专利名称：一种培育抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻品种的聚合育种方法
技术领域：
本发明涉及一种培育抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻品种的聚合育种方法，属 水稻遗传改良与生物技术应用领域。
背景技术：
选育优质、高产、多抗水稻新品种对于提高我国水稻整体育种水平，扩大优质品种 的推广应用，促进农业增效、农民增收，推进水稻生产可持续发展具有重要意义。水稻条纹叶枯病(Rice stripe disease)是长江中下游粳稻地区近年来连续 大发生的病害，对水稻生产构成严重威胁(王才林等，抗条纹叶枯病水稻新品种南粳44 的选育与应用，中国稻米，2007，，(2) :33-34)。大量研究证实，培育抗性品种是防治水 稻条纹叶枯病最经济、有效的途径(陈涛等，水稻条纹叶枯病抗性遗传和育种研究进展， 江苏农业科学，2006，2 :1-4)。分析国内外已育成和推广的抗条纹叶枯病粳稻品种的抗 性来源，大多由同一对不完全显性基因Stv-b1控制(Washio et al.，Studies on the breeding of ricevarieties to stripe disease. Varietial diference in resistance to stripe disease, Japan. J. Breeding,1967,17(1) 91~98 ；Washio et al. , Studies on the breeding of rice varieties resistant to stripedisease. Genetic study on resistance to stripe disease in Japanese upland rice, Japan. J. Breeding, 1968,18(2) 96-101 ；Washio et al. , Studies on the breeding of rice varieties resistantto stripe disease, Genetic studies on resistance to stripe disease in foreign varieties, Japan. J. Breeding, 1968,18 (3) :167_172 ；潘学彪等.江苏抗水稻条 纹叶枯病育种策略.2005，(5) :22-23)。该基因是目前育种中一个十分重要的抗性基因， 其重要性不仅在于它能直接提供对病害而不是对传毒昆虫的抗性，而且在生产上应用了 40 多年仍保持对条纹叶枯病的良好抗性。Hayano-Saito等将Sttbi抗性基因定位在水稻第 11染色体两个BAC重叠的约286Kb的区域内，研究还发现它与其中一个RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism, RFLP)标记 STlO 完全连锁(Saito et al. , Localization of the rice stripe diseaseresistance gene, Stv-b1, by graphical genotyping and linkage analysis with molecular markers, Theor.Appl. Genet. ,1998,96(8) 1044-1049)。除条纹叶枯病外，不少水稻品种食味品质欠佳的事实也是制约我国水稻产业化 健康发展的重要因素。已有研究表明，稻米胚乳中直链淀粉含量是决定米饭质地和食味 品质的主要因素(松尾孝嶺，稲学大成第三卷遺伝篇，東京農山漁村文化協会，1990: 351-354;櫛渕欽也，日本O稲育種-^ 一“一，4 ^ 挑戦，東京，農業技術協会，1992: 125-135)。直链淀粉含量低，米饭黏软，外观油润，有光泽，冷不回生，适口性好；反之，则米 饭质地硬，黏性小，蓬松干燥，光泽差。因此，直链淀粉含量已成为稻米食味品质改良的主 要指标。低直链淀粉含量的稻米，是介于一般黏米和糯米之间的中间类型，其胚乳外观呈云雾状、乳白色，透明度略差，故又俗称为半糯米。