专利名称：三尖杉植株再生及快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于三尖杉的培养技术，更具体涉及一种三尖杉离体胚培养及植株再生方法。
技术背景三尖杉属三尖杉科三尖杉属常绿乔木，是古老的孑遗植物，为我国特有珍稀树种，共有 9种，我国有8种，其中福建省内有3种。其叶形似杉，但柔软不刺手，枝端冬芽呈三角排列 ，春天小枝分三叉生长，故名三尖杉。该树婆娑多姿，端庄秀丽，形态奇特，叶背有两条银 白色的气孔带，微风吹拂，银光耀眼，具有独特风姿。三尖杉木材坚实，纹理直，结构慎密 ，适合做高级家具和室内装饰。其种子出油率高，可应用于工业。此外，三尖杉的根、茎、 叶、皮、果中均含有多种生物碱，特别是其中的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱(简称双酯碱) 对白血病、黑素病、肺癌、乳腺癌、脑肿瘤等均有疗效，被列为全世界36种抗癌药物之中。 但由于三尖杉植物对环境条件要求较特殊，自然资源稀少，加之其为雌雄异株，结实量少， 分布区域比较狭窄，因此难以满足临床上日益增长的需求和规模化生产的需要。由于三尖杉 种子属于生理休眠性种子，休眠时间长达一年以上，致使育苗时间长、出苗率低，因此很难 获得理想的发芽率和更多的健壮苗。宁蒗县林业局及林科所等单位开展了播种育苗方法研究 ，对种子进行层积催芽，提高了种子的发芽率，但仍无法满足实际生产需要和规模化生产要 求。在生产中，特别是对其进行药用价值开发时，更不能提供大面积种植的优良纯化组培苗 ，因此急需完备的组织培养技术体系，但在专利公开以前没有一个有关其组织培养比较成功 的实例。发明内容本发明的目的是提供一种三尖杉植株再生及快速繁殖的组织培养方法，解决现有技术中 三尖杉种子休眠时间长、苗时间长、出苗率低，因此很难获得理想的发芽率和更多的健壮苗 的问题，该方法培养的芽健康、茁壮、增殖时间短、成苗移植后的成活率高，苗木成活后生 长健壮，长势良好，具有显著的经济效益。本发明的技术内容为三尖杉植株再生及快速繁殖方法的具体步骤包括1) 取材方法选取当年萌发饱满新芽的茎段，在距离芽点1 2厘米处剪取，去除多余 的叶片，采摘后用湿布包好；2) 培养基的配制在基本培养基为MS中分别添加生长激素IBA、 NAA、 IAA、 ZE (玉米素)或KT中的几种，分别配置成芽诱导培养基、芽增殖培养基和生根培养基，所述这些培养 基中还加入Su为30 g/L， Ag+为7. 5 g/L， PH值为5. 8，附加物为活性炭Ac;所述这些培养基 的厚度为1.4 1.6cm;3)材料消毒处理先对材料进行适当的修剪，用洗涤剂漂洗干净，再将材料用自来水 冲洗30分钟，把水沥干后置于超级工作台内，以重量浓度为75%的酒精消毒，摇荡，3 5秒 钟后倒去酒精，加入O. P/。升汞HgCl2处理8 13分钟，将汞液倒入废汞瓶，用无菌水冲3 4遍 后，用消毒滤纸吸干表面水分，然后进行接种；4)诱导培养取生长饱满的新芽切成0.8 1.5cm的小段，分别接种于经高温、高 压灭菌的所述芽诱导培养基中；100 150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养 条件培养室温度为25士2。C，光照时间12h/d，光照强度1000 1500Lx;诱导培养的时间 15 20天；5) 增殖培养将所述经过步骤4)的诱导培养生长良好的丛生芽切开，分别接种在增殖 培养基中；100 150g的增殖培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件培养室温度为 25士2。C，光照时间12h/d，光照强度1000 1500Lx;增殖培养的时间25 30天；6) 诱导生根将步骤5)增殖培养出来的幼苗单株切下，带有2 3片叶子，株高1 2cm，转移到所述生根培养基中；100 150g的生根培养基接种3个胚；所述生根培养的培养 条件培养室温度为25士2。C，光照时间12h/d，光照强度1000 1500Lx;生根培养的时间 2C) 25天；7) 试管苗完成当试管苗长至3cm， 3 5条根，5片叶子，长度2 3cm时，完成三尖杉 植株再生及快速繁殖试管苗培养。8) 试管苗移栽步骤7)的完成的三尖杉试管苗进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗 3 5天后再打开瓶盖先进行炼苗3天，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后将苗从培 养瓶中取出，洗去根部培养基，移入蛭石和腐殖土 (质量比)1 :2混合的基质中，保湿遮阴 ，成活率可达95%以上。本发明的显著优点是采用本发明方法进行，茎段经过诱导培养，15 20天即可萌发出 生长健壮的新芽；再经过25 30天的增殖，20 25天诱导生根后即可成苗、移栽，成活率高 达95%以上；扩繁系数在18倍以上，苗木成活后生长健壮，长势良好，基本上解决了中三尖 杉种子休眠时间长、苗时间长、出苗率低，因此很难获得理想的发芽率和更多的健壮苗的问 题，具有显著的经济效益。
