专利名称：苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂及其制备方法与专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境工程领域，特别涉及苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂及其制备方法
与专用培养基。
背景技术：
城市污泥是污水处理过程中必然产生的沉淀物。污泥的不规范处置已成为当今城 市环境的新隐患。如何妥善处置这些数量日益庞大的有机固体废弃物，是污水处理厂最头 痛的问题之一。一般来说，污水处理与处置费用约占污水处理总费用的30-40%。现行的污 泥填埋、土地利用、焚烧等处置方式都存在各自难以克服的缺陷，且不能满足当前资源化的 实际需要。实际上，城市污泥中含有大量可被微生物利用的碳、氮、磷以及微量元素等营养 物质。典型城市污泥中碳水化合物与蛋白质含量分别达到10%和30%左右，蛋白质含量 几乎可以与玉米粉和小麦粉相媲美。因此，如何采用微生物方法将污泥转变为高附加值 产品已成为国际上污泥资源化技术中最前沿、最活跃的研究领域。例如，中华苜蓿根瘤菌 (Sinorhlizobium meliloti)能在污泥为唯一原料的培养基中大量生长，利用污泥的这一 特性，可以将之转化为根瘤菌接种剂；再如，以碱处理污泥为唯一原料，利用厌氧发酵法可 以将污泥中的碳水化合物转化为生物氢气(Biohydrogen)，序批式摇瓶试验结果表明产氢 率可达16. 6mg H2/g干污泥，尽管这一产氢率离实际应用差距甚远，但它已为污泥的微生物 转化技术点起了 “星星之火”。此外，国外一些研究者正积极探索以污泥为原料制L-乳酸、 制生物降解塑料的微生物转化方法。从本质上看，上述污泥微生物转化方法都基于一个共 同点污泥具有可供微生物正常生长和新陈代谢所需的物质基础。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，又简称苏云金杆菌或Bt)是一类能 在代谢过程中产生伴孢晶体(即杀虫晶体蛋白)的革兰氏阳性细菌，是目前世界上产量最 大的微生物杀虫剂(占微生物杀虫剂总量的90%以上)，广泛应用于防治农、林和果树害 虫、贮藏害虫以及卫生害虫。与化学杀虫剂相比，Bt杀虫剂具有选择性强，对人畜无害，环 境友好等优点。目前Bt杀虫剂主流生产工艺是液体深层发酵，主要以各种工农业产品或农 副产品，如葡萄糖、蛋白胨、黄豆粉、玉米淀粉、麦麸等为原料，原料价格过高(约占总生产 成本的20-35%)是Bt杀虫剂难于普及的主要限制因素。因此，如何采用低成本、当地可得 的工农业废弃物为原料，降低发酵生产成本，对于Bt杀虫剂这一生态无害型生物农药的推 广应用有重要意义。经国内外文献与专利检索，尚未见到利用城市污泥为原料发酵生产苏云金芽孢杆 菌微生物杀虫剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂及其制备方法与专用培养 基，采用本发明提供的方法制备微生物杀虫剂，可以充分利用污泥，降低生产成本。
本发明提供的制备苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的培养基，是将污泥与矿质盐、 消泡剂混合得到的培养基。所述IL培养基中，污泥的固体质量为20_50g，矿质盐为0. 5_1. 5g，消泡剂为 1.0-5. 0g，其余为水。上述污泥的固体中的碳水化合物含量为104_150g/kgTS (克每千克总固体)，蛋白 含量为 300-380g/kgTS，磷含量为 4-10g/kgTS。上述培养基中矿质盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰。上述IL培养基中，矿质 盐优选由0. 5-1. Og磷酸氢二钾、0. 1-0. 4g硫酸镁和0. 01-0. 04g硫酸锰组成。所述消泡剂选自下述4种物质中的至少一种泡敌、聚丙二醇、豆油和花生油，所 述消泡剂优选是泡敌。上述培养基的pH为6. 7-7. 3。pH的具体调制方法如下首先将培养基的pH调 至9. 5-10. 0，经15磅压力与121°C温度灭菌30-60分钟，冷却至35 °C备用，灭后pH约为 7. 0-8. 0。调节pH用的碱可为NaOH、KOH或Ca (OH)2,优选用NaOH ；调节pH用的酸通常为 HCl。本发明提供的苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的制备方法，包括如下步骤将苏云 金芽孢杆菌置于上述的培养基中进行发酵培养，制得苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂。上述苏云金芽孢杆菌可经摇瓶培养获得，所述摇瓶培养是从保藏正常的Bt斜面 培养基上挑取一环菌株接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。 条件为温度28-32°C、转速150-250转/分，三角瓶装液量10-40%，培养时间10-15小时。 所用菌株可为现有微生物杀虫剂所用的菌株，包括Bt HD-l、Bt7216或Bt8010。