专利名称：植物材料、植物以及产生具有改变的木质素特性之植物的方法
技术领域：
本发明涉及一组基因，当在植物中对其进行修饰时产生改变的木质素特性。更特别地，本发明涉及对植物和转基因植物以及通过特定杂交方法获得的植物进行表型改变的方法，所述植物具有改变的基因表达，导致木质素表达的改变。本发明还提供可用于本发明方法的DNA构建体(如载体)。而且，本发明涉及由本发明植物产生的木材以及植物的植物细胞或植物后代。更低的木质素水平会导致对用于生物精炼(bio-refining)和乙醇生产的糖化的改进，以及改进的浆和纸。提高的木质素水平会利用木质素的特性用于能量产生。所述基因和DNA构建体可用于鉴定与野生型相比具有改变的木质素特征的植物。本发明的基因和DNA构建体还可用作标记物辅助育种中的候选基因。
背景技术：
来自森林树木的木材提供工业用的生物聚合物，即纤维素、半纤维素以及木质素。 木材产生的主要产品包括浆和纸、能量以及建筑材料。然而，现在我们发现有这样的变化趋势，即在工业中正在寻找新的生产可能以及将木材原材料转化成更有价值产品的改进的生物精炼。这些由用可再生资源替代化石材料的使用的目标驱动。木材是非常重要的资源， 因此为工业提供大量的、具有为多种用途而设计之特性的木材是很重要的。木质素是主要的木材生物聚合物，其对大多数基于木材的材料的工业加工来说极为重要。生物化学和遗传学研究工具详细地描述了木质素的生物合成(Baucher，Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology，38 :305-350,2003)。生物合成途径中的所有主要酶已被鉴定，并且反向遗传学帮助确定了所述途径的主要路径。木质素是极为复杂的生物聚合物。其含有对羟基肉桂醇单体及相关化合物。其在化学过程中通过氧化及偶联进行聚合，并且木质素在木材细胞壁中包裹纤维素和半纤维素基质。其以复杂且迄今未能很好描述的方式以所谓的“木质素碳复合物”与半纤维素网络连接。最近还表明木质素结构是极为可塑及可变的。木质素的含量及组成在器官和细胞类型之间均存在天然差异，并且可通过遗传工程模拟并扩展该差异(Vanholme等，Current Opinion in Plant Biology 2008,11:1-8)。并不意外的是，在具有改变的木质素的转基因树木中，成浆特性 (如产量禾口卡伯值)被改变(Bauhcer,C:ritical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 38 :305-350, 200 。更新的研究也证明，当木质素被改变时，木材生物精炼(如乙醇生产)中所需的糖化也被改变(Chen和Dixon. Nature Biotechnology Vol.25 no 7 759-761页，2007)。该文章表明，更低的木质素水平导致改善的糖化。糖化是多糖水解成糖单体(如葡萄糖)的过程。该处理对木质纤维素原材料来说昂贵并且复杂(Breaking the Biological Barriers to Cellulosic Ethanol :A Joint Research Agenda. A Research Roadmap Resulting from the Biomass to Biofuels Workshop, December 7—9，2005， Rockville，Maryland)。
为了获得糖化用的纤维素和半纤维素，必须使细胞壁结构松散，从而使其能被酶降解或水解。而且，该预处理可提高纤维素的表面积，从而增强其与酶的反应性以及向单糖的转化。尽管对木质素生物合成途径的研究已相当详尽，近期发现指出了这样的事实，即可以通过尚未研究和了解的方式，通过改变涉及其他代谢途径和细胞壁生物聚合物途径的基因来改变木质素含量。这是改变树木的木材特性和木质素化学性质的一种未探索的可能性。改造木材中的木质素含量的商业价值是很明显的，但更多或更少木质素的采用取决于木材的用途以及所用的工业工艺。对于通过燃烧或其他氧化技术进行的能量产生，高木质素含量是有价值的，因为与其他木材生物聚合物相比木质素具有高能量值。同时，在化学成浆、饲料消化性和植物生物质向生物燃料的加工中，木质素是一个重要障碍。这是由于木质素与碳基质共价连接，并且需要能量来分离或降解木质素。例如在浆和纸的加工中，木质素成为在残留液体中的残留产物，并且从纤维素中分离木质素是消耗能量的过程。因此将低木质素含量视为有价值的特性。在木质素生物合成途径中所涉及基因的一个实例是参与木质素单体 (monolignol)合成的基因。Forster和其同事在美国专利7402428中描述到，它们可通过木质素单体生物合成途径中的基因的RNAi敲除而在植物中降低或调节木质素含量。这是参与木质素合成途径的许多基因中的一个基因，由于不同的生长和环境条件，对该基因构建体在大田生长条件下的如何发挥功能以及对不同应用而言哪些基因最佳仍知之甚少。因此，仍需要可用于在植物中调节木质素含量的另外基因。但是正在进行的试图建立木材生物精炼(其中所有木材组分均被加工)的研究可能改变这种观点。已经开发了木质素作为分散剂、乳化剂、结合剂或稳定剂的用途。如果新的基于木质素的产品变得更具吸引力，则可以不同的角度看待木材的木质素含量。因此能够根据目的应用以期望的方式改变(例如上调或下调)木材中的木质素含量是有价值的。仍存在的问题是如何鉴定参与木质素调节以及木质素相关基因表达的可能最重要的基因，以利用木质素特性用于能量产生，或在造纸中去除不想要的木质素特性。在本发明中，我们检测了在活体树木中影响木质素水平的大量基因。发明简述本发明涉及SEQ ID NO :23至115的基因和DNA构建体，其可用于改变植物中的木质素水平。这通过改变这些基因的表达水平来进行。本发明涉及对植物和转基因植物以及通过特定杂交方法获得的植物进行表型改变的方法，所述植物具有改变的基因表达，导致木质素表达的改变。本发明还提供可用于本发明方法中的DNA构建体。而且，本发明涉及由本发明植物产生的植物细胞、子代植物或任何植物材料以及木材，及其在木质素含量的提高或降低是优点的情况下的应用。本发明人还发现，某些基因的下调和/或过表达在所产生的转基因树中提供了改变的木材化学性质。特别是已发现可使用某些基因来改变木质素水平。已经在这样的项目中鉴定了这些基因，在所述项目中将基因转移到树木中，并采用RNAi进行下调和通过高水平表达启动子进行过表达。这些基因在两步分析后被鉴定为影响木质素水平，首先用FT-IR分析来分析木材(通用参考 Griffiths, P. R.禾口 De Haseth, J.A.Fourier Transform Infrared Spectrometry. New York =Wiley, 1986以及下文)，而后用Klason-木质素分析来分析木材 (见下文)。所述基因(SEQ ID No :23至115，157-195)改变了木材化学特性，尤其是改变了木质素水平。所述基因(SEQ ID No 23至115，157-195)可在进一步用作能量作物的植物中表达，例如如果提高木质素含量，则将产生高能作物。而且，当在植物中表达时这些基因(SEQ ID No :23至115，157-195)可用于提高和改进糖化潜力(saccharification potential)，并因而提高从木质纤维素生产燃料或化学品的经济性。发明详述定义在更详细地讨论本发明之前，首先定义以下术语和习惯用语“糖化”的定义是将复杂的碳水化合物(如淀粉、纤维素或半纤维素)转化为糖(如可发酵糖)的过程。其基本是水解过程。例如所述过程可通过采用酶或酸或其它化学品来实现。术语“转基因植物”是指这样的植物，其包含在相同物种、变种或栽培种的野生型植物中不存在的遗传物质。“过表达”是指与对照植物相比mRNA或多肽的表达提高，其中所述mRNA或多肽或蛋白质在正常情况下不存在于宿主细胞中，或者其中所述mRNA或多肽或蛋白质以高于其正常表达的水平存在于所述宿主细胞中。本发明蛋白质的过表达可通过下述方式实现，首先构建嵌合基因，其中编码区与能够指导基因在所需发育阶段在所需组织中表达的启动子有效连接。嵌合基因可包含来源于相同基因的启动子序列和翻译前导序列。还可提供编码转录终止信号的3'非编码序列。 本发明的嵌合基因还可包含一个或多个内含子以利于基因表达。合适的启动子可以是CaMV 35S启动子，其可与作为载体的农杆菌(Agrobacterium) —起使用。术语“RNA干扰”或“RNAi ”可表示双链RNA分子或短发夹RNA改变与其具有显著同源性或完全同源性的核酸序列之表达的方法。术语“RNAi下调”表示可由一种或多种RNAi种类介导的核酸序列表达减少。术语 "RNAi种类”表示引发RNAi的独特RNA序列。术语“RNAi构建组”是指来自于一种RNAi构建体的不同转基因树木。术语“光周期”是指每天的光照和黑暗周期。在与例如细胞、核苷酸、载体、蛋白质或多肽一起使用时，术语“重组”通常表示所述细胞、核苷酸或载体已通过引入异源(或外源)核酸或者改变天然核酸而被修饰，或者表示所述蛋白质或多肽已通过引入异源氨基酸而被修饰，或者所述细胞来源于经这样修饰的细胞。重组细胞表达在天然(非重组)形式细胞中不存在的核酸序列(例如基因)，或者表达异常表达、低表达或者根本不表达的天然核酸序列(例如基因)。术语“重组”在修饰细胞时表示该细胞复制异源核酸，或者表达异源核酸所编码的肽或蛋白质。重组细胞可含有天然(非重组)形式细胞中不存在的基因。