图l茎段诱导形成的芽图2诱导芽增殖形成的丛芽具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。 实施例取材方法选取当年萌发饱满新芽的茎段，在距离芽点1 2厘米处剪取，去除多余的叶 片，采摘后用湿布包好。 培养基MS基本基本培养基采用1986，北京高等教育出版社出版，陈正华主编的《木本植物组织 培养及其应用》中的配方进行配制的。培养基的配制基本培养基为MS，加入生长激素为IBA、 NAA、 IAA、 ZE (玉米素)、 KT(植物激素)，培养基中加入Su (蔗糖)为30g/L， Ag+为7.5g/L， PH值为5. 8，附加物为活 性炭Ac;培养基厚度一般为1.4 1.6cm;芽诱导培养基一MS+ZE (3.0 mg/L)+KT (1.0 mg/L)+IAA (1.0 mg/L)+NAA (0.3 mg/L)+Ag屮(7.5 g/L) +Su (30 g/L)+Ac (2 2. 5 g/L)芽增殖培养基一MS+ZE (2. 0 mg/L) +KT (2. 0 mg/L) +NAA (0. 5 mg/L) + Ag+ (7. 5 g/L) +Su (30 g/L) +Ac (2 2.5 g/L)生根培养基一1/2 MS + NAA (0. 3 mg/L) + IBA (0. 5 mg/L) + Ag+ (7. 5 g/L) +Su (30 g/L) +Ac (2 2.5 g/L)这些培养基中Ag+的来源于AgN03。基本培养基1/2 MS是指MS中大量元素减半，其余不变。材料消毒处理先对材料进行适当的修剪，用洗涤剂漂洗干净，再将材料用自来水冲洗 30分钟，把水沥干后置于超级工作台内，以重量浓度为75%的酒精消毒，摇荡，3 5秒钟后 倒去酒精，加入O. P/。升汞(HgCl2，该O. 1%升汞配制为1克升汞加1000毫升蒸馏水)处理8 13 分钟，将汞液倒入废汞瓶，用无菌水冲3 4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分，然后进行接种诱导培养取生长饱满的新芽切成0.8 1.5cm的小段，分别接种于经高温、高压灭菌的 所述芽诱导培养基中；100 150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件 培养室温度为25士2。C，光照时间12h/d，光照强度1000 1500Lx;诱导培养的时间15 20天增殖培养将所述经过步骤4)的诱导培养生长良好的丛生芽切开，分别接种在增殖培 养基中；100 150g的增殖培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件培养室温度为25士2。C，光照时间12h/d，光照强度1000 1500Lx;增殖培养的时间25 30天；诱导生根将步骤5)增殖培养出来的幼苗单株切下，带有2 3片叶子，株高l 2cm， 转移到所述生根培养基中；100 150g的生根培养基接种3个胚；所述生根培养的培养条件 培养室温度为25士2。C，光照时间12h/d，光照强度1000 1500Lx;生根培养的时间20 25天试管苗完成当试管苗长至3cm， 3 5条根，5片叶子，长度2 3cm时，完成三尖杉植 株再生及快速繁殖试管苗培养。试管苗移栽步骤7)的完成的三尖杉试管苗进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗3 5天后再打开瓶盖先进行炼苗3天，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后将苗从培养瓶 中取出，洗去根部培养基，移入蛭石和腐殖土 (质量比)1 :2混合的基质中，保湿遮阴，成 活率可达95%以上。采用以上方法进行，茎段经过诱导培养，15 20天即可萌发出生长健壮的新芽；再经过 25 30天的增殖，20 25天诱导生根后即可成苗、移栽，成活率高达95%以上；扩繁系数在 18倍以上，苗木成活后生长健壮，长势良好。
权利要求