牛肉膏蛋 白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水IOOOmL ；pH 7. 2-7. 5，15磅 压力与121°C下灭菌30分钟。上述发酵培养包括以下步骤1)种子罐发酵将所述苏云金芽孢杆菌置于含有所述培养基的种子罐中进行发 酵培养，得到种子液，所述种子罐发酵培养条件为罐温是28-32°C、罐压是0. 02-0. 06MPa、 通气量1 (1.0-1. 5) L/(L*min)、搅拌速度220-260转/分、旋转半径是0. 15米、发酵时 间10-15小时；2)发酵罐发酵将步骤1)得到的种子液移入含有所述培养基的发酵罐中进行发 酵培养，得到发酵液，所述发酵罐发酵培养条件为罐温28-32°C、罐压0. 02-0. 06MPa、通气 量1 (1.0-1. 5)L/(L*min)、搅拌速度180-220转/分、旋转半径是0.40米、发酵时间 30-42小时。放罐标准伴孢晶体脱落20%、发酵液pH为8. 5-9. 0。上述发酵培养完成之后可进行发酵液后处理。所述发酵液后处理可包括以下步骤将所述步骤2)得到的发酵液 与展着剂以及防腐剂混合，使苏云金芽孢 杆菌与展着剂以及防腐剂的配比为 IO11-IO12Cfu 10-50g 0.2-2. Og;所述展着剂选自下述3种物质中的至少一种吐温 20(Tween-20)、木素磺酸钠和壬基酚聚氧乙烯醚(TX-10)，优选是吐温20 ；所述防腐剂选自 下述5种物质中的至少一种山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯、尼泊金甲酯和凯松，优选是山梨 酸钾。所述发酵液后处理还可以是以下步骤将步骤2)得到的发酵液与20_50g/L分散剂与1.0-4. Og/L乳化剂混合，使苏云金芽孢杆菌与分散剂以及乳化剂的配比 为IO11-IO12Cfu 20-50g 1.0-4. Og;搅拌均勻后，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度 200-280°C，出口温度60-90°C，至含水率低于4% ；所述分散剂选自高岭土、硅藻土、膨润土 和轻质碳酸钙中的至少一种，所述分散剂优选是高岭土和/或硅藻土 ；所述乳化剂是选自 木素磺酸钠、吐温SO(Tween-SO)和壬基酚聚氧乙烯醚(TX-10)中的至少一种，优选是木素 磺酸钠。上述制备方法所制得的苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂也属于本发明的保护范围。本发明的苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂可以是液剂、粉剂或颗粒剂，优选为悬浮 剂或可湿性粉剂。本发明的苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂可有效灭杀鳞翅目农作物害虫，对环境安
全无害。本发明的技术原理是以污泥所含的糖分与蛋白质、磷以及微量元素为主要营养 物质，在维持适宜PH、温度与通气量的条件下，苏云金芽孢杆菌得以生长与增殖，形成芽孢 与杀虫晶体蛋白等杀虫活性物质，发酵液经浓缩干燥制成微生物杀虫剂产品。本发明提供的制备苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的方法，具有以下优点与积极效 果1、为城市污泥的处理提供了一条崭新途径，并且获得微生物杀虫剂产品。2、与现有技术中的生物处理法相比，本方法不仅实现了城市污泥资源化，而且可 获得杀虫剂产品，降低了生物杀虫剂生产成本；与现有技术中的污泥堆肥、填埋相比，本方 法获得的产品附加值较高；与现有技术中的厌氧发酵产氢相比，本方法为好氧发酵制备生 物杀虫剂，效率高且克服了发酵过程产生恶臭等缺陷，扩大了城市污泥的资源化利用途径。3、现有苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的生产主要以葡萄糖、蛋白胨、黄豆粉、玉米 淀粉、麦麸等为原料，原料价格过高是其难于普及的主要限制因素。本发明中苏云金芽孢杆 菌主要依靠城市污泥中自身的可利用成分(糖分、蛋白质与矿质盐等)生长与增殖，添加的 成分较少，大大降低了微生物杀虫剂的生产成本，从而促进苏云金芽孢杆菌这一生态无害 的生物农药的推广应用。
图1为制备苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的工艺流程图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的制备和检测一、苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的制备苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的制备流程如图1所示。1、配制培养基
