专利名称：一种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法
技术领域：
本发明涉及植物病毒的防治技术领域，尤其涉及一种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法。
背景技术：
矮牵牛(Pe加"/a/^^/^)原产南美，属茄科碧冬茄属植物，是一种广泛用于盆栽、花坛的 草本植物。因其花期长，花色品种多而深受人们的喜爱，在美化环境上有很高的观赏价值。 但因病毒的严重危害，症状感病植株出现叶斑驳症，形成花叶，颜色有深有浅，常伴有叶巻 曲，生长势减弱，花畸形，变小等，使其观赏价值大大降低。据调查表明，种子繁殖的发病 率为20 30%，无性繁殖的发病率可高达卯％左右。自然侵染矮牵牛的病毒以黄瓜花叶病毒 (CMV)为主。
植物病毒是侵染蔬菜花卉药材和大田作物的细胞内致病的微生物，因为其按照寄主的细 胞系统进行基本的代谢和复制侵染过程，因些其不能像细菌和真菌等病原微生物那样通过药 物治疗达到根除效果。迄今，对植物病毒进行控制仍然没有"特效药"，控制的主要方法是预
防其侵染。实践证明预先接种弱病毒株能够干扰其后侵梁的强病毒株的危害，降低其影响，
达到抗病增产和改善作物品质的作用。以黄瓜花叶病毒(CMV)为例，该病毒能够侵染1000 多种植物，可经75种蚜虫传播，也是目前世界范围内寄主植物最多、分布最广、危害严重的 植物病毒之一。预防病毒传播媒介昆虫和获得无病毒繁殖材料并不是在任何情况下均能够有 效实施。用弱病毒株进行预防接种的方法是行之有效的方法之一。但是，预防接种的方法大 都采用浸根、喷枪和摩擦接种法，在接种弱病毒前必须进行种子消毒和苗床防治蚜虫、白粉 虱，严防幼苗在接种弱病毒前被强病毒感染，具有费时、使用方法繁琐、效率低等缺点，故 不利于产业化，无法满足现代农业的需求。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺陷，提供一种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现这种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，按如下步 骤进行
1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为-
(1) 基本培养基基本培养基采用MS培养基，其中，蔗糖或白糖20 30g/L，琼脂7 9g/L， pH5.6 6.0;
(2) 无菌播种培养基1/2MS;
(3) 诱导培养基1/3MS+BA1.0 3.0mg/L和NAA0.1 0.5mg/L;
5(4) 增殖培养基1/2MS+BA0.1 1.0mg/L和NAA 0.05 0.5mg/L;
(5) 壮苗培养基MS+BA0.1 0.5mg/L和NAA0.01 0.1mg/L;
(6) 生根培养基1/2MS+NAA0.01 0.1mg/L;
2)、矮牵牛茎尖脱毒培养
(1) 外植体的选取与灭菌取矮牵牛的种子，经灭菌处理后接种在无菌播种培养基上，
在培养条件下培养30 45天后，从种子培养成高约5 7cm的实生苗，无需灭菌直接作为茎 尖脱毒培养用的外植体；或取温室盆栽的性状纯正、生长健壮的矮牵牛植株上的幼芽，经灭 菌处理后作为茎尖脱毒培养用的外植体；
(2) 茎尖脱毒培养将无菌播种培养的实生苗的顶芽或灭菌处理后的温室盆栽的幼芽在 无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.15 0.3mm大小的带1 2个叶原基的茎尖， 接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30 45天后，从茎尖诱导形成幼芽或丛生芽；
(3) 增殖培养将诱导形成的幼芽或丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下 培养30 45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30 45天按同样方法进行幼苗 再增殖培养；
(4) 壮苗培养将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20 30天 后，幼苗株高生长达2 5厘米；
(5) 生根培养将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件
下培养20 30天后，幼苗长高成约5 7cm、苗基部长出5 10根细根；
(6) 移栽在隔离温室中，将生根组培苗移栽于基质中，培育1 2个月至成苗。
(7) 定植在隔离温室中，将移栽苗定植在温室盆钵中，培育3 5个月至植株开花。 3)、病毒ELISA检测
将常规温室中发生的矮牵牛病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白， 注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对移栽苗和开花植株进行病毒ELISA检
