专利名称：生长快成活率高牙鲆优良品系的选育方法
技术领域：
本技术属于海洋生物技术领域，是一种选择培育生长速度快、成活率高牙鲆新品系的育种方法。
背景技术：
牙鲆(Paralichthys olivaceus)是分布在我国沿海的主要经济鱼类，是天然捕捞、工厂化、池塘和网箱养殖的主要对象，在渔业产量中占有较大的比重。但是随着对天然鱼类资源捕捞强度的加大，牙鲆种质资源的衰退已经显现。另外在人工养殖环境下，长期以来我国对牙鲆优良品种选育未得到足够的重视，近亲交配繁殖、集约化养殖等导致牙鲆养殖品种种质退化、生长速度降低、养殖周期长、养殖效率低，严重影响了牙鲆苗种大面积养殖推广和产业化的发展。因此利用牙鲆不同地理群体及人工筛选的抗病群体进行牙鲆品种培育，培育生长速度快、抗逆力强的牙鲆养殖新品种，对于牙鲆种质恢复、提高养殖产品质量和经济效益具有重要意义。在牙鲆养殖新品种的研究方面，Kanako Fuji等筛选培育出一个能够抗病淋巴囊肿病的养殖群体(Faculty of Marine Science，Tokyo University ofMarine Science and Technology，Kanako Fuji et al，Aquaculture，2006)。近年来本课题组利用微卫星标记和AFLP技术对牙鲆养殖群体和野生群体的遗传结构进行评价(中国水产科学研究院黄海水产研究所，Liu et al，Aquaculture，2005)，发现养殖群体的遗传多样性明显降低。分析了牙鲆抗病鱼和不抗病鱼的MHC II B基因多态性与抗鳗弧菌病的相关性，初步筛选到抗病相关的MHC II B基因型(中国水产科学研究院黄海产研究所，Zhang etal，Marine Biotechnology，2006)，同时利用3个育种群体建立了牙鲆家系(中国水产科学研究院黄海产研究所，陈松林，田永胜等，水产学报，2008)，从此展开了国内牙鲆育种工作，但是在生长快、成活率高牙鲆新品系的选择培育方面在国内外还属首次。
发明内容
本发明的目的是针对人工养殖环境下牙鲆苗种生长速度慢和成活率低的问题，培育出生长速度快、成活率高的牙鲆新品系，从而提高牙鲆养殖经济效益。
本发明是通过以下技术方法实现的 本发明内容主要包括1、牙鲆育种群体培育和生殖调控，2、精子冷冻技术辅助家系建立，3、家系培育和标准化，4、数量性状的测量和分析，5、遗传参数估计，6、优良家系筛选，7、利用异源冷冻精子诱导牙鲆雌核发育构建优良品系。
1、牙鲆育种群体培育和生殖调控 将如下3个牙鲆育种群体分别利用电子标识标记，建立育种档案，在人工养殖条件下集中饲养培育，达到2-3龄。育种群体的年培育温度控制在13-25℃，采用正常日照，每年2-5月的繁殖季节水温控制在14-17℃，光照时间15h，光照强度1500-2000lux，连续照射1-2月，水流交换量为6-7m3/h，亲鱼在非繁殖季节利用市售人工配合铒料饲喂，繁殖季节利用添加维生素E的野杂鱼饲喂。经过以上培育达到性成熟，可产出成熟卵子。4个育种群体包括①抗病育种群体(RS)利用人工感染鳗弧菌的方式从养殖群体中筛选感染病菌后长期不发病的个体100尾组成。②日本育种群体(JS)从日本引进牙鲆鱼苗经人工培育、筛选30尾组成。③黄海育种群体(YS)从山东省烟台地区沿海收集天然捕捞的野生牙鲆个体50尾组成。