其米饭表面光泽透亮，质地柔软，富有弹 性，综合了糯米的柔软性和粳米的弹性，食味品质较佳，且冷不回生，膨化性好。迄今已报道 了 14个低直链淀粉含量的水稻突变基因(朱昌兰等，水稻低直链淀粉含量基因育种利用的 研究进展，中国农业科学，2004，3 (2) :81-88)。根据它们与Wx基因等位性关系的不同，可 分为与Wx等位和非等位两大类，其中暗胚乳突变基因Wx-mq属于与Wx等位的低直链淀粉 含量基因。日本水稻育种家已利用其育成了大量食味品质优良、直链淀粉含量偏低的水稻 品种，如"Milky Queen，，、“关东 194” 和"New-hikari ” 等(Sato et al.，Breeding of low amylose content paddy rice variety"Milky Queen"with goodeating quality,Japan. J.Breeding,1996,46(Suppl 1) 221 ；Sato et al. , Genetic analysis oflow-amylose content in a rice variety,Milky Queen,Japan Breeding Research,2001,3(1) :13_19 ; Tomita et al. , New-hikari, a new rice cultivar, Bull. Fukui. Agric. Exp. ,2007,44 1-20)。关东194是由日本关东地区茨城县作物研究所选育的优质高产抗条纹叶枯病粳 稻品种。该品种不仅含有条纹叶枯病抗性基因Stv-bS同时还含有暗胚乳突变基因Wx-mq， 因而具有良好的条纹叶枯病抗性以及较好的食味品质。但该品种的产量水平较低，一般单 产6000kg/hm2左右，如引种到我国种植，由于受地域、气候等环境因素制约，很难表现出较 好的食味品质。因此，将其作为亲本和优质、高产地方水稻品种进行有目的的杂交，选育同 时具备条纹叶枯病抗性和暗胚乳特性的优良食味高产水稻新品种，既能解决长江中下游地 区条纹叶枯病对当前水稻生产的严重威胁，又能满足城乡居民对优质稻米日益增长的消费 需求。
发明内容
技术问题本发明针对上述情况，利用与条纹叶枯病抗性基因Sttbi紧密连锁的SCAR标记 和与暗胚乳突变基因Wx-mq的共分离的CAPS标记对F2分离世代进行标记位点的检测，结合 田间条纹叶枯病抗性鉴定、籽粒胚乳外观特性观察，快速获得同时含有Sttbi和Wx-mq基 因的纯合体，经多代产量与农艺性状选择，培育出具有条纹叶枯病抗性的优良食味高产水 稻新品系。技术方案一种培育抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻品种的聚合育种方法，包 括1)选用江苏高产粳稻品种武运粳7号为母本(早)与具有条纹叶枯病抗性基因 Sttbi和暗胚乳突变基因Wx-mq的日本粳稻品种关东194为父本(杂交配组。2)种植F1，成熟后混收种子，下一生长季节种植F2。3)对F2群体，分别利用与暗胚乳突变基因Wx-mq共分离的CAPS标记和与条纹叶 枯病抗性基因Strbi紧密连锁的SCAR标记进行辅助选择。苗期各单株DNA的提取采用SDS法。暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测，利用CAPS标记引物正向序列-TGTGGCTGAGGTAGGAGCA-3~，反向序列-AACGCATCTGGTTGTCTTTGT-3“，
进行PCR扩增，反应产物经NIa III酶切，溴化乙锭染色后观察，选择具有215bp 和170bp两条谱带的Wx-mq基因纯合体单株。条纹叶枯病抗性基因Sttbi的分子检测，利用SCAR标记引物正向序列-CGAAAGATGGTTTCTCCACC-3“，反向序列-GACCAAGCAACTAATGACGC-3“，进行PCR扩增，反应产物经溴化乙锭染色后观察，选择具有727bp谱带的含Sttbi 的杂合或纯合体单株。