4)、弱病毒的接种 '
将黄瓜花叶病毒的弱病毒株通过常规汁液摩擦方法接种到步骤3)检测为无病毒的矮牵 牛植株上。
5)、弱病毒植株的组培繁殖
(1) 外植体的选取与灭菌取步骤4)检测为弱病毒的矮牵牛植株上的幼芽，经灭菌处 理后作为组培繁殖用的外植体；
(2) 诱导培养将灭菌处理后的幼芽接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30 45天后，诱导形成丛生芽；
(3) 增殖培养将诱导形成的丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下培养 30 45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30 45天按同样方法进行幼苗再增 殖培养；
(4) 壮苗培养将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20 30天 后，幼苗株高生长达2 5厘米；
(5) 生根培养将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件 下培养20 30天后，幼苗长高成约5 7cm、苗基部长出5 10根细根；
(6) 移栽将生根组培苗移栽于基质中，培育1 2个月至成苗。
(7) 定植将移栽苗定植在盆钵中，培育3 5个月至植株开花。 所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段
培养基的各组分与每升所含重量为-
(1) 基本培养基基本培养基采用MS培养基，其中，琼脂8g/L， pH5.8;
(2) 无菌播种培养基1/2MS+白糖20g/L;
(3) 诱导培养基1/3MS+BA1.0mg/L和NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L;
(4) 增殖培养基1/2MS+BA0.5mg/L和NAA0.1mg/L+白糖30g/L;
(5) 壮苗培养基MS+BA0.25mg/L和NAA0.05mg/L+白糖30g/L;
(6) 生根培养基1/2MS+NAA0.05mg/L+白糖20g/L。 所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，所述的无菌播种培养时种子的灭菌处理是经
75%酒精浸泡0.5 1.0分钟，再用0.1%升汞溶液灭菌20 30分钟，最后用无菌水冲洗3 5 次。
所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，所述的温室盆栽植株幼芽的灭菌处理是经75% 酒精浸泡0.5 1.0分钟，再用0.1%升汞溶液灭菌10 15分钟，最后用无菌水冲洗3 5次。
所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，所述的各组培阶段的培养条件是，培养温度为 25±2°C，光照光强为2200 2500Lx，光照时间为14h/d。
所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积 比2: 1: l配制而成。
所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，所述的弱病毒为黄瓜花叶病毒的弱病毒株N14、 黄瓜花叶病毒的卫星RNA生防制剂S52。
本发明的有益效果是
7(1) 利用植物组织培养技术进行接种弱病毒植株的组培繁殖，繁殖的组培苗100%携带 弱病毒，并可连续地繁殖下去，作为生产用种，省去以往每年生产前都需进行免疫接种，成 倍地提高了工作效率。
(2) 弱病毒保护的矮牵牛其花叶病毒和类似病症的发病率低于3%，植株健壮、花大色 艳，品质明显提高。
具体实施例方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。 实施例1:
这种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，按如下步骤进行
1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为
(1) 基本培养基基本培养基采用MS培养基，其中，琼脂8g/L， pH5.8;
(2) 无菌播种培养基1/2MS+白糖20g/L;
(3) 诱导培养基1/3MS+BA1.0mg/L和NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L;
(4) 增殖培养基1/2MS+BA0.5mg/L和NAA0.1mg/L+白糖30g/L;
(5) 壮苗培养基MS+BA0.25mg/L和NAA 0.05mg/L+白糖30g/L;
(6) 生根培养基1/2MS+NAA0.05mg/L +白糖20g/L。 2)、矮牵牛茎尖脱毒培养-