重组细胞还可含有天然形式细胞中存在的基因，其中所述基因通过人工手段进行了修饰并重新引入细胞中。该术语还涵盖下列细胞，其含有经修饰的细胞内源核酸，而不从该细胞中去除所述核酸；这些修饰包括通过基因替换、 定点突变和相关技术获得的修饰。在本发明上下文中，“互补”表示两个核苷酸序列彼此精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸某一位置的核苷酸能够与DNA或RNA分子对应位置的核苷酸形成氢键，则该寡核苷酸和DNA或RNA被认为在该位置彼此互补。在寡核苷酸中足够个数的核苷酸可与靶DNA 或RNA中对应核苷酸形成氢键使得形成稳定复合物时，认为DNA或RNA链彼此互补。因此，在本文上下文中，表述“互补序列”或“互补”还表示将在严格条件下与本发明的核酸分子退火的核苷酸序列。术语“严格条件”指高严格、弱严格或低严格的一般条件。术语“严格度”是本领域中公知的，用于表示进行核酸杂交的条件(温度、离子强度以及其他化合物例如有机溶剂的存在情况)。杂交是指一个核酸与另一个核酸的匹配，例如单链核酸分子彼此之间碱基配对形成双链体。“子序列”或“片段”是完整序列的任何部分。因此，片段或子序列指分别包含更长氨基酸序列(例如多肽)或核酸序列(例如多核苷酸)的一部分的氨基酸或核酸序列。在本文上下文中，术语“同源性”表示两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相似性，其由参数“序列同一性”描述。术语“序列同一性”表示相同长度的两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间同源性程度的定量度量。如果比较不同长度的两个序列，则必须将它们进行比对以给出可能的最佳匹配，允许插入缺口或者在多肽序列或核苷酸序列末端截短。序列同一性可以通过
进行计算，其中Ndif是比对时两个序列中不一致残基的总数，其中N-是序列之一
./V ref
的残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75 %的序列同一性( = 2， Nref = 8)。将缺口作为不一致的特定残基计算，即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC具有 75% 的序列同一性(Ndif = 2，Nref = 8)。对于本发明有关核苷酸序列的全部实施方案，一个或多个序列之间的序列同一性百分比也可基于使用 clustalW 软件(http/www. ebi. ac. uk/clustalff/index. html) 以默认设置进行比对。对于核苷酸序列的比对，这些设置为比对=3Dfull，缺口开放 10. 00，缺口延伸0. 20，缺口间隙距离4，DNA权重矩阵同一性(IUB)。或者，可使用程序DNASIS Max分析序列，可在http://www. paralign. org/序列进行比较。该服务是基于称为Smith-ffaterman (Sff)和ParAl ign的两种比较算法。第一种算法由Smith和 Waterman (1981)公开，是寻找两个序列的最佳局部比对的成熟方法。另一种算法ParAlign 是用于序列比对的探索性方法；所述方法的细节由Rognes O001)公开。使用得分矩阵和缺口罚分以及E值的默认设置。在涉及两个核酸或多肽时，短语“基本相同”或“显著同一性”可指使用序列比较算法或目测检查测量，在以最高对应性进行比较和比对时，分别具有至少约60%、65%、 70%、75%，优选 80%或 85%，更优选 90 % ,91 % ,92 % ,93 % ,94 % ,94. 5 % ,95 % ,95. 5 %, 96%,96. 5%,97%,97. 5%,98%,98. 5%,99%,99. 5%或更高的核苷酸或氨基酸残基百分比同一性的两个或更多个序列或子序列。因此，百分比同一性可为99. 6%,99. 7%,99. 8%, 99.9%。在本发明中显著同一性可表示一个基因、分离的两个或一组基因而不表示其它基因，例如一个基因可能与目的基因有75%的同源性，另一个与目的基因可能有60%的同源性，而又一个与目的基因可能有93%的同源性。在某些方面中，显著同一性存在于至少约 50 个残基长(例如至少约 100、110、120、125、130、135、140、145、150、155、160 或 165 个氨基酸残基)的氨基酸序列区域上。在某些方面中，显著同一性存在于至少约150个核酸残基 (例如至少约 200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800 个(例如至少约900个)核苷酸或者例如至少约11Λ、21Λ或者例如至少约31Λ)的核酸序列区域上。在一些方面中，氨基酸或核酸序列在多肽序列或相应编码区的全长上是基本相同的。 关于“基本相同”或“显著同一性”的所有定义在必要变通后适用于本文提及的所有SEQ ID 编号以及其中涉及这些SEQ ID编号的本发明的所有方面。“保守性替换”的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸 (谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)各组内进行的。通常不改变特定活性的氨基酸替换是本领域中已知的，其在如Neurath和Hill, 1979中描述。最常见的替换有Ala/Ser、Val/Ile、Asp/ Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg, Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly 以及其反向替换。本文使用的术语“保守性替换变体”指包含一个或多个保守性替换的核苷酸序列变体。—般来说，在本文中，术语“沉默替换”指不影响密码子意义并且因此对多肽结构没有影响的碱基替换。本领域技术人员了解，由于遗传密码的简并性，沉默替换是可能的。术语“保守结构域”可指在多个物种中相似的多肽之氨基酸序列或DNA或RNA之核苷酸序列。已知的保守序列组由共有序列代表。氨基酸基序经常由保守序列构成。另外， 术语“保守序列”指在进化中基本上保持不变的核酸序列分子之碱基序列或者蛋白质之氨基酸序列。“共有序列”可定义为理想序列，表示核酸序列中每个位置上最常出现的碱基，或者蛋白质中每个位置上最常出现的氨基酸。通过比对所有已知核酸序列或蛋白质实例以使其序列同一性最高来鉴定“共有序列”。对于视作共有序列的序列，每个特定碱基或氨基酸必须在其位置上合理地占优势，并且多数序列必须与该共有序列相关，仅存在少数替换，例如1个或2个。同源物也可是蛋白质“插入变体”的形式，S卩，向蛋白质预定位点引入一个或多个氨基酸残基。插入可包括一个或多个氨基酸的N端和/或C端融合以及序列内插入。蛋白质“缺失变体”形式的同源物的特征是从蛋白质中去除一个或多个氨基酸。蛋白质“添加变体”形式的同源物的特征是向蛋白质中添加一个或多个氨基酸，其中所述添加可以在序列的末端。替换是蛋白质的另一种变体，其中一个或多个氨基酸被替换成另一种(其它)氨基酸。术语“直系同源物”和“旁系同源物”序列也是上述同源序列的类型。本领域技术人员已知几种不同的鉴定和定义这些功能性同源序列的方法。描述了定义直系同源物和旁系同源物的三种一般方法；可通过下述一种或多种方法鉴定直系同源物、旁系同源物或同源物。直系同源物和旁系同源物是具有相似序列和相似功能的进化相关基因。直系同源物是不同物种中的结构相关基因，其来自于物种形成事件。旁系同源物是单个物种内的结构相关基因，其来自于复制事件。在单个植物物种内，基因复制可产生特定基因的两个拷贝，产生具有相似序列并经常具有相似功能的两个或更多个基因，称为旁系同源物。因此，旁系同源物是由同一物种内的复制而形成的相似基因。在使用程序例如CLUSTAL分析基因家族系统发生时，旁系同源物通常聚集成簇或者在相同进化枝中(一组相似基因)(Thompson等；Higgins等)。相似基因的组也可通过成对BLAST分析来鉴定O^eng和Doolittle)。例如，来自拟南芥的非常相似的MADS结构域转录因子的进化枝都在开花时间方面具有共同的功能(Ratcliffe等)， 拟南芥中一组非常相似的AP2结构域转录因子参与植物对冰冻的耐受(Gilmour等)。对属于一个进化枝的具有相似功能的相似基因的组进行分析可得到该进化枝特有的子序列。 这些子序列(称为共有序列)不仅可用于定义每个进化枝内的序列，还可定义这些基因的功能；进化枝内的基因可含有具有相同功能的旁系同源物序列或者直系同源物序列(另外参见，例如 Mount (2001)，Bioinformatics :Sequence and Genome Analysis Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y.，543 页)。物种形成(从亲本物种产生新的物种)也可以产生具有相似序列和相似功能的两种或更多种基因。这些基因(称为直系同源物)在其宿主植物内经常具有相同的功能，并且在物种之间经常可互换而不丧失功能。因为植物具有共同的祖先，所以任何植物物种中的许多基因都会在另一个植物物种中具有对应的直系同源基因。一旦使用程序例如CLUSTAL 构建了一个物种中基因家族的系统发生树，则可将可能的直系同源序列置于系统发生树内，并可确定它们与目的物种基因的关系。