2、精子冷冻技术辅助家系建立 利用人工挤压腹部法，采集成熟牙鲆亲鱼精液，利用MPRS+20％DMOS溶液以体积比1∶1的比例稀释，注入2.0ml冷冻管中，放入液氮中冷冻保存，MPRS溶液的各成分浓度为NaCl 60.35mM，NaH2PO41.8mM；NaHCO33mM，KCl 5.23mM，CaCl2.2H2O 1.13mM，MgCl2.6H2O 1.13mM，D-Glucose 55.55mM。DMSO为市售二甲基亚砜。
利用以上方法冷冻保存以上3个育种群体及筛选优良家系成熟雄鱼的精子，并且从其它养殖公司收集和冷冻保存了牙鲆雄鱼精子，预先建立牙鲆育种群体精子冷冻库，利用冷冻精子辅助人工受精。在3个育种群体之间或群体内亲本之间，采用1雄多雌或1雌多雄的交配方式建立牙鲆家系。
3、家系培育和标准化 利用水质、水流量、温度和光照可控制的循环水车间进行家系孵化、苗种培育，每个家系的培育水体为3m3水缸，水流量可在1-5m3/h之间调控，水温可在14-25℃调控，光照可保持10-15h。利用小球藻、轮虫和卤虫进行早期鱼苗的培育，利用人工配合饵料进行后期鱼苗的培育。分别在鱼苗生长至15、50、90、150、210d左右对每个家系的养殖数量进行标准化，标准化鱼苗数量分别为10000、1000、500和200尾，210d将标准化鱼苗集中饲养在1-2个30m3水池中，同时利用红、橙、黄3种荧光颜料，在鱼苗腹部选择背前、背中、背后、腹后和腹中5个位置，利用注射方式对选择家系个体进行标记。
4、数量性状测量和分析 家系生长性状测量家系数量性状的测量时间为生长至90、210、510、720(2龄)几个时间段，90-210天是牙鲆家系建立后第一个高温季节，也是牙鲆鱼苗的第一个快速生长期；210-510天为鱼苗第一个越冬期和第二个快速生长期，720天鱼苗已经度过了第二个冬季，大部分个体已经达到了商品鱼规格，而且部分生长快的个体达到了性成熟。在各时期相继测量鱼苗的体长(从吻端至尾鳍末端)、体重和养殖存活数量。
性状分析利用牙鲆家系不同生长时期测量的体长、体重数据，采用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls(SNK)法对不同家系生长性状进行多重比较分析，同时计算生长平均值和标准差。利用绝对增重公式AGRW(g.d-1)＝(W2-W1)/(t2-t1)计算每个家系生长一定时期的绝对增重率。利用(鱼苗成活数量/标准化后总数)*100％计算家系成活率。分析家系间的生长差异，选择出生长最快和成活率高的家系。
5、遗传参数的估计 利用不同生长时期测定的牙鲆家系体长、体重数据，采用线形混合模型(Linear mixed model)、“加性-显性”遗传分析模型及约束极大似然法(REML)估计体长和体重性状的加性和显性方差组分、协方差组分、遗传相关和遗传力。加性和显性方差达到极显著水平(P＜0.01)，遗传相关达到极显著正相关水平(P＜0.01)，遗传力达到极显著(P＜0.01)且大于0.2，说明对体长和体重的选择效果明显，以此来检测选择育种过程中遗传因素和环境因素发生的作用，为牙鲆选择育种提供相关参数。
6、优良家系筛选 通过对标准化后家系生长性状的测定和对比分析，从建立的家系中筛选出体长和体重具有显著性差异(P＜0.05)，90-524d的绝对增重率在0.25以上，成活率在80％以上的家系，做为生长快、成活率高家系继续培育。将筛选出的家系利用标记从集中养殖池中与其它家系分离，专池培育至2-3龄达性成熟，培育方法如内容1所述，并在每个个体上注射永久性电子标记，记录电子标识，建立育种档案。