1)取城市污泥样品取污水处理厂的混合污泥进行实验。该厂污水处理采用活性污泥法，产生大量初沉污泥和剩余活性污泥，经分析污泥中碳水化合物含量为104g/kgTS、蛋白含量为300g/ kgTS、磷含量为 4g/kgTS，pH = 6. 8。 2)培养基调理调节城市污泥的固体含量为30g/L，加入磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰和泡敌，使得 磷酸氢二钾终浓度为0. 5g/L、硫酸镁终浓度为0. 2g/L、硫酸锰终浓度为0. 02g/L，泡敌终浓 度为2. Og/L。用NaOH调pH至9. 7-9. 8，分别装入种子罐与发酵罐中经15磅压力与121°C 温度灭菌40分钟，冷却至35°C备用，灭后pH约为7. 0-8. 0，用HCl调节pH为6. 7-7. 3。2、摇瓶培养从Bt HD-I菌株(购自中国农业科学院，保藏号ACCC100037)斜面培养基上挑 取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温 度30°C、转速200转/分，500mL三角瓶装液IOOmL牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养时间12 小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水IOOOmL ；pH 7. 2-7. 5，15磅压力与121°C下灭菌30分钟。3、发酵培养1)种子罐发酵接种(体积百分比)的上述摇瓶菌液到种子罐(体积多50L，含培养基30L)， 发酵培养，得到种子液。培养条件为罐温30°C、罐压0.04MPa、通气量1 1. 2L/(L ·π η)、 搅拌速度240转/分(旋转半径是0. 15米)、发酵时间12小时。2)发酵罐发酵接种5% (体积百分比)的种子液到发酵罐(体积1000L，含培养基600L)，得发酵 液。培养条件为罐温30°C、罐压0. 03MPa、通气量1 1. 2L/(L · min)、搅拌速度200转/ 分(旋转半径是0. 40米)、发酵时间36小时。4、发酵液后处理发酵结束后，将发酵液经高速离心浓缩4倍，然后向浓缩液中加入吐温 20 (Tween-20)与山梨酸钾，使得苏云金芽孢杆菌与Tween-20以及山梨酸钾的配比为 5X IO11Cfu 40g 0. 5g ；搅拌均勻，分装。二、杀虫剂检测实验1、检测方法根据国家标准《苏云金芽孢杆菌悬浮剂》GB/T19567. 2-2004对产品毒效进行生物 测定，以小菜蛾(Plutella xylostrella)为标准供试昆虫，以湖北省农业科学院生物农药 工程中心提供的CS-1991(H3a3b)为标准对照(标准品毒力效价为55000IU/mg)。按照标 准化程序进行毒力效价测定。2、检测结果经检测，按上述方法制得的苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂悬浮剂产品毒力效价为 3152IU/ μ L，达到合格级(悬浮剂产品毒力效价标准一级8000IU/ μ L，二级4000IU/ μ L， 合格级2000 υ/μ L)。该产品为灰黑色液体，略带污泥发酵的酸味。实施例2、苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的制备和检测一、苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的制备1、配制培养基
1)取城市污泥样品取污水处理厂的浓缩污泥进行实验。该厂污水处理采用活性污泥法，产生剩余活 性污泥进入浓缩池，从池底取浓缩污泥经分析污泥中碳水化合物含量为123g/kgTS、粗蛋白 含量为 334g/kgTS、磷含量为 7g/kgTS，pH = 6. 5。2)培养基调理调节城市污泥固体含量为20g/L，加入磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰和泡敌，使得磷 酸氢二钾终浓度为0. 4g/L、硫酸镁终浓度为0. lg/L、硫酸锰终浓度为0. 01g/L，泡敌终浓度 为 1. Og/L。用KOH调pH至10. 0，分别装入种子罐与发酵罐中经15磅压力与121°C温度灭菌 30分钟，冷却至35°C备用，灭后pH约为7. 0-8. 0，用HCl调节pH为6. 7-7. 3备用。2、摇瓶培养从Bt7216菌株(购自中科院微生物所，保藏号10066)斜面培养基上挑取一环接 种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温度28°C、转 速150转/分，500mL三角瓶装液IOOmL牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养时间15小时。牛肉 膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水IOOOmL ;pH 7. 2-7. 5，15 磅压力与121°C下灭菌30分钟。3、发酵培养1)种子罐发酵接种2% (体积百分比)的上述摇瓶菌液到种子罐(体积50L，含培养基30L)，发 酵培养，发酵培养，得到种子液。培养条件为罐温28°C、罐压0.06MPa、通气量1 1. 5L/ (L · min)、搅拌速度220转/分、(旋转半径是0. 15米)、发酵时间15小时。