1.一种三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在于所述方法的具体步骤包括1)取材方法选取当年萌发饱满新芽的茎段，在距离芽点1～2厘米处剪取，去除多余的叶片，采摘后用湿布包好。2)培养基的配制在基本培养基为MS中分别添加生长激素IBA、NAA、IAA、玉米素ZE或KT中的几种，分别配置成芽诱导培养基、芽增殖培养基和生根培养基，所述这些培养基中还加入Su为30g/L，Ag+为7.5g/L，PH值为5.8，附加物为活性炭Ac；所述这些培养基的厚度为1.4～1.6cm。3)材料消毒处理先对材料进行适当的修剪，用洗涤剂漂洗干净，再将材料用自来水冲洗30分钟，把水沥干后置于超级工作台内，以重量浓度为75％的酒精消毒，摇荡，3～5秒钟后倒去酒精，加入0.1％升汞HgCl2处理8～13分钟，将汞液倒入废汞瓶，用无菌水冲3～4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分，然后进行接种；4)诱导培养取生长饱满的新芽切成0.8～1.5cm的小段，分别接种于经高温、高压灭菌的所述芽诱导培养基中；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1000～1500Lx；诱导培养的时间15～20天；5)增殖培养将所述经过步骤4)的诱导培养生长良好的丛生芽切开，分别接种在增殖培养基中；100～150g的增殖培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1000～1500Lx；增殖培养的时间25～30天；6)诱导生根将步骤5)增殖培养出来的幼苗单株切下，带有2～3片叶子，株高1～2cm，转移到所述生根培养基中；100～150g的生根培养基接种3个胚；所述生根培养的培养条件培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1000～1500Lx；生根培养的时间20～25天；7)试管苗完成当试管苗长至3cm，3～5条根， 5片叶子，长度2～3cm时，完成三尖杉植株再生及快速繁殖试管苗培养。
2.根据权利要求l所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在 于所述步骤7)的完成的三尖杉试管苗进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗3 5天后再 打开瓶盖先进行炼苗3天，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后将苗从培养瓶中取出 ，洗去根部培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比=1 : 2混合的基质中，保湿遮阴，成活率可 达95%以上。
3.根据权利要求l所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在于所述芽诱导培养基为基本培养基MS中再加入ZE 3.0 mg/L; KT 1.0 mg/L; IAA 1.0 mg/L; NAA 0.3 mg/L ; Ag+ 7.5 g/L;Su 30 g/L;Ac 2 2. 5 g/L;所述芽增殖培养基为基本培养基MS再加入ZE 2.0mg/L;KT 2. 0 mg/L; NAA 0. 5 mg/L;Ag+7. 5 g/L; Su 30 g/L; Ac 2 2. 5 g/L;所述生根培养基为基本培养基1/2 MS再加入NAAO. 3mg/L;IBA 0. 5 mg/L; Ag+ 7. 5 g/L; Su 30 g/L; Ac 2 2. 5 g/L。
4.根据权利要求3所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在于所述培养基中3的来源为 3 。
5.根据权利要求3所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在 于所述基本培养基1/2 MS是指MS中大量元素减半，其余不变。
6.根据权利要求l所述的三尖杉植株再生及快速繁殖方法，其特征在 于所述步骤3)用的O. 1%升汞配制为1克升汞加1000毫升蒸馏水。
全文摘要
本发明提供一种三尖杉离体胚培养及植株再生方法，属于三尖杉的培养技术。解决现有技术中三尖杉种子休眠时间长、苗时间长、出苗率低，因此很难获得理想的发芽率和更多的健壮苗的问题，本发明选取当年萌发饱满新芽的茎段为材料，经过诱导培养，15～20天即可萌发出生长健壮的新芽；再经过25～30天的增殖，20～25天诱导生根后即可成苗、移栽，成活率高达95％以上；扩繁系数较高，苗木成活后生长健壮，长势良好。
文档编号A01H4/00GK101617632SQ20091030460
公开日2010年1月6日 申请日期2009年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者何官榕, 何碧珠 申请人:福建农林大学