直系同源序列还可通过双向BLAST策略鉴定。一旦鉴定了直系同源序列，则可从参考序列的已鉴定功能推出直系同源物的功能。来自不同生物的直系同源基因可具有高度保守的功能，经常是基本上相同的功能 (Lee等和Remm等)。通过基因复制而分出的旁系同源基因可保持所编码蛋白质的相似功能。在此情况下，旁系同源物可互换地用于本发明的某些实施方案(例如，编码序列的转基因表达)。这种高度相关旁系同源物的实例有CBF家族，在拟南芥中其具有三个明确定义的成员，在欧洲油菜(Brassica napus)中具有至少一个直系同源物，它们均控制涉及冰冻和干旱胁迫的途径(Gilmour等和Jaglo等)。杂交白杨是两个物种美洲山杨(Populus tremuloides)和欧洲山杨(Populus tremula)的杂交种。下列参考文献代表许多研究的一小部分，其证明了来自不同物种的直系同源转录因子基因可能具有相似的功能(即，调控相似的靶序列并控制相同的性状)，可将转录因子转化进不同物种中以赋予或改善性状。(1)拟南芥NPRl基因调节系统性获得抗性(systemic acquired resistance, SAR) ；NPRl的过表达导致拟南芥抗性增强。拟南芥NPRl或水稻NPRl直系同源物在水稻(其为单子叶植物，与拟南芥不同)中过表达时，用水稻白叶枯病病原体水稻黄单胞菌 (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)攻击该转基因植物显示增强的抗性(Chern等)。NPRl通过活化转录因子基因(例如TGA2)的表达起作用(Fan和Dong)。 (2)E2F 基因参与增殖性细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)植物基因的转录。植物E2F在单子叶植物和双子叶植物之间具有高度的氨基酸序列相似性，甚至与动物E2F的保守结构域相似。这种保守性提示了植物和动物E2F之间的功能相似性。调节分生组织发育的E2F转录因子通过共同的顺式元件起作用，并调节相关的 (PCNA)基因(Kosugi 和 Ohashi)。 术语“密切相关的”基因用于表示直系同源或旁系同源的基因。本文使用的术语“启动子”指位于基因转录起点上游的序列决定子区，其参与RNA 聚合酶以及其它引发和调节转录的蛋白质的识别和结合。植物中可用的启动子不一定是植物来源的。“基本启动子”是组装转录起始所需转录复合物时所必需的最小序列。基本启动子往往包含TATA盒元件，其通常位于转录起始位点上游15至35个核苷酸之间。基本启动子有时还包含CCAAT盒元件(通常为序列CCAAT)和/或GGGCG序列，通常位于转录起点上游的40至200核苷酸之间，优选60至120核苷酸之间。本文中称为“组成型启动子”的启动子可在大多数(但不一定全部)环境条件以及发育或细胞分化状态下活跃启动转录。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35S转录起始区和来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) T-DNA的1 ‘或 2'启动子，以及本领域技术人员已知的来自多种植物基因的其它转录起始区，例如玉米泛素-1启动子。器官特异性启动子可以是例如来自贮存组织例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子，或者来自代谢库组织例如分生组织的启动子。此外，所述启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子。本发明上下文中的“诱导型启动子”指受一定条件调控的启动子，例如生物、细胞或细胞器中的光、化学品浓度、蛋白质浓度、状态等。诱导型启动子的实例有HSP启动子和 PARSK1，PARSK1来自编码丝氨酸-苏氨酸激酶的拟南芥基因的启动子，其由脱水、脱落酸和氯化钠诱导。基本上，诱导型启动子控制下的表达应答于所施加的刺激而“开启”或提高。 刺激的性质依启动子而不同，可包括上述环境因素。不论在没有刺激时的表达水平如何，在正确刺激存在下任何诱导型启动子的表达都增加。本文使用的术语“组织特异性”指特定组织的特征，其一般不在所有组织中存在， 或可仅在目的组织中存在。在本申请中，“组织特异性”用于表示基因调节元件(启动子或启动子加增强子和/或沉默子)、其编码的基因或者这些基因的多肽产物。在基因调节元件或“组织特异性启动子”的上下文中，该术语表示在特定谱系、组织或细胞类型的细胞中指导所连接序列转录、但是在非该谱系、组织或细胞类型的细胞或组织中基本上没有活性的启动子(以及其它调节元件例如增强子和/或沉默子元件)。可用于本发明的组织特异性启动子在特定组织中在转录生产方面的活性与其它组织的细胞或者相同谱系的转化或恶性细胞相比至少为5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或甚至1000倍。在基因或基因之多肽产物的上下文中，术语组织特异性表示该基因的多肽产物在特定组织或细胞类型的细胞中是可检出的，但是在某些其它细胞类型中基本不可检出。特别相关的组织特异性启动子包括在植物的木质部形成组织中特异性表达或有活性的启动子序列。这些启动子的实例有 Lmpl、Lmx2、Lmx3、Lmx4 和 Lmx5 启动子，其描述于 W02004097024。“终止子序列”表示标志着基因组DNA中基因或操纵子转录终点的基因序列部分。终止子序列被在多腺苷化信号处共转录地切割初生RNA的蛋白质因子识别，停止RNA聚合酶对转录本的进一步延长。在与另一个核酸序列处于功能性关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果其提高了编码序列的转录，那么启动子或增强子与编码序列有效连接。有效连接表示连接的DNA序列通常是邻接的，并且在需要时，连接两个蛋白质编码区使其邻接并且在同一读码框中。但是，因为增强子一般在与启动子相隔数千碱基时发挥功能，其间的序列可以有不同的长度，因此一些多核苷酸元件可以是有效连接但不邻接的。在本发明的上下文中，术语“转化”和“转化的”可互换地使用，分别作为“转染”和 “转染的”同义词，以表示将DNA引入细胞的过程。DNA构建体(至少包括目的基因或启动子的一部分)可引入至宿主细胞中，如前所述，其可以是个体细胞、培养物中的细胞、作为宿主生物一部分的细胞、受精的卵母细胞配子体或者胚胎细胞。涉及宿主细胞时，术语“引入”意为表示本领域已知用于将重组载体DNA引入靶宿主细胞的标准方法。这些方法包括但不限于转染、感染、转化、自然摄入、电穿孔、生物射弹和农杆菌介导。“可再生细胞”表示可再生为完整植物的植物细胞。应理解，可再生细胞是保持其遗传潜力的细胞，在本领域也称为“全能性”。还应理解，可再生细胞在培养物中培养时，可能需要适当的刺激来表现亲本植物的全部遗传潜力。采用分析平台分析的大量基因显示了令人感兴趣并通常未预料到的商业特性。有目的地改变(提高或降低的表达)一个基因(SEQ ID NO 23至115)的水平的本发明一个方面提供了产生具有改变的木质素水平的植物的方法。具有改变的木质素特性的植物的产生方法在本发明的一些具体实施方案中，通过相对于相应野生型植物来修饰候选基因的表达水平而产生有利的植物表型，所述候选基因已经根据以上标准进行评价和选择，其改变木质素的量、含量和/或品质。根据这些方面，提供了一种方法，其包括改变植物中至少一种基因的基因产物水平，所述基因包含选自以下的核苷酸序列a) SEQ ID NO :23_115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQ ID NO :24_115、157_195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或与SEQ ID NO 23的核苷酸序列有至少99. 6%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。更高的木质素含量可通过过表达a)、b)或c)组中SEQ ID NO 113、114、115、178 和 179 中至少一个基因和 /或下调 SEQ ID NO :24、25、26、30、32、46、47、53、54、58、157、159、 160和162中至少一个基因来获得。因此，可以过表达SEQ ID NO :113、114、115、178和179中的至少1个、至少2个、 至少3个、至少4个或全部。而且，可以下调SEQ ID NO :24、25、26、30、32、46、47、53、54、58、 157、159、160和162中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或全部。更低的木质素含量可通过过表达a)、b)或c)组中SEQ ID NO 176、177和180、 181、182、183、184、185、186 以及 187 的至少一个基因和 / 或下调 SEQ ID NO :23、27、沘、29、 31、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、48、49、50、51、52、55、56、57、158、161 和 163
中至少一个基因来获得。