2)发酵罐发酵接种8% (体积百分比)的种子液到发酵罐(体积1000L，含培养基600L)，发酵培 养，得到发酵液。培养条件为罐温28°C、罐压0.06MPa、通气量1 1. 5L/(L · min)、搅拌 速度180转/分(旋转半径是0. 40米)、发酵时间42小时。4、发酵液后处理发酵结束后，将发酵液经高速离心浓缩5倍，往得到的浓缩液中加入高 岭土与木素磺酸钠乳化剂，使苏云金芽孢杆菌与高岭土以及木素磺酸钠的配比为 5X IO11Cfu 40g 2g，搅拌均勻，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度200-280°C，出口温度 60-900C，至含水率低于4%，分装。二、杀虫剂检测实验1、检测方法根据国家标准《苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂》GB/T 19567. 3-2004对产品毒效进行 生物测定，以小菜蛾(Plutella xylostreila)为标准供试昆虫，以湖北省农业科学院生物 农药工程中心提供的CS-1991(H3a3b)为标准对照(标准品毒力效价为55000IU/mg)。按 照标准化程序进行毒力效价测定。
2、检测结果经检测，按上述方法制得的苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂可湿性粉剂产品毒力效 价为12530IU/mg，达到合格级(可湿性粉剂产品毒力效价标准一级32000IU/μ L，二级16000IU/μ L，合格级8000IU/μ L)。该产品为灰色粉末，略带污泥发酵的酸味，没有恶臭。实施例3、苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的制备和检测一、苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的制备 1、配制培养基 1)取城市污泥样品取污水处理厂的剩余活性污泥，该厂采用氧化沟工艺处理生活污水。为保证较高 的污泥固体含量，污泥在沉淀池中的停留时间须在10天以上。经分析，该污泥中碳水化合 物含量为150g/kgTS、粗蛋白含量为380g/kgTS、磷含量为10g/kgTS，pH = 6. 7。2)培养基调理调节城市污泥固体含量为50g/L，加入磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰和泡敌，使得磷 酸氢二钾终浓度为1.0g/L、硫酸镁终浓度为0.4g/L、硫酸锰终浓度为0. 04g/L，泡敌终浓度 为 5g/L。用Ca(OH)2调pH至9. 5，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121°C温度灭菌 60分钟，冷却至35°C备用，灭后pH约为7.0-8.0，用HCl调节pH为6.7-7.3备用。2、摇瓶培养从BtSOlO菌株(购自中科院微生物所，保藏号CGMCC1. 1767)斜面培养基上挑 取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温 度32°C、转速250转/分，500mL三角瓶装液IOOmL牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养时间10 小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL ；pH 7. 2-7. 5，15磅压力与121°C下灭菌30分钟。3、发酵培养1)种子罐发酵接种(体积百分比)的上述摇瓶菌液到种子罐(体积50L，含培养基30L)，发 酵培养，得到种子液。培养条件为罐温32°C、罐压0.02MPa、通气量1 1.0L/(L · min)、 搅拌速度260转/分、(旋转半径是0. 15米)、发酵时间10小时。2)发酵罐发酵接种3% (体积百分比)的种子液到发酵罐(体积1000L，含培养基600L)，发酵培 养，得发酵液。培养条件为罐温32°C、罐压0.06MPa、通气量11.0L/(L · min)、搅拌速 度220转/分(旋转半径是0. 40米)、发酵时间30小时。4、发酵液后处理发酵结束后，将发酵液经高速离心浓缩5倍，往得到的浓缩液中加入硅藻土与 Tween-80，使苏云金芽孢杆菌与硅藻土以及Tween-80的配比为5X IO11Cfu 30g 1.5g, 搅拌均匀，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度220°C，出口温度80°C，至含水率低于4%，分装。二、杀虫剂检测实验1、检测方法根据国家标准《苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂》GB/T19567. 3-2004对产品毒效进行 生物测定，以小菜蛾(Plutella xylostrella)为标准供试昆虫，以湖北省农业科学院生物 农药工程中心提供的CS-1991(H3a3b)为标准对照(标准品毒力效价为55000IU/mg)。按 照标准化程序进行毒力效价测定。