7、利用异源冷冻精子诱导牙鲆雌核发育构建优良品系 预先采集成熟的鲈鱼精子，利用MPRS+20％DMOS溶液以体积比1∶1的比例稀释鲈鱼精子，采用2.0ml冷冻管在液氮中冷冻保存，建立鲈鱼精子冷冻库，MPRS溶液的各成分浓度为NaCl 60.35mM，NaH2PO41.8mM；NaHCO33mM，KCl 5.23mM，CaCl2.2H2O 1.13mM，MgCl2.6H2O 1.13mM，D-Glucose55.55mM。DMSO为市售二甲基亚砜。
将筛选的优良家系培育至性成熟，通过人工生殖调控达到产卵要求，利用人工挤压腹部法采集未受精卵。随之利用37℃水浴解冻鲈鱼精子，利用MPRS稀释液将精子以1∶10的比例稀释，在直径为10cm的培养皿中加入1ml稀释精液铺平，在40000μJ/cm2强度紫外线下照射，使其遗传物质失活，加入牙鲆卵中进行干法授精，受精卵与精液比为100∶0.4，授精3min后浸入2～4℃海水中冷休克处理45min，使其染色体加倍，然后将卵放入17℃海水孵化，至此完成了优良牙鲆家系雌核发育，建立优良品系。
本发明技术方案的技术特点1、利用了太平洋西岸牙鲆分布上具有典型地理特点的牙鲆育种群体日本牙鲆和黄海牙鲆，以及人工感染方法构建了抗病牙鲆群体，丰富了牙鲆优良品种选育的遗传背景。2、将鱼类精子冷冻保存技术溶合到牙鲆家系的建立中，为杂交组配提供了丰富的牙鲆精子来源和更多的组配方式，提高了家系建立效率。3、利用异源冷冻鲈鱼精子诱导了牙鲆优良家系个体雌核发育，提高了优良家系基因的纯合速度，1代雌核发育相当了4代全同胞兄妹自交，同时异源精子的诱导保证了雌核发育后代基因的纯合性。4、通过大量家系的建立和筛选、数量性状的测量和多重比较、遗传参数的估计和雌核发育方法筛选并建立了生长速度快牙鲆新品系0719、0750和0751。5、将精子冷冻技术、雌核发育技术、数量性状的遗传参数估计等现代生物技术与传统的选择育种有机的结合在一起，提高了新品种选育的效率，建立了一条育种的新途径。
具体实施例方式 本发明技术方案所依据的科学原理将现代生物技术与传统的选择育种技术相结合进行新品种培育。选择育种(selective breding)是根据育种目标，在现有品种或育种材料内出现的自然变异类型中，经比较鉴定，通过多种选择方法，选优去劣，选出优良的变异个体，培育新品种的方法。家系选育是选择育种的方法之一，通过家系的建立、繁殖、比较，淘汰不良家系，选择符合标准的家系，逐代提高品种的遗传纯合性，可选育出具有稳定优良性状的新品种。本发明技术将精子冷冻保存技术、雌核发育技术、遗传参数估计等现代生物技术与传统的选择育种技术有机的结合在一起，提高育种水平，显著加快了鱼类新品种培育进程。
下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容 本发明内容主要包括1、牙鲆育种群体培育和生殖调控，2、精子冷冻技术辅助家系建立，3、家系培育和标准化，4、数量性状的测量和分析，5、遗传参数估计，6、优良家系筛选，7、利用异源冷冻精子诱导牙鲆雌核发育构建优良品系。
1、牙鲆育种群体培育和生殖调控 将3个牙鲆育种群体利用电子微粒注射法进行标记，并记录其电子标识，同时对其体长、体重进行测量和记录，建立育种群体档案。3个育种群体包括①抗病育种群体(RS)利用人工感染鳗弧菌的方式从养殖群体中筛选感染病菌后长期不发病的个体100尾组成。②日本育种群体(JS)从日本引进牙鲆鱼苗经人工培育、筛选30尾组成。③黄海育种群体(YS)从山东省烟台地区沿海收集天然捕捞的野生牙鲆个体50尾组成。
