度，因此 认为以上化学药剂(福美双除外)对生防细菌B579生长无影响。3、多菌灵、甲霜灵与生防细菌B579协同作用对立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、尖孢镰 刀菌的毒力测定。采用十字交叉滤纸条及带毒平板法进行化学药剂与生防细菌B579联合毒力测 定，分别设药剂对照、生防细菌对照及无药无菌对照，然后测量菌落半径，计算抑菌率。3. 1化学药剂多菌灵与B579对立枯丝核菌联合毒力测定表5.多菌灵与B579协同作用对立枯丝核菌毒力测定结果
6 由上表可知化学药剂多菌灵在10mg/l和5mg/l下，不论是有、无生防细菌，对立枯 丝核菌的抑制率相同，也就是化学药剂其主导作用，而随着浓度的降低，生防细菌的作用逐 渐明显，24h调查时多菌灵浓度为0. 05-lmg/l时，防效为4. 2% -29%，而加入B579后防效 为37.5% _45.8%，显然防效提高很多。同样48h调查时，也有以上趋势。3. 2.化学药剂甲霜灵与B579对瓜果腐霉菌联合独立测定(24h)表6甲霜灵与B579协同作用对瓜果腐霉菌毒力测定 瓜果腐霉菌生长速度较快，因此只进行24h的结果测量，由表6可以看出，当甲霜 灵浓度在10mg/l时，不论是有生防细菌还是无生防细菌，抑菌率都为100%，而甲霜灵浓度 在低于5mg/l，时，对瓜果腐霉菌的抑菌率与生防细菌有很大关系，未添加生防细菌的抑菌 率明显低于有生防细菌的处理，生防细菌单独处理的抑菌率为40. 3%。因此化学药剂甲霜 灵与生防细菌B579有增效作用。3. 3化学药剂多菌灵与B579协同防治枯萎病由表7可知化学药剂多菌灵在10mg/l和5mg/l下，不论是有、无生防细菌存在，对 镰刀菌的抑制率相同，也就是化学药剂占主导作用，而随着化学药剂浓度的降低，生防细菌 的作用逐渐明显，24h调查时多菌灵浓度为0. 05-lmg/l时，防效为5. 3 % -21. 1 %，而加入 8579后防效为44.8% -62. 1%，显然防效提高很多。同样48h调查时，也有以上趋势。表7多菌灵与B579对枯萎病菌联合毒力测定 4.化学药剂与生防细菌配比后田间试验既要充分发挥化学药剂对病原菌的弱化作用，又要充分发挥生防细菌的生防作 用，同时综合上述试验结果，我们提出化学药剂与生防细菌的适合比例，50%多菌灵WP 与B579WP的比例为1 3，该混剂用于防治蔬菜苗期立枯病和枯萎病，25%甲霜灵WP与 B579WP的比例为1 1，该混剂用于防治蔬菜苗期猝倒病。将配比后的混剂进行田间试验。4. 1多菌灵与生防细菌B579协同作用防治苗期立枯病田间药效试验试验设六个处理，试验设在为发生立枯病较严重地块，混剂设3个浓度，分别为 1000倍、1500倍、2000倍，同时设两个单剂为对照，另设清水对照。每个处理重复4次。表8混剂对立枯病的防治效果 由以上试验结果可以看出，生防细菌在1500倍下对立枯丝核菌的防效为70. 6%， 50%多菌灵在1500倍下防效为61.9%，按照1 3 (化学药剂生防菌)混合后，在1000 倍、1500倍、2000倍下防效分别为69. 8%、77. 0%、87. 3%，较单独使用防效明显提高，所以 化学药剂50%多菌灵与生防细菌可湿性粉剂以1 3混合后，于黄瓜播种前土壤处理，施用 剂量在1500-2000倍下，能够有效防治苗期立枯病的发生。4. 2甲霜灵与生防细菌B579协同作用防治苗期猝倒病田间药效试验表9混剂对猝倒病的防治效果 由表9可以看出，25 %甲霜灵可湿性粉剂1000倍下，对猝倒病的防效为60. 6 %，生 防细菌1500倍下对猝倒病的防效为48.2%，将25%的甲霜灵与生防细菌1 1混合后，在 1000倍、1500倍、2000倍下对猝倒病的防效分别为62. 4%,81. 8%,69. 7%，较单独使用防 效明显提高，所以化学药剂25%甲霜灵与生防细菌可湿性粉剂以1 1混合后，于黄瓜播种 前进行土壤处理，施用剂量在1500-2000倍下，能够有效防治苗期猝倒病病的发生。4. 3多菌灵与生防细菌B579协同作用防治枯萎病田间药效试验表10混剂对枯萎病的防治效果 由表10可以看出，50%多菌灵可湿性粉剂1500倍对枯萎病的防效为60. 5%，芽孢 杆菌可湿性粉剂对枯萎病防效为57.9%，将两者1 3混合后，防效虽然有不同程度的提 高，但只有在1000倍下差异最显著，防效达到71. 0%，因此化学药剂50%多菌灵与生防细 菌可湿性粉剂以1 3混合后，于发病初期进行药剂灌溉，施用剂量在1000倍-1500倍，能 够有效防治枯萎病的发生。5.总结通过对生产上防治蔬菜立枯病、猝倒病、枯萎病的化学药剂的筛选，可知多菌灵对 立枯病及枯萎病的效果最好，甲霜灵对猝倒病的效果最好，而且这两种药剂在IOOppm下对 生防细菌生长无任何影响。因此提出化学药剂与生防菌混用，既可以发挥化学药剂速效、弱 化病原菌的作用，又可以发挥生防菌持久、安全等作用，通过室内及田间协同作用试验，进 一步验证了化学药剂及生防菌混合使用具有较强的增效作用，同时确定了该混剂的使用方 法、剂量及施用时期。
权利要求
一种利用生防细菌菌株与杀菌剂协同应用的方法，包括针对三种植物病原菌进行的化学药剂的筛选，化学药剂对生防细菌菌株B579生长的影响，以及杀菌剂(多菌灵、甲霜灵)与生防细菌B579的协同作用和施用技术，本发明的特征在于化学药剂中引入生防菌，提高对植物病害的防效，减少化学药剂的用量，更环保、更安全、更有效。
全文摘要
本发明涉及一种利用生防细菌B579与杀菌剂协同应用的方法。该方法主要包括用于防治尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(RhizoctoniaSolani)、瓜果腐霉菌(pythium aphanidermatum)三种植物病原菌的七种化学药剂(多菌灵、甲基托布津、福美双、恶霉灵、甲霜灵、百菌清、霜霉威)的筛选，测试以上药剂对生防细菌B579生长的影响，以及生防细菌B579与化学药剂协同应用防治蔬菜立枯病、猝倒病、枯萎病的技术。该方法既可以发挥化学药剂速效、弱化病原菌的作用，又可以发挥生防菌持久、安全等作用，达到有效控制蔬菜土传病害的发生，减少化学农药对环境的污染。
文档编号A01N37/46GK101904341SQ200910069129
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者刘亦学, 刘晓琳, 刘水芳, 孙淑琴, 张惟, 杨秀荣 申请人:天津市植物保护研究所