(1) 外植体的选取与灭菌取矮牵牛的种子，经灭菌处理后接种在无菌播种培养基上， 在培养条件下培养30 45天后，从种子培养成高约5 7cm的实生苗，无需灭菌直接作为茎 尖脱毒培养用的外植体；
(2) 茎尖脱毒培养将无菌播种培养的实生苗的顶芽或灭菌处理后的温室盆栽的幼芽在 无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.15 0.3mm大小的带1~2个叶原基的茎尖， 接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30 45天后，从茎尖诱导形成幼芽或丛生芽；
(3) 增殖培养将诱导形成的幼芽或丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下 培养30 45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30 45天按同样方法进行幼苗 再增殖培养；
(4) 壮苗培养将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20 30天 后，幼苗株高生长达2 5厘米；
(5) 生根培养将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件
下培养20 30天后，幼苗长高成约5 7cm、苗基部长出5 10根细根；
(6) 移栽在隔离温室中，将生根组培苗移栽于基质中，培育1 2个月至成苗。
8(7)定植在隔离温室中，将移栽苗定植在温室盆钵中，培育3 5个月至植株开花。 3)、病毒ELISA检测-
将常规温室中发生的矮牵牛病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白， 注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对移栽苗和开花植株进行病毒ELISA检
4)、弱病毒的接种
将黄瓜花叶病毒的弱病毒株通过常规汁液摩擦方法接种到步骤3)检测为无病毒的矮牵 牛植株上。
5)、弱病毒植株的组培繁殖-
(1) 外植体的选取与灭菌取步骤4)检测为弱病毒的矮牵牛植株上的幼芽，经灭菌处 理后作为组培繁殖用的外植体；
(2) 诱导培养将灭菌处理后的幼芽接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30 45 天后，诱导形成丛生芽；
(3) 增殖培养将诱导形成的丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下培养 30 45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30 45天按同样方法进行幼苗再增 殖培养；
(4) 壮苗培养将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20 30天 后，幼苗株高生长达2 5厘米；
(5) 生根培养将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件
下培养20 30天后，幼苗长高成约5 7cm、苗基部长出5 10根细根；
(6) 移栽将生根组培苗移栽于基质中，培育1 2个月至成苗。
(7) 定植将移栽苗定植在盆钵中，培育3 5个月至植株开花。
所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于所述的无菌播种培养时种子的灭
菌处理是经75%酒精浸泡1.0分钟，再用0.1%升汞溶液灭菌20分钟，最后用无菌水冲洗3 5次。
所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于，所述的各组培阶段的培养条件是， 培养温度为25士2t:，光照光强为2200 2500Lx，光照时间为14h/d。
所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭珍珠岩 蛭石按体积比2: 1: l配制而成。
所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于所述的弱病毒为黄瓜花叶病毒的
弱病毒株N14、黄瓜花叶病毒的卫星RNA生防制剂S52。本例中，其基本培养基的琼脂7g/L， pH5.6;无菌播种培养基1/2MS+白糖20g/L;诱导 培养基1/3MS+BA1.0mg/L和NAA O.lmg/L+庶糖30g/L;增殖培养基1/2MS+BA O.lmg /L和NAA 0.05mg/L+白糖30g/L;壮苗培养基MS+ BA O.lmg /L和NAA 0.01mg/L+白糖 30g/L;生根培养基1/2MS+NAA0.01mg/L+白糖20g/L。