因此，可以过表达SEQ ID NO :176、177和 180、181、182、183、184、185、186 以及 187 中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或全部。而且，可以下调SEQ ID NO :23、27、28、29、31、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、48、49、50、51、52、55、56、57、158、161 和 163 中的至少 1 个、至少 2 个、至少 3 个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 个或全部。关于上述SEQ ID号的涉及更高和更低木质素含量的所有这些定义也与以上对同义语“基本相同”或“显著同一性”所做的定义相组合。可通过下列技术经过改良的杂交方法来获得植物表型，所述方法包括i)选择表达选自以下的至少一种核苷酸序列的植物物种a) SEQ ID NO :23_115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQ ID NO :24_115、157_195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或与SEQ ID NO 23的核苷酸序列有至少99. 6%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。ii)将i)中选择的植物物种与i)中选择的相同或另一植物物种杂交，iii)选择与i)中选择的植物物种相比，选自下列的至少一种核苷酸序列的表达受到调节的植物a) SEQ ID NO :23_115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQ ID NO :24-115、157-195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或与SEQ ID NO 23的核苷酸序列有至少99. 6%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。iv)任选地，将iii)中得到的植物回交一次或多次，并选择与任何i)中所用植物物种和/或iii)中所得植物相比，选自下列的至少一种核苷酸序列的表达受到调节的植物a) SEQ ID NO :23_115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQ ID NO :24_115、157_195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或与SEQ ID NO 23的核苷酸序列有至少99. 6%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。根据本发明的一个方面，提供包括以下步骤的方法
(i)提供包含选自下列的核苷酸序列的表达载体a) SEQ ID NO :23_115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQ ID NO :24_115、157_195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或与SEQ ID NO 23的核苷酸序列有至少99. 6%同一性的核苷酸序列；或C)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，以及d)与所述多核苷酸序列有效连接的至少一个调节元件，其中所述至少一个调节元件控制所述多核苷酸序列在靶植物中的表达；(ii)将所述表达载体引入至少一种植物中；和(iii)选择与野生型相比，木质素的量受到调节的至少一种转基因植物。SEQ ID NO 59_93、164_169、170 和 188-195 所示序列代表从毛果杨(Populustrichocarpa)中预测的候选基因的序列，SEQ ID NO 94-112、157、171-175代表来自杂交白杨的候选基因的序列，SEQ ID NO 23-58、113-115和157-163、176-187克隆自杂交白杨。本领域技术人员会理解，这些基因中SEQ ID NO :23-115以及157-195所述序列的5'和3' 的其它序列可使用常规克隆技术容易地获得，例如Sambrook等所述。在本发明的另一些实施方案中，以上a)_d)的核酸序列与本文所定义的SEQ ID NO 23-115和157-195基本相同。可通过引入遗传修饰来实现对表达的调节，优选在编码多肽或这些多肽的同源物的包含SEQ ID NO 23-115和157-195的基因座中引入。还可通过下列之一实现修饰例如使用SEQ ID NO 23-115和157-195的一个或多个或其片段作为产生所需植物的方法的任何步骤中的标记物而进行的T-DNA活化、 TILLING、同源重组、定点诱变或定向育种。根据本发明的一个方面，所述调节为降低木质素的产量。根据本发明的另一方面，所述调节为提高木质素的产量根据本发明的更具体实施方案，所述方法包括提供核酸构建体(如重组DNA构建体)的步骤，所述构建体包含选自下列的核苷酸序列a)包含选自 SEQ ID NO :23 至 58、113 至 115 和 157-163、176-187 的序列的核苷酸序列；b)核苷酸序列a)的互补核苷酸序列；c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段；d)与a)、b)和c)的序列中的任何一个具有至少60%同一性的核酸序列；但在SEQ ID No 23的情况下同一性为99. 6% ；e)在严格条件下与a)、b)或c)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在本发明的另一些方面，d)中的核酸序列与本文定义的a)、b)或c)序列中的任一个基本相同。在本发明该方面的优选实施方案中，a)的核苷酸序列选自SEQ ID NO 23至58。本领域中存在多种用于产生本发明的核酸序列和核酸/DNA构建体的方法。鉴定和分离DNA克隆的方法是本领域技术人员公知的，描述于例如Sambrook等，Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (第三版)，Vol. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,2001。本发明的核酸序列可通过适于本发明的多种体外扩增方法由适当选择的特异性引物或简并引物来产生。足以指导本领域技术人员通过体外扩增方法产生本发明同源核酸的方案实例(包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qi3复制酶扩增和其它 RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA))可见于Sambrook (同上)。或者，本发明的核酸构建体可从固相合成法产生的片段组装而成。通常，分别合成最多约100个碱基的片段，然后通过酶法或化学法连接产生所需序列，例如编码转录因子的全部或一部分的多核苷酸。例如，使用亚磷酰胺法进行的化学合成是本领域技术人员公知的。根据这些方法，合成寡核苷酸，纯化，与其互补链退火，连接，然后任选地克隆进合适的载体。如所述，上述序列来自杂种白杨和毛果杨。如本领域技术人员了解地，所述序列的同源物可分离自其它物种，其非限制性实例包括刺槐(acacia)、桉树、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃、橡树、岑树、山核桃树、桦树、栗树、桤木(alder)、枫树、悬铃木(sycamore)、银杏、棕榈树、香枫(sweet gum)、柏树、花旗松(Douglas fir)、揪树(fir)、红杉、铁杉、雪松、 杜松(juniper)、落叶松、松树、红杉(redwood)、云杉和紫杉、苹果、李子、梨、香蕉、柑橘、 猕猴桃、柠檬、樱桃、葡萄树、无花果、棉花、竹、柳枝稷(switch grass)、草芦(red canary grass)、芒属(Miscantus species)和橡胶植物。所述序列的可用同源物还可分离自杨柳科(Salicaceae)的硬木植物，例如分离自柳属(salix)和杨属(populus)。该属的成员常用名称为柳树、杨树和白杨。特别地，本发明的方法可包括提供核酸构建体的步骤，例如根据本发明可提供和使用重组DNA构建体，其包含的核苷酸序列与所述特定序列相比包含保守性改变，仅改变所编码多肽中的一个或几个氨基酸。因此，提供和使用包含编码多肽的核苷酸序列的重组 DNA构建体在本发明的范围之内，所述多肽包含SEQ ID NO 23至115以及157-195核苷酸序列编码之多肽的保守性替换变体。不改变由多核苷酸所编码的氨基酸序列的序列变化称为“沉默”替换。除了分别编码甲硫氨酸和色氨酸的密码子ATG和TGG之外，相同氨基酸的任何可能密码子可通过本领域中可用的多种技术进行替换，例如定点诱变。因此，本发明还可提供重组核酸构建体， 其中核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。