2、检测结果经检测，按上述方法制得的苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂可湿性粉剂产品毒力效价为14022IU/uL，达到合格级(可湿性粉剂产品毒力效价标准一级32000iυ/μ L，二级 16000iυ/μ L，合格级8000 υ/μ L)。该产品为灰色粉末，略带污泥发酵的酸味，没有恶臭。
权利要求
制备苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的培养基，是将污泥与矿质盐、消泡剂混合得到的培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述IL培养基中，污泥的固体质量为 20-50g，矿质盐为0. 5-1. 5g，消泡剂为1. 0-5. Og,其余为水。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于所述污泥的固体中，碳水化合物含量为 104-150g/kgTS，蛋白含量为 300-380g/kgTS，磷含量为 4-10g/kgTS。
4.根据权利要求1-3任一所述的培养基，其特征在于所述培养基中，矿质盐包括磷酸 氢二钾、硫酸镁和硫酸锰；所述消泡剂选自下述4种物质中的至少一种泡敌、聚丙二醇、豆 油和花生油，所述消泡剂优选是泡敌。
5.根据权利要求1-4任一所述的培养基，其特征在于所述培养基的PH为6.7-7. 3。
6.苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的制备方法，包括如下步骤将苏云金芽孢杆菌置于 权利要求1-5任一所述的培养基中进行发酵培养，制得苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述发酵培养包括以下步骤1)种子罐发酵将所述苏云金芽孢杆菌置于含有权利要求1-5任一所述的培养基 的种子罐中进行发酵培养，得到种子液，所述发酵培养的条件为罐温是28-32°C、罐压是 0. 02-0. 06MPa、通气量 1 1. 0-1. 5L/ (L ·π η)、搅拌速度 220-260 转 / 分、旋转半径是 0. 15 米、发酵时间10-15小时；2)发酵罐发酵将步骤1)得到的种子液移入含有权利要求1-5任一所述的培养 基的发酵罐中进行发酵培养，得到发酵液，所述发酵培养的条件为罐温28-32°C、罐压 0. 02-0. 06MPa、通气量 1 1. 0-1. 5L/ (L ·π η)、搅拌速度 180-220 转 / 分、旋转半径是 0. 40 米、发酵时间30-42小时。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述发酵培养完成之 后进行发酵液后处理；所述发酵液后处理包括以下步骤将所述步骤2)得到的发 酵液与展着剂以及防腐剂混合，使苏云金芽孢杆菌与展着剂以及防腐剂的配比为 IO11-IO12Cfu 10-50g 0.2-2. Og;所述展着剂是选自下述3种物质中的至少一种吐温 20、木素磺酸钠和壬基酚聚氧乙烯醚，所述展着剂优选是吐温20 ；所述防腐剂选自下述5种 物质中的至少一种山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯、尼泊金甲酯和凯松，所述防腐剂优选是山 梨酸钾。
9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述发酵培养完成 之后进行发酵液后处理；所述发酵液后处理包括以下步骤将步骤2)得到的发 酵液与分散剂与乳化剂混合，使苏云金芽孢杆菌与分散剂以及乳化剂的配比为 1O11-1O12Cfu 20-50g 1.0-4. Og;搅拌均勻后，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度 200-280°C，出口温度60-90°C，至含水率低于4% ；所述分散剂选自高岭土、硅藻土、膨润土 和轻质碳酸钙中的至少一种，所述分散剂优选是高岭土和/或硅藻土，所述乳化剂是选自 木素磺酸钠、吐温80和壬基酚聚氧乙烯醚中的至少一种，所述乳化剂优选是木素磺酸钠。
10.权利要求6-9任一所述的制备方法所制得的苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂。
全文摘要
本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂及其制备方法与专用培养基。本发明的培养基，是将污泥与矿质盐、消泡剂混合，经过灭菌而制备成的培养基。本发明的制备方法是将苏云金芽孢杆菌置于所述的培养基中进行发酵培养，制得苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂。采用本发明提供的方法制备杀虫剂降低了生物杀虫剂生产成本，产品附加值高，还克服了发酵过程中产生恶臭的缺陷。
文档编号A01N63/02GK101988043SQ20091009033
公开日2011年3月23日 申请日期2009年8月5日 优先权日2009年8月5日
发明者倪晋仁, 周顺桂, 常明 申请人:北京大学