取温室盆栽的性状纯正、生长健壮的矮牵牛植株上的幼芽，经75%酒精浸泡0.5分钟， 再用0.1%升汞水溶液浸泡10分钟，最后用无菌水冲洗3 5次进行灭菌处理，作为茎尖脱毒 培养用外植体的材料。
其余步骤，条件均同于实施例l。
实施例3:
本例中，其基本培养基的琼脂9g/L， pH6.0;无菌播种培养基1/2MS+白糖20g/L;诱导 培养基U3MS+BA3.0mg/L和NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L;增殖培养基1/2MS+BA1.0mg /L和NAA0.5mg/L+白糖30g/L;壮苗培养基MS+BA0.5mg /L和NAA O.lmg/L+白糖30g/L; 生根培养基1/2MS+NAA0.1mg/L+白糖20g/L。
取矮牵牛的种子，经75°/。酒精浸泡1.0分钟，再用0.1%升汞水溶液浸泡30分钟，最后 用无菌水冲洗3 5次进行灭菌处理，作为茎尖脱毒培养用外植体的材料。
其余步骤，条件均同于实施例l。
实施例4:
本例中，其基本培养基的蔗糖或白糖20 30g/L，琼脂7 9g/L， pH5.6 6.0;无菌播种 培养基1/2MS;诱导培养基1/3MS+BA 1.0 3.0mg/L和NAA 0.1 0.5mg/L;增殖培养基 1/2MS+BA0.1 1.0mg/L和NAA0.05 0.5mg/L;壮苗培养基MS+BA0.1 0.5mg/L禾口 NAA0.01 0.1mg/L;生根培养基1/2MS+NAA0.01 0.1mg/L。
取矮牵牛的种子，经75%酒精浸泡0.5 1.0分钟，再用0.1%升汞水溶液浸泡20 30分 钟，最后用无菌水冲洗3 5次进行灭菌处理，作为茎尖脱毒培养用外植体的材料。或取温室 盆栽的性状纯正、生长健壮的矮牵牛植株上的幼芽，经75%酒精浸泡0.5 1.0分钟，再用0.1% 升汞水溶液浸泡10 15分钟，最后用无菌水冲洗3 5次进行灭菌处理，作为茎尖脱毒培养 用外植体的材料。
其余步骤，条件均同于实施例l。
试验例
1)、对照材料以种子实生苗培育的植株、扦插繁殖培育的植株和脱毒组培苗培育的植
株为材料；
102) 、处理材料以实施例1或实施例2或实施例3或实施例4获得的携带弱病毒的组培 苗培育的植株为材料。
3) 、性状观察
观察对照材料、处理材料的植株发病率、病毒危害症状等。
4) 、病毒ELISA检测
分别将常规温室中发生的矮牵牛病毒或弱病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关 病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对对照材料、处理材料
的植株进行病毒ELISA检测。
5) 、试验结果
接种弱病毒的植株通过组培繁殖获得的组培苗100%携带弱病毒，弱病毒保护的矮牵牛其 花叶病毒和类似病症的发病率低于3%，非弱病毒保护的种子实生苗培育的植株、扦插繁殖培 育的植株和脱毒组培苗培育的植株的花叶病毒和类似病症的发病率为30 80%，弱病毒保护 的矮牵牛植株健壮、花大色艳，品质比种子实生苗培育的植株、扦插繁殖培育的植株和脱毒 组培苗培育的植株明显提高。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技 术方案，均落在本发明要求的保护范围。
1权利要求
1、一种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1)基本培养基基本培养基采用MS培养基，其中，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～6.0；(2)无菌播种培养基1/2MS；(3)诱导培养基1/3MS+BA1.0～3.0mg/L和NAA0.1～0.5mg/L；(4)增殖培养基1/2MS+BA0.1～1.0mg/L和NAA0.05～0.5mg/L；(5)壮苗培养基MS+BA0.1～0.5mg/L和NAA0.01～0.1mg/L；(6)生根培养基1/2MS+NAA0.01～0.1mg/L；2)、矮牵牛茎尖脱毒培养(1)外植体的选取与灭菌取矮牵牛的种子，经灭菌处理后接种在无菌播种培养基上，在培养条件下培养30～45天后，从种子培养成高5～7cm的实生苗，无需灭菌直接作为茎尖脱毒培养用的外植体；或取温室盆栽的性状纯正、生长健壮的矮牵牛植株上的幼芽，经灭菌处理后作为茎尖脱毒培养用的外植体；(2)茎尖脱毒培养将无菌播种培养的实生苗的顶芽或灭菌处理后的温室盆栽的幼芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.15～0.3mm大小的带1～2个叶原基的茎尖，接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天后，从茎尖诱导形成幼芽或丛生芽；(3)增殖培养将诱导形成的幼芽或丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼苗再增殖培养；(4)壮苗培养将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