在本发明的某些其他实施方案中，C)或d)的子序列或片段与上述a)项或b)项的核苷酸序列的保守结构域具有本文所定义的显著序列同一性。因此，有方法可用于鉴定与本文所述一种或多种多核苷酸或者所述多核苷酸所编码一种或多种靶多肽或者本文所述其它分子相似或旁系同源或直系同源或同源的序列，并且可包括将给定的植物表型或基因功能与序列相联系或关联。DNA构建体根据本发明的第二个主要方面，提供了含有至少一种上述序列的DNA构建体，如重组DNA构建体。所述DNA构建体可为载体。特别地，所述重组DNA构建体可包含选自以下的核苷酸序列a)包含选自SEQ ID NO :23_115、157-195之序列的核苷酸序列；或b)核苷酸序列a)的互补核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段；或d)与a)、b)和c)的序列中的任何一个具有至少60%同一性的核酸序列；但对于 SEQ ID No 23的情况同一性为99. 6% ；或e)在严格条件下与a)、b)或c)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在本发明的所选实施方案中，d)中的核酸序列与a)、b)和C)中的任何一种序列具有本文所定义的显著同一性。只要对木质素特性有影响，编码一个或更多个氨基酸的添加、缺失、替换或插入的多肽的a)、b)、c)和d)的DNA构建体变体也在本发明的范围内。而且，根据以上所述，所述核苷酸序列编码包含多肽(a)之保守性替换变体的多肽。此外，所述核苷酸序列在核苷酸序列中含有沉默替换。在涉及本发明该方面的另外实施方案中，子序列或片段与以上a)项所述的核苷酸序列的保守性结构域具有本文所定义的显著序列同一性。在其它实施方案中并根据以上描述，所述重组DNA构建体还含有与所述核苷酸序列有效连接的启动子，其可为组成型、诱导型或组织特异性。尤其地，所述重组DNA构建体还可在由基因的全部开放阅读框组成的转录盒的前面包含强组成型启动子，所述盒的后面是终止子序列。在本发明的一个具体实施方案中，所述核酸构建体或重组DNA构建体还在转录盒的前面含有强组成型启动子，所述盒由部分靶基因、其后的植物功能性内含子以及其后的反向的靶基因相同部分组成，所述盒的后面是终止子序列。优选的载体是将本发明的核苷酸序列之一以反向重复插入的类型。因此，根据一个实施方案，本发明涉及权利要求1-13任一项的方法，其中所述重组DNA构建体还在转录盒的前面包含强组成型启动子，所述盒含有权利要求1的核苷酸序列、其后是植物功能性内含子，其后是反向的权利要求1的核苷酸序列。所述重组DNA构建体可用于转化植物的可再生细胞并从所述转化细胞再生转基因植物。在本发明本示例性实施方案中，所述重组DNA构建体含有SEQ ID NO :23_58和 112-115的序列。载体的构建一般说来，本领域技术人员能够构建本发明的载体并设计重组基因表达的方案。 制备载体的一般方案的进一步细节参照Molecular Cloning :a Laboratory Manual 第三版，Sambrook 等，2001，Co Id Spring Harbor Laboratory Press。关于植物载体和在植物中进行克隆的进一步信息可见Gelvin SB 和 khilperoort RA (编 M2000)Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht :Kluwer Academic Publishers。用于基因的启云力子可影口向过表达的水平、时间、组织、特异性或可诱导性。一般来说，基因的过表达可使用重组DNA构建体来实现，所述重组DNA构建体含有与DNA元件有效连接的启动子，所述DNA元件包含所述基因的基因组DNA或cDNA的区段的有义元件，例如，所述区段应含有足以产生功能性蛋白的开放阅读框，优选全部开放阅读框。在本发明的相关实施方案中，所述核酸构建体或重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。在本发明的一个优选实施方案中，用于RNAi的所述核酸构建体或重组DNA构建体包含 SEQ ID NO :116 序列，即名为 pK7GWIWG2(I)的载体，Karimi，2002。在本发明另一个优选的实施方案中，用于过表达的所述核酸构建体或重组DNA构建体含有SEQ ID NO 117序列，即名为pK2GW7的载体，Karimi, 2002 获得改变的基因产物水平的方法以下的实验部分是对每个基因的描述和它们的已知信息以及其如何与木质素相关。本发明的一个方面是提高某些基因的表达，本文给出了其如何实现的非限制性实施例。基因的上调或过表达可例如通过以下来实现将基因的全部开放阅读框置于适合的启动子(在其它部分描述)之后，并且通常将终止子和多聚腺苷酸化信号序列放置在待过表达基因的序列3’端。
本发明的一个其它方面是降低某些基因的表达，本文给出了其如何实现的非限制性实施例。抑制基因的表达可例如通过使用核酶或反义序列或通过RNAi种类进行下调来达到。对于如何下调基因的几个详细描述也可在文献和专利文件中找到，一个例子是WO 2008/067841，其通过参考并入本文。基因SEQ ID NO :23-115和157-195之一可用作标记辅助育种中的靶标，因为基因调节序列的变化可改变表达模式，编码序列的改变可改变基因功能，我们已经显示出操纵这些基因改变了所需的性状。这通常称为，基因SEQ ID NO :23-115和157-195可用作标记辅助育种中的候选基因(Bracb^nftx)Vart 2007和Varshney等2005)。可将其用于进行基因活性的上调和下调。利用本发明的一个具体方法是测定SEQ ID NO :23-115和157-195中一种或多种基因的表达，这使用例如在天然群体中进行定量RT-PCR来实现，并且选择所测基因特别高或低表达的，使用这些植物作为育种方案中的亲本，这可在每个育种周期中重复进行。本领域已知很多定量基因表达的方法，一种有效的方法是实时PCR，其在Bustin 2000中描述。此外，本发明的核酸构建体或重组DNA构建体可用于基因替换目的，以改变植物的木质素特性表型。内源基因表达的抑制可以例如通过使用核酶来实现。核酶是具有高特异性核糖核酸内切酶活性的RNA分子。核酶的生产和使用公开于US 4987071和US 5543508。下文讨论了反义技术，但应注意，包含反义RNA的合成核酶序列可用于赋予反义RNA以RNA切割活性，使得与反义RNA杂交的内源mRNA分子被切割，继而导致对内源基因表达的反义抑制提
尚ο载体(其中相关基因同源物所编码的RNA过表达)也可用于获得相应内源基因的共抑制，例如，以Jorgensen的US 5231020中所述的方式。这些共抑制(也称为有义抑制)不需要将完整的基因序列引入植物细胞，也不需要所引入的序列与内源目的序列完全相同。但是，抑制效率随着杂交特异性的提高(例如，所引入序列的加长和/或所引入序列与内源转录因子基因之间序列相似性的提高)而提高。表达非翻译形式基因(例如包含一个或多个终止密码子或无义突变的序列)的载体也可用于抑制内源基因的表达，由此降低或消除其活性并改变一个或多个性状。产生这些构建体的方法描述于US 5583021。特别地，这些构建体可通过向基因中引入提前终止密码子来产生。进行靶向DNA插入的一种方法是通过使用逆转录病毒DNA整合机器，如WO 2006/078431所述。此技术基于通过将整合酶与DNA结合蛋白(束缚蛋白(tethering protein))有效偶联以改变逆转录病毒和逆转座子整合酶的整合位点特异性的可能性。整合酶的改造优选在核酸水平上进行，通过用PCR改变整合酶的野生型编码序列。这样，整合酶复合物可被引导至期望的部分或者引导至远离不希望的基因组DNA部分，从而产生所需的整合位点特征。可用于改变基因表达和基因活性的另一种技术是TILLING，“靶向诱导的基因组局部损伤(Targeting Induced Local Lesions in Genomes) ”，其为以靴向方式改变基因功能的非转基因方法。该方法包括例如用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)诱变植物，然后定位特定的预期基因已发生改变的个体。该技术描述于例如Slade和Knauf，2005 和 Henikoff 等。一种消除基因表达的方法是通过使用根癌农杆菌T-DNA进行的插入诱变。在产生插入突变体之后，可筛选所述突变体，以鉴定在合适基因中含有插入的那些。可将在期望基因中含有单转基因插入事件的植物进行杂交，以产生所述突变的纯合植物。通过用其它方式操纵内源基因的活性或表达水平，本发明的多核苷酸和多肽还可在没有表达盒的情况下在植物中表达，例如通过用T-DNA活化标记来异位表达基因， Ichikawa等(1997) ；Kakimoto等(1996)。该方法包括用含有多个转录增强子的基因标签来转化植物，一旦所述标签插入到基因组中，侧翼基因编码序列的表达就会失调，Ichikawa 等(1997) ；Kakimoto等(1996)。在另一个实例中，可修饰植物中的转录机器以提高本发明多核苷酸的转录水平(参见，例如PCT公开WO 96/06166和WO 98/53057，其描述了通过改变DNA结合基序中的特定氨基酸来修饰锌指蛋白的DNA结合特异性)。