4)综合分析两个标记的检测结果，将F2代中同时含有Strbi基因(纯合体或杂 合体)和Wx-mq基因(纯合体)的单株分别种成F3家系，通过条纹叶枯病抗性的表型鉴定， 选择条纹叶枯病抗性不分离的家系即为同时含有Strbi和Wx-mq基因的纯合体，其条纹叶 枯病抗性基因型为Stv-bStv-bS暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq。5)在上述双基因纯合的家系内选择株高95 110cm、每株8 10穗、每穗140 160粒的优良单株继续加代稳定，F7代获得遗传性稳定、农艺性状一致的抗条纹叶枯病的优 良食味高产水稻新品系宁9108。有益效果1)通过本发明方法在F3代便可鉴定出同时含有条纹叶枯病抗性基因Sttbi和暗 胚乳突变基因Wx-mq的单株，选择准确度达100%，大大提高了选择效率，简化了育种程序， 比一般的常规选择方法可缩短育种年限1-2年。2)本发明方法育成的水稻新品系宁9108与亲本关东194相比，农艺性状有了显著 改善(表1)。其综合性状好，株型集散适中，株高95 98cm，抗倒性较强；分蘖性好，单株 成穗10个左右；穗型较大，每穗总粒数140 160粒，结实率95 97%，千粒重27 29g ； 米粒长宽比1.5左右，心腹白较少。接种鉴定结果表明该品系高抗条纹叶枯病、白叶枯病， 中感穗颈瘟和纹枯病。其胚乳呈半糯特性，外观云雾状、乳白色，米饭晶莹剔透，质地柔软， 口感润滑，富有弹性，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，食味品质极佳。一般单产9 OOOkg/ hm2左右，高产栽培可达10 500kg/hm2以上。3)宁9108聚合了杂交亲本双方抗条纹叶枯病、优良食味以及高产等特性，在江苏 粳稻适宜种植区具有广阔的应用前景。
四
图1武运粳7号/关东194衍生的F2群体中部分单株Wx-mq基因的分子检测(注=M=Maker I ；1 关东194 ；2 武运粳7号；3 =F1 :4_24 部分F2代分离单株)图2武运粳7号/关东194衍生的F2群体中部分单株Sttbi基因的分子检测(注=M:DL2000 ；1 关东 194 ；2 武运粳 7 号；3 :ddH20(阴性对照)；4-24 部分 F2 代分离单株)图3抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻新品系宁9108的选育过程图4抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻新品系宁9108Wx-mq基因型的分子鉴定(注=M =Maker I ；1 关东194 ；2 武运粳7号；3 =F1 ；4-23 新品系宁9108中随机 选取的20个单株)图5抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻新品系宁9108 Stvbi基因型的分子鉴定
(注=M:DL20000 ；1 关东 194 ；2 武运粳 7 号；3 :ddH20 (阴性对照)；4-23 新品系 宁9108中随机选取的20个单株)图6关东194、武运粳7号与宁9108植株形态的比较(注=A关东 194 ；B 武运粳 7 号；C 宁 9108)图7关东194、武运粳7号与宁9108胚乳外观的比较(注=A关东 194 ；B 武运粳 7 号；C 宁 9108)生物保藏宁9108，该品系于2009年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号 CGMCC NO. 3469，分类命名水稻(Oryza sativa)。
五具体实施例方式1)亲本选择武运粳7号，由江苏省常州市武进区农业科学研究所育成，1998年和2000年分别 通过江苏省和国家农作物品种审定委员会审定。该品种产量高，但高感条纹叶枯病，食味品 质较差。其条纹叶枯病抗性和胚乳糯性基因位点基因型为stv-bistv-biWx-bWx-b。全生育 期155 158天，株高95 100cm，每株有效穗10个左右，每穗实粒数130 150粒，结实 率90% 95%，千粒重28 29g。关东194，日本关东地区茨城县作物研究所育成，2003年农林水产省登录，登录名 为农林387号。该品种抗条纹叶枯病，食味品质优良，其条纹叶枯病抗性和胚乳糯性基因位 点基因型为Stv-biStv-biWx-mqWx-mq。