专利名称：一种用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊的方法
技术领域：
本发明涉及转基因羊的生产，尤其是在卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊的方法，采用该法可有效提高胚胎存活率和转基因率。
背景技术：
通过转基因技术方法获得的动物称为转基因动物。慢病毒(lentivirus，LV)是逆转录病毒科的病毒成员。传统的转基因法有反转录病毒感染法、胚胎干细胞法、精子载体法、生殖细胞转染法、细胞核移植法、原核显微注射法，但这几种方法都存在着转基因率低、成本高的缺陷。因为与传统的原核显微注射技术相比，卵周隙注射不需要将注射针插入核内，也不受不同种内动物原核的大小和核膜的清晰度差异的所限。文献检索披露1.TransgenicRes(2007)16661-664，作者William A.Ritchie等发表的《用低滴度慢病毒生产转基因鼠》的文章，揭示卵周隙内反复注射低滴度病毒(107TU/ml)比单次注射病毒生产出的胚胎阳性率为23％∶1％。2.FEBS 571(2004)233-236，作者C.Bruce A.Whitelaw等发表的《用EIAV病毒衍生的带菌体生产转基因猪》的文章，揭示在受精卵卵周隙内注射EIAV病毒，将胚胎移植给受体，出生的小猪中92％为阳性。3.Biology of reproduction 71，405-409(2004)，作者AndreasHofmann等发表的《通过注射慢病毒生产转基因牛》的文章，揭示在受精卵卵周隙内注射病毒质粒，出生的4只牛犊都不是转基因；在卵周隙内注射慢病毒，体外受精后囊胚中的83％为阳性。4.2007年9月23卷5期《生物工程学报》上马强等人发表的《一种新型慢病毒载体制备方法的建立》的文章，揭示将构建好的主框架质粒pVECRNA、pGAGPOL及包膜质粒pVSVG通过脂质体共转染至BHK21细胞，再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞，培养4天后，提取培养上清的RNA，进行RT-PCR反应；通过荧光显微镜观察到感染组293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞，说明此系统制备出的慢病毒载体具有感染性等等。上述已有方法用于转基因牛和猪的生产，但很少有用于生产转基因羊的报道。本发明以此为切入点，展开的研究方法具有科学性与实践性。
发明内容
本发明的目的在于用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊的方法，提高羊的转基因率，降低转基因羊的生产成本。
本发明的目的是这样实现的一种用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊的方法，将慢病毒载体与病毒包装质粒共转染为293T细胞，至48小时后离心，得慢病毒的浓缩液，将其注射于成熟24-25小时的卵母细胞卵周隙内，与精子结合实施体外受精，12小时后置于培养液中培养，48小时后统计卵裂率和转基因率； 其一，取绵羊卵巢，用生理盐水灭菌清洗3-4次，抽取卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-4次，按25-30枚/滴入前2小时平衡好的体积为75-78μl/滴的体外成熟培养液滴，放入CO2箱，在5％CO2，95％空气条件下培养； 其二，将体外成熟24-25小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸，脱去卵丘细胞；将慢病毒注射入卵母细胞卵周隙内，用体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入前2小时平衡好的50-70μl的受精液内；用水浴解冻精液，移入2小时前平衡好的装有受精液的试管内，放入CO2箱，上游20-25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×106个/ml的密度加入受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育； 其三，将受精12-18小时后的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养。
所述生产转基因羊的方法，药剂的配制 抽卵液TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素钠； 成熟液TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml双抗； 显微操作液PBS+10％FBS； SOF6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O； 受精液SOF+20％发情羊血清(自制)+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素； 培养液SOF+3mg/ml BSA。
所述生产转基因羊的方法，慢病毒在转染293T细胞时，采用细胞仪检测，滴度达到1.5×109tu/ml。
所述生产转基因羊的方法，采羊的静脉血，放置4℃冰箱内冷冻24小时，将析出的血清放在56℃水浴锅内灭活30-33分钟，即得发情羊血清。
所述生产转基因羊的方法，在抽取卵母细胞前，先吸入1毫升吸卵液备用。
所述生产转基因羊的方法，选用配制药品的原料，除自制外，均为市售产品。
本发明采用的卵周隙注射不需要将注射针插入核内，也不受不同种内动物原核的大小和核膜的清晰度差异的所限，而且操作简单，注射对核膜和胞膜均无损伤，胚胎存活率明显升高。据报道，小鼠采用卵周隙内注射慢病毒胚胎的转基因率比原核显微注射法转基因率约高8倍，生仔鼠的转基因率提高约4倍。
本发明方法以48小时后的统计结果，验证其技术效果 (1)卵母细胞受精前、后注射卵裂率、阳性率的比较，见表1。
表1 上述结果说明受精前后注射慢病毒浓缩液，不影响其后期发育和阳性率。
(2)受精后胚胎不同发育阶段注射阳性率的比较，见表2。
表2 上述结果说明受精后不同时期的胚胎注射慢病毒浓缩液，不影响其后期发育和基因的表达。
(3)不同发育时期注射阳性率与强弱比的比较，见表3。
表3 上述结果说明随着胚胎的发育，注射慢病毒后，阳性率、荧光强度有逐渐下降的趋势，所以，在转基因羊生产上，尽量选用4细胞期之前的胚胎。
(4)成熟24小时后的卵母细胞注射不同量的病毒的比较，见表4。
表4 上述结果说明注射量在50-100pl之间，不影响囊胚率、阳性率和基因表达的强度。
本发明采用此方法，将慢病毒浓缩液注射过的绵羊受精胚胎移植给受体，怀孕35天后，破腹产取出胎儿，用于检测，发现，在胎儿的头、踢、内脏等器官上都发现有绿色荧光蛋白，证明此胎儿为转基因绵羊。
本方法慢病毒的制备，将慢病毒载体与病毒包装质粒共同转染293T细胞，通过流式细胞仪检测，滴度达到1.5×109tu/ml，48小时后收集上清超速离心，进行病毒浓缩。
本发明构思与实现的转基因绵羊生产方法简单、可操作性强，将慢病毒浓缩液注射过的绵羊受精胚胎移植给受体，经检测发现有绿色荧光蛋白，表达了转基因羊的生命体征，彰显技术进步。
图1为绵羊卵母细胞卵周隙注射慢病毒后体外发育的囊胚放大200倍显微镜片。