然而，包含上述核苷酸序列的重组DNA构建体尤其可用于表达的有义和反义抑制，例如用于下调特定基因的表达，从而得到具有改变的木质素特性的植物表型。也就是说，本发明的核苷酸序列或其子序列或反义序列可用于阻断天然同源核酸的表达。多种常规的有义和反义技术是本领域中已知的，例如Lichtenstein和Nellen (1997)所述。反义方法的目的是使用与靶基因互补的序列来阻断其表达，并产生突变体细胞系或生物，其中单个选定蛋白的水平被选择性减少或消除。用于植物细胞中的基因表达反义调节的更详细描述参照US 5107065，其内容以整体并入本文。由双链RNA诱导的基因沉默通常称为RNA干扰或RNAi。RNA干扰利用这样的分子机制双链核糖核酸(dsRNA)片段干扰与所述dsRNA具有同源序列的特定基因的表达。该过程由加工microRNA的相同细胞机器(称为RNA诱导的沉默复合物(RISC))介导。该过程由核糖核酸酶蛋白Dicer引发，其结合并切割外源双链RNA分子，产生20-25个碱基对的双链片段，其每一端具有少量未配对突出碱基。Dicer产生的短双链片段(称为小干扰 RNA (siRNA))彼此分开并整合进活性RISC复合物中。如果RNA转录本的一部分被RNAi分子或构建体靶向，则整个转录本被下调。植物中通过转录dsRNA进行的RNAi基因抑制的更详细描述参照US6506559、US 2002/0168707 和 WO 98/53083、WO 99/53050 和 WO 99/61631，所有这些通过引用以整体并入本文。用于RNAi的目前优选的核酸构建体是pDONR载体(Invitrogen USA)以及采用 Gateway 技术的目标载体 pK2GW7 (Invitrogen USA)。植物细胞的转化根据本发明，所述方法包括用所述核酸构建体或重组DNA构建体转化植物可再生细胞以及从所述转化细胞再生转基因植物的另外步骤。在将上述DNA构建体或载体引入植物细胞时，必须考虑本领域技术人员公知的某些因素。如上所述，待插入的核酸应组装在含有驱动转录之有效调节元件的构建体中。必须提供将所述构建体转运进细胞的方法。构建体一旦处于细胞之内，则将整合或不整合进内源染色体物质中。可使用本领域技术人员公知的转化技术将DNA构建体和载体引入植物细胞，以产生具有改变的木质素特性的转基因植物，特别是转基因树木。
本领域技术人员会了解，多种宿主细胞可用作本发明DNA构建体和载体的接受者。宿主细胞的非限制性实例包括以下组织中的细胞胚组织，愈伤组织类型I、II和III， 胚轴，分生组织，根组织，用于韧皮部中表达的组织，叶盘、叶柄和茎节间。如上所述，农杆菌转化是本领域技术人员广泛使用的转化树木物种特别是硬木物种(例如杨树)的一种方法。产生稳定的可育转基因植物是目前本领域中的常规技术。其它方法可用于农杆菌转化低效或无效的情况(例如在某些裸子植物物种中)，例如微射弹或颗粒轰击、电穿孔、显微注射、直接DNA摄入、脂质体介导DNA摄入或者涡旋(vortexing) 法。或者，可使用不同技术的组合来提高转化过程的效率，例如用涂覆有农杆菌的微粒轰击或微射弹轰击来诱导创口，然后与农杆菌共培养。应理解，转化技术的具体选择将由转化某些植物物种的效率以及实施本发明的人的经验和对特定选择方法的喜好来确定。对于本领域技术人员来说显而易见的是，将核酸引入植物细胞的转化系统的具体选择对本发明而言不是关键的，也不是本发明的限制因素，对植物再生技术的选择也是如此。在转化之后，优选使用整合进转化载体中的显性选择标记物来选择转基因植物。 通常，这些标记物将赋予转化植物以抗生素或除草剂抗性，转化体的选择可通过将植物暴露于合适浓度的抗生素或除草剂来实现。使用D型氨基酸(基于植物仅可容许L型这一事实)的新型选择标记提供了快速、高效且对环境友好的选择系统。此选择系统的一个诱人特征是其允许进行选择和反向选择。随后，可按照本领域标准方法再生植物，例如从单个细胞、愈伤组织或叶盘再生。 几乎任何植物均可从该植物的细胞、组织和器官完全再生，Gelvin SB and Schilperoort RA (编)(2000)Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht :Kluwer Academic Pub 1 i shers。在选择转化植物并培养至成熟后，鉴定显示改变的木质素特性的那些植物。另外，为了证实该表型是由于本文公开的多肽或多核苷酸表达水平或活性改变所致，可通过使用Northern印迹、RT-PCR或微阵列分析mRNA表达或者使用免疫印迹或^festern印迹或凝胶迁移测定分析蛋白质表达来对其进行测定。植物根据本发明的另一个方面，提供了与野生型相比具有改变的木质素特性的植物。 所述植物可为转基因植物。转基因植物可含有包含如下核苷酸序列的重组多核苷酸(DNA构建体)，所述核苷酸序列能改变植物中SEQ ID 23-115至少之一的基因产物水平，导致将在温室中在18小时光周期、22°C/15°C (白天/夜晚)的温度下培养8-9周并且每周用1 100稀释(终浓度， N03，55g/1 ；NH4，29g/l ；P, 12g/l ；K，56g/1 ；Mg 7，2g/l ；S，7，2g/1 ；B,0, 18g/l ；Cu，0，02g/1 ； Fe，0，84g/1 ；Mn，0，42g/1 ；Mo，0，03g/1 ；Zn，0，13g/1)的 Weibulls Rika S NPK 7-1-5 施肥的所述转基因植物组与相同条件下培养的野生型植物组比较时，木质素含量发生改变。生长条件必须对具体的转化物种进行适应性改变，因为它们具有不同的生长最佳条件。所述改变可为木质素含量降低-6 %至-20 %和木质素含量提高+5 %至+16 %不等。根据本发明的具体实施方案，至少一种基因的基因产物水平相对于对应野生型植物中的水平发生了变化，所述基因含有选自以下的核苷酸序列
a) SEQ ID NO :23_115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQ ID NO :24-115、157-195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或与SEQ ID NO 23的核苷酸序列有至少99. 6%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。本发明尤其涉及具有更高木质素含量的植物，以及具有更低木质素含量的植物， 其含有在“具有改变的木质素特性的植物的产生方法”标题下提及的基因。根据本发明的另一个实施方案，转基因植物含有重组多核苷酸(DNA构建体)，其包含选自以下的核苷酸序列a)包含选自SEQ ID NO :23_115、157-195之序列的核苷酸序列；或b)核苷酸序列a)的互补核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段；或d)与a)、b)和C)的序列中的任何一个具有至少60%同一性的核酸序列；但在SEQ ID No 23的情况下同一性为99. 6% ；或e)在严格条件下与a)、b)或c)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在本发明该方面的另一些实施方案中，d)的核酸序列与a)、b)或C)中的任何一种序列具有本文定义的显著同一性。如以上所述，本领域技术人员会理解，本领域有多种方法用于产生本发明核酸序列和多核苷酸构建体，例如，通过克隆技术，组装通过固相合成产生的片段。特别地，根据本发明还可提供和使用这样的本发明转基因植物，其可包含含有如下核苷酸序列的重组DNA构建体，所述核苷酸序列与所述的特定序列相比，含有改变所编码多肽中仅一个或几个氨基酸的保守性突变。因此，在本发明范围中的是，提供含有重组 DNA构建体的转基因植物，所述DNA构建体含有编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽含有多肽a)或d)的保守性替换变体。因此，本发明还可提供重组DNA构建体，其中所述核苷酸序列在核苷酸序列中具有沉默替换，也就是说，所述重组DNA构建体可含有不改变多核苷酸所编码氨基酸序列的序列改变。在本发明的一些其它实施方案中，所述子序列或片段与以上在a)或d)中所述的核苷酸序列的保守性结构域具有显著序列同一性。在另一些实施方案中，本发明提供的转基因植物含有重组多核苷酸构建体，所述构建体进一步包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。在另一些实施方案中，所述重组多核苷酸构建体还在所转录盒前含有强组成型启动子。在本发明目前优选的实施方案中，本发明的转基因植物包含重组DNA构建体，所述构建体含有SEQ ID NO :23-115、157-195的一个或更多个序列。本发明的另一个方面提供了转基因植物(或有目的地改变了 SEQ ID NO :23-115, 157-195或上述其变体中一个或多个基因水平(表达升高或降低)并含有重组多核苷酸的植物)的植物细胞、子代植物或任何植物材料。本发明的另一个方面提供了转基因植物(或有目的地改变了 SEQ ID NO :23-115, 157-195或上述其变体中一个或多个基因水平(表达升高或降低)并含有重组多核苷酸的植物)的植物细胞、子代植物或任何植物材料，其中由Klason法测定的木质素含量被改变。本发明还涉及植物产生的木材，所述植物可为上述的转基因植物。