20～30天后，幼苗株高生长达2～5厘米；(5)生根培养将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20～30天后，幼苗长高成5～7cm、苗基部长出5～10根细根；(6)移栽在隔离温室中，将生根组培苗移栽于基质中，培育1～2个月至成苗；(7)定植在隔离温室中，将移栽苗定植在温室盆钵中，培育3～5个月至植株开花；3)、病毒ELISA检测将常规温室中发生的矮牵牛病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对移栽苗和开花植株进行病毒ELISA检测；4)、弱病毒的接种将黄瓜花叶病毒的弱病毒株通过常规汁液摩擦方法接种到步骤3)检测为无病毒的矮牵牛植株上；5)、弱病毒植株的组培繁殖(1)外植体的选取与灭菌取步骤4)检测为弱病毒的矮牵牛植株上的幼芽，经灭菌处理后作为组培繁殖用的外植体；(2)诱导培养将灭菌处理后的幼芽接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天后，诱导形成丛生芽；(3)增殖培养将诱导形成的丛生芽切成单芽接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出丛生芽；根据对幼苗数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼苗再增殖培养；(4)壮苗培养将增殖出的丛生芽接种到壮苗培养基上，在培养条件下培养20～30天后，幼苗株高生长达2～5厘米；(5)生根培养将培养的壮苗切成单株接种在生根培养基中进行生根培养，在培养条件下培养20～30天后，幼苗长高成约5～7cm、苗基部长出5～10根细根；(6)移栽将生根组培苗移栽于基质中，培育1～2个月至成苗；(7)定植将移栽苗定植在盆钵中，培育3～5个月至植株开花。
2、 根据权利要求1所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为(1) 基本培养基基本培养基采用MS培养基，其中，琼脂8g/L， pH5.8;(2) 无菌播种培养基1/2MS+白糖20g/L;(3) 诱导培养基1/3MS+ BA l.Omg/L和NAA0.2mg/L +蔗糖30g/L;(4) 增殖培养基1/2MS+BA 0.5mg/L和NAA0.1mg/L+白糖30g/L;(5) 壮苗培养基MS+BA0.25mg/L和NAA0.05mg/L+白糖30g/L;(6) 生根培养基1/2MS+NAA0.05mg/L+白糖20g/L。
3、 根据权利要求1所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于所述的无菌播 种培养时种子的灭菌处理是经75%酒精浸泡0.5 1.0分钟，再用0.1%升汞溶液灭菌20 30 分钟，最后用无菌水冲洗3 5次。
4、 根据权利要求l所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于所述的温室盆 栽植株幼芽的灭菌处理是经75%酒精浸泡0.5 1.0分钟，再用0.1%升汞溶液灭菌10 15分 钟，最后用无菌水冲洗3 5次。
5、 根据权利要求1所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于，所述的各组培 阶段的培养条件是，培养温度为25士2。C，光照光强为2200 2500Lx，光照时间为14h/d。
6、 根据权利要求1所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭珍珠岩蛭石按体积比l: 2: 2配制而成。
7、 根据权利要求1所述的弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，其特征在于所述的弱病毒为黄瓜花叶病毒的弱病毒株N14、黄瓜花叶病毒的卫星RNA生防制剂S52。
全文摘要
本发明涉及一种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法，按如下步骤进行1)培养基的配制；2)矮牵牛茎尖脱毒培养；3)病毒ELISA检测4)弱病毒的接种；5)弱病毒植株的组培繁殖。本发明的有益效果是利用植物组织培养技术进行接种弱病毒植株的组培繁殖，繁殖的组培苗100％携带弱病毒，并可连续地繁殖下去，作为生产用种，省去以往每年生产前都需进行免疫接种，成倍地提高了工作效率。弱病毒保护的矮牵牛其花叶病毒和类似病症的发病率低于3％，植株健壮、花大色艳，品质明显提高。
文档编号A01N63/02GK101496527SQ200910096468
公开日2009年8月5日 申请日期2009年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者吕永平, 刚 徐, 汪一婷, 牟豪杰, 陈剑平 申请人:浙江省农业科学院