全生育期130 135天，株高85 95cm，每株有效 穗6 8个，每穗实粒数100 110粒，结实率93% 95%，千粒重24 25g。以上两个品种均为公知公用材料，国家或江苏省种质资源库可免费提供。具体 参考文献为(钮中一等，武运粳7号的特征特性和高产栽培技术，中国稻米，1998,9-10 ； http://ineweb. narcc. affrc. go. jp/。)2)分子标记辅助选择聚合条纹叶枯病抗性基因Sttbi和暗胚乳突变基因Wx-mq 的流程(1)杂交配组2004年冬季在海南以武运粳7号为母本，关东194为父本配制杂交组合，2005年 正季在南京种植F1,并混收种子。同年冬季在海南种植该组合的F2群体184株。(2) F2代分离群体含StV-M和Wx-mq双基因单株的筛选在分蘖期，分别利用与暗胚乳突变基因Wx-mq共分离的CAPS标记和与条纹叶枯病 抗性基因Sttbi紧密连锁的SCAR标记对F2群体的184个单株进行分子检测。CAPS标记的 酶切结果显示，在F2分离群体中共检测到具有215bp和170bp两条谱带的单株45个，为具 有Wx-mq基因的纯合体；具有385bp、215bp和170bp 3条谱带的单株89个，为具有Wx_mq 基因的杂合体，仅有385bp 1条谱带的单株50个，为不含Wx-mq基因的纯合体(图1)。对 具有215bp和170bp两条谱带的45个单株进行条纹叶枯病抗性基因SttbiSCAR标记的检 测，发现具有727bp谱带的单株29个(图2)。这29个单株即为同时含有Sttbi基因(纯 合体或杂合体)和Wx-mq基因(纯合体)的单株。(3)含Sttbi和Wx-mq双基因纯合单株的表型鉴定2006年正季在南京将筛选到的29个单株分别种成F3家系，每个家系种植40株。分别以亲本关东194和武运粳7号作抗、感对照进行条纹叶枯病抗性鉴定。病级调查标准参 照Washio 等制定的方法(Washio et al. , Testing method for genetic of and breeding forresistance to rice stripe disease, Bull. Chugoku Agr. Exp. Sta. Series. 1968,16 39 197)，抗性评价按周彤等的方法进行(周彤等，粳稻品种对水稻条纹叶枯病的抗性鉴 定及抗病品种镇稻88的遗传分析.植物保护学报，2007，34 (5) :475_479)。鉴定结果表明 关东194和武运粳7号的自然接种发病率分别为0%和62. 5%，说明该试验区条纹叶枯病 的发病较为充分，能有效区别F3家系在田间的抗性水平。29个F2单株衍生的F3家系中有 8个家系的抗病性未发生分离，发病率均在O 5%之间，抗性水平与抗病亲本关东194相 当，属免疫或高抗水平(表2)。成熟后，对8个家系所有单株进行胚乳外观形态观察，结果 均具有暗胚乳特性。因此，这8个家系为具有Strbi双基因的纯合体。(4) Strbi
和Wx-mq双基因纯合后代产量和农艺性状的系统选育根据产量和农艺性状考查结果，在每个F3家系选择10 15个单株，8个F3家系 共选择105个单株，2006年冬季在海南种植105个F4小区，每个小区种植40株。成熟后在 产量和农艺性状表现优异的48个小区进行单株选择，每个小区选择5 10株，共选择350 个单株。中选单株于2007年正季在南京种成F5小区，每个小区种植40株。其中有12个小 区表现农艺性状稳定一致，丰产性较好。2008年进行小区鉴定，选择4个品系于2009年进 行品比试验，其中JD9108表现优异，暂定名为“宁9108”。其选育过程如图3所示。为防止 Stv-bi* Wx-mq双基因纯合的特征在选育、收获过程中出现丢失，2009年在水稻分蘖期，从 JD9108小区中随机选取20个单株进行分子检测。其中，SCAR标记的鉴定结果显示所有单 株样品均出现一条约727bp的特征条带，这表明宁9108为具有Stv-bStv-bi抗性基因的纯 合体(图4) ；CAPS标记的检测结果也证实该品系还同时具有纯合的暗胚乳突变基因型(图 5)。这一检测结果与田间对条纹叶枯病抗性的调查以及成熟后对胚乳外观形态的观察结果 完全一致。