经过人工培育达到2-3龄，育种群体的年培育温度控制在13-25℃，采用正常日照，每年2-5月的繁殖季节水温控制在14-17℃，光照时间15h，光照强度1500-2000lux，连续照射1-2月，水流交换量为6-7m3/h，亲鱼在生长季节以投喂人工混合饲料，繁殖期饲喂添加维生素E的野杂鱼，经过以上生长和生殖调控，达到性成熟和人工繁殖要求，人工挤压鱼体腹部可流出成熟的卵子和精子。
2、精子冷冻技术辅助家系建立 牙鲆精子冷冻保存方法利用人工挤压腹部法采集成熟的牙鲆精子，显微镜检测精子活力，活力在70％以上者，利用MPRS+20％DMOS溶液以体积比1∶1的比例稀释，采用2.0ml冷冻管在液氮中冷冻保存。共冷冻保存各育种群体的牙鲆精子500余份(约900ml)，建立牙鲆精子冷冻库。在人工繁殖时，将冷冻保存的牙鲆精子在37℃水浴中解冻，镜检冻后精子活力，如精子活力保持在70％以上，可与采集的牙鲆卵干法受精，受精时卵精比例为100ml∶1ml。
牙鲆家系建立方法利用以上3个育种群体，选择群体中性成熟个体，人工采集卵子和精子(或冷冻库中精子)，在3个育种群体内或群体间采用如下交配方式建立半同胞或全同胞家系RS♂×JS♀、RS♂×RS♀、RS♂×YS♀、JS♂×RS♀、JS♂×JS♀、JS♂×YS♀、YS♂×RS♀、YS♂×JS♀。(表1)。
表1 2007牙鲆家系系谱
注RS抗病牙鲆，JS日本牙鲆，YS黄海牙鲆 3、家系的培育和标准化 家系培育牙鲆家系鱼苗培养在3m3水缸中，早期采用微流水，每天交换量1-2m3，保持水质清新，每天早晚各1次利用虹吸法清洗池底沉淀的藻类、过剩的饲料。3m3水缸中放养初孵仔鱼数量在10000尾左右，伏底鱼苗(体长1cm)2000尾，5-7cm鱼苗1000尾，10-15cm鱼苗500尾。水体中小球藻的浓度保持在8～10万个/ml，轮虫投喂量以水中5-10个/ml为宜，卤虫投喂量以1-2个/ml为宜。人工饲料的投喂应当以鱼苗规格大小及时调节饲料颗粒大小，第12-15天开始投喂颗粒配合饲料，25天前苗种颗粒饲料粒径250-400μm，0.1-0.15g体重的仔稚鱼颗粒饲料粒径400-600μm，0.5g体重颗粒饲料粒径800μm左右。随着鱼体的生长，配合饲料粒径逐渐增加。配合饲料日投饲量为鱼体重的5-15％，投喂及时，宜少投勤投。防止饲料过剩、温度变化、水质污染、水流不稳定等现象发生。
家系标准化家系标准化的主要目的将养殖环境造成的家系差异降低到最低。家系养殖至15天左右对鱼苗密度进行初步调整，使每缸鱼苗数量保持在10000尾左右，养殖到50天对所有家系进行第一次标准化，每个家系随机选留2000尾鱼。90天左右(5-7cm)选留1000尾，150天左右(10-15cm)选留500尾继续养殖。养殖到210天左右从每个家系中随机的选择200尾个体，利用红、黄、橙3个种荧光颜料，在鱼苗腹部选择背前、背中、背后、腹后和腹中5个位置进行标记，标记后集中饲养在1-2个30m3水池中，同时对选择家系个体的体长、体重逐一测量，此时完成家系数量和养殖环境的标准化。
4、数量性状的测量和分析 2007年建立牙鲆家系在生长到平均日龄至90、524d左右，对每个家系的体长、体重、成活率进行了测量，利用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls(SNK)法对不同家系生长性状进行多重比较，分析家系间的生长差异。利用绝对增重率(AGRW，g.d-1)＝(W2-W1)/(t2-t1)，对每个家系生长90d至524d绝对增重率进行了计算，平均日龄(t2-t1)按286d计算，成活率＝(524d家系存活数量/200尾)*100％，依据绝对增重率和养殖成活率筛选出生长快、成活率高的家系，0719、0750、0703、0751号家系生长最快成活率最高(表2)。