其可包含SEQ ID NO :23-115,157-195或上述其变体中一个或多个。可通过按照Klason法测定木质素水平来进行植物的筛选。植物物种根据本发明，转基因植物可以是多年生植物，其优选为木本植物或木本物种。在一个有用实施方案中，所述木本植物是硬木植物，其可选自刺槐、桉树、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃、橡树、岑树、柳树、山核桃树、桦树、栗树、杨树、桤木、枫树、悬铃木、银杏、棕榈树和香枫。来自杨柳科的硬木植物(例如柳树、杨树和白杨，包括其变种)是特别有意义的，因为这两组包括了速生的树木物种或木质灌木，它们被特别地栽培用于提供木材和生物燃料。在另一些实施方案中，所述木本植物是针叶树，其可选自柏树、花旗松、揪树、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、红杉、云杉和紫杉。在一些有用的实施方案中，所述木本植物是出产果实的植物，其可选自苹果、李子、梨、香蕉、柑橘、猕猴桃、柠檬、樱桃、葡萄树和无花果树。可用于本方法的其它木本植物也可选自棉花、竹和橡胶植物。其他可用植物为生物质生产而培养的草，例如芒属和柳枝稷。本发明扩展至通过本文所述方法获得的上述转基因植物的任何植物细胞，以及所有植物部分，其包括植物的可收获部分、其种子和繁殖体，以及植物外植体或植物组织。本发明还涵盖包含本发明DNA构建体的植物、其部分、植物细胞或植物后代和任何植物材料。 所述植物材料可包含在任何在技术上有用的材料中。包含这些植物材料的在技术上有用的材料的实例是颗粒和浆。本发明还扩展到涵盖通过上述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一的要求是该后代显示的基因型和/或表型特征与根据本发明方法在亲本中产生的那些相同。提高的木质素质量和数量此外，本发明的核酸构建体或重组DNA构建体可用于基因替换目的以改变植物中的木质素水平。本发明涉及改变木材化学性质的问题，尤其对于改变木质素质量和数量。这些树木可用于多种应用中。例如以下应用1.改变表面化学性质，例如用于复合材料。2.糖化能力，重点在于改变木质素水平和/或组成和/或木质素与细胞壁碳水化合物的结合。3.针对能量含量改变木质素水平。4.针对成浆特性改变木质素水平。本发明人发现，某些基因的下调和/或过表达改变了所产生转基因树木中木材的化学性质。尤其地，我们发现一些基因可用于改变木质素水平。在一个RNAi基因发掘方案中发现了这些基因，其基因选择的基础与专利申请WO 2008/067840和WO 2008/067841中所述的相同，但是在其中采用木材的FTHR分析进行了第一水平分析，用Klason Lignin分析进行了第二水平分析。因此，根据一个方面，本发明涉及核苷酸序列在植物中的用途，所述植物用于降低木质素水平以提高生物精炼和乙醇生产中的糖化以及用于降低浆和纸工艺中的木质素水平，所述核苷酸序列选自a)选自SEQ ID NO: 176、177和180-187基因的至少一个过表达基因和/或选自 23、27-29、31、33-44、48-52、55-57、158、161 和 163 的至少一个下调基因，或b)与 SEQ ID NO 27_29、31、33-44、48-52、55_57、158、161、163、176、177 和 180-187的核苷酸序列有至少60%同一性或与SEQ ID NO 23有至少99. 6%同一性的核苷酸序列，或c) a)或b)核苷酸序列的子序列或片段。在降低木质素水平以提高生物精炼中和乙醇生产中的糖化以及降低浆和纸加工中的木质素水平的植物中，优选的核苷酸序列选自23、28、四、31、33-38、40、42、55、57、158、 161和163。木质素水平见表1。根据另一个方面，本发明涉及核苷酸序列在为产生能量而提高木质素水平的植物中的用途，所述核苷酸序列选自a)选自SEQ ID NO :113、114、115、178和179基因的至少一个过表达基因和/或选自 24-26、30、32、46、47、53、54、58、157、159、160 和 162 的至少一个下调基因，或b)与 SEQ ID NO 24_26、30、32、46、47、53、54、58、113-115、157、159、160、162、178 和179的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或c) a)或b)核苷酸序列的子序列或片段。在为产生能量而提高木质素水平的植物中，优选的核苷酸序列选自26、30、32、46 或 113-115、178-179。特别地，本发明涉及核苷酸序列在为产生能量而提高木质素水平的植物中的用途，所述核苷酸序列选自a)选自SEQ ID NO 113、114和115基因的至少一个过表达基因和/或选自M-26、 30、32、46、47、53、54、58、157、159、160 和 162 的至少一个下调基因，或b)与 SEQ ID NO 24_26、30、32、46、47、53、54、58、113-115、157、159、160、162、178 和179的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或c) a)或b)核苷酸序列的子序列或片段。本发明还涉及核苷酸序列在植物中的用途，所述植物用于降低木质素水平以提高
生物精炼和乙醇生产中的糖化以及降低浆和纸加工中的木质素水平，所述核苷酸序列选自a)选自 23、27-29、31、33-44、48-52、55-57、158、161 和 163 的至少一个下调基因， 或b)与 SEQ ID NO 27_29、31、33-44、48-52、55_57、158、161、163、176、177 和 180 和 187的核苷酸序列有至少60%同一性或与SEQ ID NO 23有至少99. 6%同一性的核苷酸序列，或c) a)或b)核苷酸序列的子序列或片段。这些优选基因的作用在下表la、b、c和d中显示。表Ia过表达时木质素含量高于野生型的基因
权利要求
1.产生与其野生型相比具有改变的木质素特性的植物的方法，其包括改变所述植物中至少一种基因的基因产物水平，所述基因包含选自以下的核苷酸序列a)SEQ ID NO :23-115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQID NO J4-115U57-195的核苷酸序列有至少60%同一性或与SEQ ID NO 23 的核苷酸序列有至少99. 6%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
2.权利要求1的方法，其用于产生具有更高木质素含量的植物，该方法包括在a)、b)或 c)的组中过表达SEQ ID NO :113、114、115、178和179中至少一种基因和/或下调SEQ ID NO :24-26、30、32、46、47、53、54、58、157、159、160 和 162 中至少一种基因。
3.权利要求1的方法，其用于产生具有更低木质素含量的植物，该方法包括在a)、b)或 c)的组中过表达SEQ ID NO 176、177和180-187基因的至少一种和/或下调SEQ ID NO 23、27-29、31、33-44、48-52、55-57、158、161 和 163 基因的至少一种。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其包括i)选择表达选自以下的至少一种核苷酸序列的植物物种a)SEQ ID NO :23-115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQID NO :23-115、157-195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段， )将i)中选择的植物物种与i)中选择的相同或其他植物物种杂交，iii)选择与i)中选择的植物物种相比，选自下列的至少一种核苷酸序列的表达受到调节的植物a)SEQ ID NO :23-115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQID NO :23-115、157-195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，iv)任选地，再将iii)中得到的植物杂交一次或多次，并选择与任何i)中所用植物物种和/或iii)中所得植物相比，选自下列的至少一种核苷酸序列的表达受到调节的植物a)SEQ ID NO :23-115、157-195 的核苷酸序列；b)与SEQID NO :23-115、157-195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