图2为图1所对应的囊胚经过蓝光照射后发出的绿色荧光放大200倍显微镜片。
图3为经过慢病毒注射后的胚胎移植给受体，怀孕35天后破腹产取出一只胎儿头组织的切片。
图4为经过慢病毒注射后的胚胎移植给受体，怀孕35天后破腹产取出一只胎儿头组织的切片，部分组织经过蓝光照射激发后发出的绿色荧光。
具体实施例方式 下面结合实施例说明本发明的实施方式。
实施例 实验药剂的配制 抽卵液TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素钠； 成熟液TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml双抗； 显微操作液PBS+10％FBS； SOF6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml4KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O； 受精液SOF+20％发情羊血清(自制)+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素； 培养液SOF+3mg/mlBSA。
发情羊血清制备采羊的静脉血，放置4℃冰箱内冷冻24小时，将析出的血清放在56℃水浴锅内灭活30-33分钟，即得。
技术操作 将慢病毒载体与病毒包装质粒共转染为293T细胞，至48小时后离心，得慢病毒的浓缩液，将其注射于成熟25小时的卵母细胞卵周隙内，与精子结合实施体外受精，12小时后置于培养液中培养，48小时后统计卵裂率和转基因率； 取绵羊卵巢，用生理盐水灭菌清洗3次，抽取卵母细胞(先吸入1毫升吸卵液)，用体外成熟液洗涤4次，按28枚/滴入前2小时平衡好的体积为75μl/滴的体外成熟培养液滴，放入CO2箱，在5％CO2，95％空气条件下培养； 将体外成熟25小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理50s，经吹吸，脱去卵丘细胞；将慢病毒注射入卵母细胞卵周隙内，用体外受精液洗涤2-4次，按28枚/滴的密度加入前2小时平衡好的70μl的受精液内；用水浴解冻精液，移入2小时前平衡好的装有受精液的试管内，放入CO2箱，上游25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按3×106个/ml的密度加入受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育； 将受精16小时后的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤3次，按70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养。
权利要求
1.一种用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊的方法，其特征在于将慢病毒载体与病毒包装质粒共转染为293T细胞，至48小时后离心，得慢病毒的浓缩液，将其注射于成熟24-25小时的卵母细胞卵周隙内，与精子结合实施体外受精，12小时后置于培养液中培养，48小时后统计卵裂率和转基因率；
其一，取绵羊卵巢，用生理盐水灭菌清洗3-4次，抽取卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-4次，按25-30枚/滴入前2小时平衡好的体积为75-78μl/滴的体外成熟培养液滴，放入CO2箱，在5％CO2，95％空气条件下培养；
其二，将体外成熟24-25小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸，脱去卵丘细胞；将慢病毒注射入卵母细胞卵周隙内，用体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入前2小时平衡好的50-70μl的受精液内；用水浴解冻精液，移入2小时前平衡好的装有受精液的试管内，放入CO2箱，上游20-25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×106个/ml的密度加入受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育；
其三，将受精12-18小时后的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养。
2.按照权利要求1所述生产转基因羊的方法，其特征在于药剂的配制
抽卵液TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素钠；
成熟液TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml双抗；
显微操作液PBS+10％FBS；
SOF6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；
受精液SOF+20％发情羊血清(自制)+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；
培养液SOF+3mg/ml BSA。
3.按照权利要求1所述生产转基因羊的方法，其特征在于慢病毒在转染293T细胞时，采用细胞仪检测，滴度达到1.5×109tu/ml。
4.按照权利要求1所述生产转基因羊的方法，其特征在于采羊的静脉血，放置4℃冰箱内冷冻24小时，将析出的血清放在56℃水浴锅内灭活30-33分钟，即得发情羊血清。
5.按照权利要求1所述生产转基因羊的方法，其特征在于在抽取卵母细胞前，先吸入1毫升吸卵液备用。
6.按照权利要求1所述生产转基因羊的方法，其特征在于选用配制药品的原料，除自制外，均为市售产品。
全文摘要
本发明提供一种用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊的方法，将慢病毒载体与病毒包装质粒共转染为293T细胞，至48小时后离心，得慢病毒的浓缩液，将其注射于成熟24-25小时的卵母细胞卵周隙内，与精子结合实施体外受精，12小时后置于培养液中培养，48小时后统计卵裂率和转基因率。其一取卵母细胞用体外成熟液洗涤3-4次，按25-30枚/滴入体积75-78μl/滴的体外成熟培养液，在5％CO2、95％下培养；其二体外成熟的卵母细胞脱去卵丘细胞，慢病毒注射入细胞卵周隙内，用体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴入受精液内；解冻精液，移入受精液，离心弃上清液，沉淀精子加受精液滴，孵育；取受精12-18小时的卵，按上步处理后入四孔培养板内培养即可；其三为药剂慢病毒液、抽卵液、成熟液、显微操作液、SOF、受精液、培养液、养血清的必备。
文档编号A01K67/027GK101760476SQ20091011356
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者黄俊成, 汪立芹, 刘明军, 赵云程, 陈童, 林嘉鹏, 王静 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国—澳大利亚绵羊育种研究中心