表2 2007年牙鲆家系90d和524d生长性状比较
注*在生长方面具有显著性差异(P＜0.05) 5、遗传参数的估计 利用2007年建立了63个家系，收集了所有家系5328尾鱼苗的体长和体重数据.借助线形混合模型(Linear mixed model)、“加性-显性”模型、约束极大似然法(REML)分别估计体长和体重的遗传相关和遗传力。结果显示体长和体重两性状的加性、显性、表型和基因型相关分量都达到极显著水平(P＜0.01)，体长和体重的加性方差比率均大于显性方差比率，可见两性状的遗传效应主要取决于基因的加性效应。体长和体重达到极显著正相关(P＜0.01)。体长的总遗传效应率为31.20％，体重的总遗传效应率为33.58％，体长和体重的随机方差比率分别达到68.80％和66.41％，说明养殖环境等因素对牙鲆体长和体重的影响较大，同时说明在牙鲆选择育种中消除环境影响极为重要。体长和体重的狭义遗传率分别为0.20和0.26(P＜0.01)，广义遗传率分别为0.31和0.34(P＜0.01)，牙鲆在以上两性状上属于中等遗传力，通过选择育种可取得较大的遗传进展(表3)。
表3利用“加性-显性”模型对牙鲆家系体长和体重方差分量、方差分量比率及遗传力估计结果
注0**表示显著性水平P＜0.01 6、优良家系的筛选 经过对2007年家系培育、生长、成活率性状的测定、多重比较及遗传参数估计，筛选出了2007年家系中具有生长快、成活率高性状的牙鲆家系共4个分别为0719、0703、0750和0751(表2、表4)，绝对增重率为0.27-0.372，成活率为82.5-100％。经过对筛选家系的人工培育、生殖调控，培育和调控方法如具体实施方法1所述，2009年春季部分家系个体已经达到性成熟，通过异源冷冻精子诱导建立了雌核发育品系(表5)。
表4 2007年家系筛选结果
注1-背前，2-背后，3-腹后，Y-黄色，O-橙色，R-红色 7、利用异源冷冻精子诱导牙鲆雌核发育构建优良品系 通过对2007年筛选出的生长快、成活率高家系0719、0750、0751的人工培育、生殖调控，于2009年4月达到性成熟，利用挤压腹部法可采集到未受精卵。同时于2008年11月冷冻保存鲈鱼精子200ml，建立了其精子库，在受精时利用37℃水浴解冻精子，利用MPRS稀释液将精子以1∶10的比例稀释，在40000μJ/cm2强度紫外线下照射，使其遗传物质失活。采集以上成熟家系个体卵子，将失活的鲈鱼精子加入卵中，进行干法授精，受精时卵精比例为100∶0.4，授精3min后放入2-4℃海水中冷休克处理45min，然后放入17℃海水孵化和鱼苗培育。相继建立以上家系雌核发育系7个分别为0921、0927、0920、0938、0939、0946和0947(表5)。对雌核发育系生长进行了测量，目前雌核发育系体长为10.54-12.28cm，体重为13.19-20.62g。
表5牙鲆雌核发育优良品系系谱及生长情况
注RS-抗病牙鲆，JS-日本牙鲆，S.P-灭活的鲈鱼冷冻精子
权利要求