5.权利要求1-3中任一项的方法，所述方法的步骤包括i)提供表达载体，其包含选自下列的核苷酸序列a)SEQ ID NO :23-115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQID NO :23-115、157-195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，以及d)与所述多核苷酸序列有效连接的至少一个调节元件，其中所述至少一个调节元件控制所述多核苷酸序列在靶植物中的表达； )将所述表达载体引入至少一种植物中；和iii)选择与其野生型相比，木质素的量受到调节的至少一种转基因植物。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述受到调节的表达是通过引入遗传修饰实现的，优选在编码多肽或这些多肽之同源物的包含SEQ ID N0:23-115、157-195的基因的位置处引入。
7.权利要求6的方法，其中所述修饰通过下列之一来实现T-DNA活化、TILLING、同源重组、定点诱变或定向育种，其使用SEQ ID N0:23-115、157-195中的一种或多种或其片段作为产生所需植物之方法的任何步骤中的标记。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述调节是木质素产量下降。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述调节是木质素产量提高。
10.前述权利要求1-3、4、6-8中任一项的方法，其包括提供重组DNA构建体的步骤，所述构建体包含选自以下的核苷酸序列a)包含选自SEQID NO :23-115、157-195之序列的核苷酸序列；或b)a)所述核苷酸序列的互补核苷酸序列；或c)a)或b)所述核苷酸序列的子序列或片段；或d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60%同一性的核酸序列；或e)在严格条件下与a)、b)或c)所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
11.权利要求1-3、4、6-9中任一项的方法，其中所述核苷酸序列编码含有多肽(a)之保守性替换变体的多肽。
12.权利要求1-3、4、6-10中任一项的方法，其中所述核苷酸序列在核苷酸序列中含有沉默替换。
13.权利要求1-3、4、6-11中任一项的方法，其中所述子序列或片段与权利要求8a)中所述核苷酸序列的保守性结构域具有至少65%的序列同一性。
14.权利要求9至12中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。
15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体还在所转录的盒的前面包含强组成型启动子，所述盒含有权利要求1所述核苷酸序列、其后的植物功能性内含子以及其后的反向的权利要求1所述核苷酸序列。
16.权利要求10至14中任一项的方法，其中所述方法还包括用所述重组DNA构建体转化植物的可再生细胞并从所述转化细胞再生转基因植物的步骤。
17.与其野生型相比具有改变的木质素特性的植物，其包含能够改变该植物中至少一种基因的基因产物水平的核苷酸，其中所述至少一种基因包含选自以下的核苷酸序列a)SEQ ID NO :23-115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQID NO :23-115、157-195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列；或c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。
18.具有更高木质素含量的权利要求17所述植物，其包含a)、b)或c)组中过表达的 SEQ ID NO :113、114 和 115、178 和 179 基因的至少一种和 / 或下调的 SEQ ID NO :24-26、 30、32、46、47、53、54 和 58、157、159、160 和 162 基因的至少一种。
19.具有更低木质含量的权利要求17所述植物，其包含a)、b)或c)组中过表达的SEQ ID NO :176、177 和 180-187 基因的至少一种和 / 或下调的 SEQ ID NO :23、27-29、31、33_44、 48-52、55-57、158、161 和 163 基因的至少一种。
20.含有重组多核苷酸(DNA构建体)的转基因植物，其包含选自以下的核苷酸序列a)包含选自SEQ ID NO :23-115、157-195之序列的核苷酸序列；或b)a)所述核苷酸序列的互补核苷酸序列；或c)a)或b)所述核苷酸序列的子序列或片段；或d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60%同一性的核酸序列；或e)在严格条件下与a)、b)或c)所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
21.权利要求20的转基因植物，其中所述选自23-115、157-195的核苷酸序列编码含有多肽a)或d)之保守性替换变体的多肽。
22.权利要求20至21中任一项的转基因植物，其中核苷酸序列在核苷酸序列中含有沉默替换。
23.权利要求20至22中任一项的转基因植物，其中所述子序列或片段与权利要求17 所述核苷酸序列的保守性结构域具有至少60%的序列同一性。
24.权利要求17至22中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。
25.权利要求17至M中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体还在所转录的盒的前面包含强组成型启动子，所述盒含有权利要求4所述核苷酸序列、其后的植物功能性内含子以及其后的反向的权利要求17所述核苷酸序列。
26.植物的植物细胞或植物后代，所述植物可为权利要求17至25中任一项的转基因植物。
27.植物产生的木材，所述植物可为权利要求17至25中任一项的转基因植物。
28.DNA构建体，如载体，其含有权利要求10至13所述的至少一种序列。
29.植物细胞、植物后代或植物材料，其含有权利要求观所述DNA构建体。
30.核苷酸序列用于鉴定与野生型相比具有改变的木质素特性的植物的用途，所述核苷酸序列选自a)SEQ ID NO :23-115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQID NO :23-115,157-195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列；或c)a)或b)所述核苷酸序列的子序列或片段。
31.核苷酸序列在标记辅助育种中作为候选基因的用途，所述核苷酸序列选自a)SEQ ID NO :23-115、157-195 的核苷酸序列；或b)与SEQID NO :23-115、157-195的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列；或c)a)或b)所述核苷酸序列的子序列或片段。
32.核苷酸序列在植物中用于为能量生产而提高木质素水平的用途，所述核苷酸序列选自a)选自SEQID而113、114、115、178和179基因的至少一种过表达的基因和/或选自 SEQ ID NO :24-26、30、32、46、47、53、54、58、157、159、160 和 162 基因的至少一种下调的基因，或b)与SEQ ID NO 24-26、30、32、46、47、53、54、58、113-115、157、159、160、162、178 和 179的核苷酸序列有至少60%同一性的核苷酸序列，或c)a)或b)所述核苷酸序列的子序列或片段。
33.核苷酸序列在植物中用于降低木质素水平以改善生物精炼和乙醇生产中的糖化以及用于降低浆和纸加工中的木质素水平的用途，所述核苷酸序列选自a)选自SEQID NO 176、177和180-187基因的至少一种过表达的基因和/或选自SEQ ID NO :23、27-29、31、33-44、48-52、55-57、158、161 和 163 基因的至少一种下调的基因，或b)与SEQ ID N0:27-29、31、33-44、48-52、55-57、158、161、163、176、177* 180-187 的核苷酸序列有至少60%同一性或与SEQ ID NO 23有至少99. 6%同一性的核苷酸序列，或c)a)或b)所述核苷酸序列的子序列或片段。
全文摘要
本发明涉及一组基因，当在植物中对其进行修饰时改变木质素特性。本发明提供可用于本发明方法的DNA构建体(如载体)。而且，本发明涉及由本发明植物产生的木材以及植物的植物细胞或植物后代。更低的木质素水平会导致改进用于生物精炼和乙醇生产的糖化，以及改进的浆和纸。提高的木质素水平将利用木质素的特性用于能量产生。所述基因和DNA构建体可用于鉴定与野生型相比具有改变的木质素特性的植物。本发明的基因和DNA构建体还可用作标记物辅助育种中的候选基因。
文档编号A01H5/00GK102264906SQ200980143917
公开日2011年11月30日 申请日期2009年11月3日 优先权日2008年11月3日
发明者亚尔莫·施拉德尔, 亨利克·阿斯佩堡, 卡琳·约翰松, 图拉·泰里, 安·卡尔松, 帕埃尔·约翰松, 拉尔斯·瓦尔贝克斯, 格兰·松德贝里, 比约恩·松德贝里, 约翰·特吕格, 芒努斯·赫茨贝里, 里希凯希·巴勒劳 申请人:瑞典树木科技公司