(4)抗条纹叶枯病、优良食味高产水稻新品系宁9108的农艺性状抗条纹叶枯病、优良食味高产水稻新品系宁9108的综合性状好，株型集散适中， 株高95 98cm，抗倒性较强；分蘖性好，单株成穗10个左右；穗型较大，每穗总粒数140 160粒，结实率95 97%，千粒重27 29g ；米粒长宽比1. 5左右，心腹白较少。接种鉴定 结果表明该品系高抗条纹叶枯病、白叶枯病，中感穗颈瘟和纹枯病。其胚乳呈半糯特性，外 观云雾状、乳白色，米饭晶莹剔透，质地柔软，口感润滑，富有弹性，综合了糯米的柔性和粳 米的弹性，食味品质极佳。一般单产9 000kg/hm2左右，高产栽培可达10 500kg/hm2以上。表1水稻新品系宁9108与关东194、武运粳7号重要农艺性状比较(2009年)
权利要求
一种培育抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻品种的聚合育种方法，其特征在于1)选用江苏高产粳稻品种武运粳7号为母本♀与具有条纹叶枯病抗性基因Stv bi和暗胚乳突变基因Wx mq的日本粳稻品种关东194为父本杂交配组；2)种植F1，成熟后混收种子，下一生长季节种植F2；3)对F2群体，分别利用与暗胚乳突变基因Wx mq共分离的CAPS标记和与条纹叶枯病抗性基因Stv bi紧密连锁的SCAR标记进行辅助选择，苗期各单株DNA的提取采用SDS法；暗胚乳突变基因Wx mq的分子检测，利用CAPS标记引物正向序列5` TGTGGCTGAGGTAGGAGCA 3`，反向序列5` AACGCATCTGGTTGTCTTTGT 3`，进行PCR扩增，反应产物经NIa III酶切，溴化乙锭染色后观察，选择具有215bp和170bp两条谱带的Wx mq基因纯合体单株；条纹叶枯病抗性基因Stv bi的分子检测，利用SCAR标记引物正向序列5` CGAAAGATGGTTTCTCCACC 3`，反向序列5` GACCAAGCAACTAATGACGC 3`，进行PCR扩增，反应产物经溴化乙锭染色后观察，选择具有727bp谱带的含Stv bi的杂合或纯合体单株；4)将F2代中含有Stv bi基因的纯合体或杂合体并含有Wx mq基因纯合体的单株分别种成F3家系，通过条纹叶枯病抗性的表型鉴定，选择条纹叶枯病抗性不分离的家系即为同时含有Stv bi和Wx mq基因的纯合体，其条纹叶枯病抗性基因型为Stv biStv bi，暗胚乳突变基因型为Wx mqWx mq；5)在上述双基因纯合的家系内选择株高95～110cm、每株8～10穗、每穗140～160粒的优良单株加代稳定，F7代获得遗传性稳定、农艺性状一致的抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻新品系宁9108。FSA00000005863900011.tif
全文摘要
本发明涉及一种培育抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻品种的聚合育种方法，属水稻遗传改良与生物技术应用领域。武运粳7号与关东194杂交配组，利用分子标记进行辅助选择，结合田间观察获得条纹叶枯病抗性基因型为Stv-biStv-bi，暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq的双基因纯合体。后续世代经产量与农艺性状选择，至F7代选育出农艺性状稳定一致、抗条纹叶枯病的优良食味高产水稻新品系宁9108。该品系不仅产量高，而且高抗水稻条纹叶枯病，同时还具有暗胚乳特性，外观呈云雾状、乳白色，米饭晶莹剔透，质地柔软，口感润滑，富有弹性，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，食味品质极佳，在江苏粳稻适宜种植区具有广阔的应用前景。
文档编号A01H1/02GK101986829SQ20101010055
公开日2011年3月23日 申请日期2010年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者周丽慧, 姚姝, 张亚东, 朱镇, 林静, 王才林, 赵凌, 赵庆勇, 陈涛 申请人:江苏省农业科学院