1.一种生长快成活率高牙鲆优良品系的选育方法，其特征在于它的方法，包括牙鲆育种群体的培育和生殖调控、精子冷冻技术辅助家系建立、家系的培育和标准化、数量性状的测定和分析、遗传参数估计、优良家系筛选、利用异源冷冻精子诱导牙鲆雌核发育构建优良品系；将事先构建的抗病牙鲆、日本牙鲆、黄海牙鲆利用电子微粒注射标记，集中培育达2-3龄，年培育温度控制在13-25℃，投喂人工配合饲料；每年2-5月繁殖季节水温控制在14-17℃，光照时间15h，光照强度1500-2000lux，连续照射1-2月，水流交换量为6-7m3/h，饲喂添加维生素E的野杂鱼培育，达到性成熟时，人工采集成熟牙鲆卵子和精子，镜检活力在70％以上的精子冷冻保存在液氮中，建立牙鲆精子冷冻库；人工繁殖时将冷冻精子在37℃水浴中解冻，镜检活力在70％以上者与卵子干法受精，其卵精比例为100ml∶1ml；在3个育种群体间或群体内以1雄多雌或1雌多雄的交配方式，建立全同胞或半同胞家系；210d前的家系培育在3m3水缸中，水流量调控在1-5m3/h之间，水温14-25℃；分别在鱼苗生长至15、50、90、150、210d左右对每个家系的养殖数量进行标准化，标准化鱼苗数量分别为10000、1000、500和200尾，210d分别利用红、黄、橙3种荧光颜料，在鱼苗腹部选择背前、背中、背后、腹后和腹中5个位置对家系选择个体进行标记，并集中养殖在1-2个30m3水池中；家系生长至90、210、510、720d几个时间段对其体长、体重和成活率进行测定，利用方差分析、多重比较、绝对增重和成活率比较分析家系生长情况；采用线性混合模型对测量性状遗传参数进行估计，体长和体重的狭义遗传率分别为0.20和0.26(P＜0.01)，广义遗传率分别为0.31和0.34(P＜0.01)；通过以上方法筛选出生长快、成活率高牙鲆家系4个分别为0703、0719、0750、0751号家系。将筛选家系培育成熟，可产出成熟卵子；将冷冻保存的鲈鱼精子在37℃水浴中解冻，用MPRS以1∶10的比例稀释鲈鱼精液，后在40000μJ/cm2紫外线下照射，使其遗传物质失活，加入牙鲆卵中进行干法授精，受精卵与精液体积比为100ml∶0.4ml，授精3min后浸入2～4℃海水中冷休克处理45min，诱导牙鲆卵雌核发育，然后将卵放入17℃海水孵化，建立生长快、成活率高牙鲆品系，共建立7个优良品系，分别为0920、0921、0927、0938、0939、0946、0947号品系。
全文摘要
一种生长快成活率高牙鲆优良品系的选育方法，其技术方法包括牙鲆育种群体的培育和生殖调控，精子冷冻技术辅助家系建立，家系的培育和标准化，数量性状的测定和分析，遗传参数估计，优良家系筛选和利用异源冷冻精子诱导牙鲆雌核发育构建优良品系。本发明可选择培育出生长速度快、成活率高牙鲆养殖新品系，筛选出生长快、成活率高的优良牙鲆家系共4个(0703、0719、0750和0751)，利用冷冻保存的鲈鱼精子，诱导建立了雌核发育的牙鲆优良品系7个(0920、0921、0927、0938、0939、0946和0947)。该技术方法可用于牙鲆养殖新品种培育，解决海水养殖鱼类牙鲆生长慢、成活率低的问题，可提高牙鲆养殖经济效益。
文档编号A01K61/00GK101699998SQ20091023001
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月3日 优先权日2009年11月3日
发明者田永胜, 陈松林, 邓寒, 徐田军, 王磊 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所