专利名称：一种离体组织稳定保护剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种保护液，可用于储存和保护新鲜样本，尤其指临床手术后的组织 样本。其可以保护组织样本中的RNA在常温下不被降解，从而可以用于随后的实验室研究 或临床试验。
背景技术：
关于人类疾病的研究具有特殊性，因为研究人类自身与其他动物不同的是，对于 其他动物，我们可以根据自己的需要，构建动物模型，比如小鼠，通过环境诱导使其得病，然 后再用药物治疗，在各个实验过程中可以设置正常小鼠参照，最后处死小鼠，取出组织，以 供我们做分子水平、细胞水平以及活体水平的各种科研实践。然而这对于人类就不可能通 过这种手段进行科研实践。虽然人类与小鼠的基因组有着90%以上的相似性，但还是存在 很大的差异，并且由于人的社会活动性，所处的环境不同，也造成了人与人之间的差异。因此，我们要研究人类自身的疾变，最多的是依赖于已患疾病的病人组织、血液、 体液等样本，通过基因芯片诊断、细胞生物学分析、组织切片、蛋白分离纯化等生物学技术， 并结合病人的个人信息，包括社会活动和环境接触，来推算出该疾病患病的原因。这就非常 依赖于现有疾病样本的收集和研究。而对于组织样本的研究，一般是根据组织中的RNA来 研究基因表达差异；或者通过组织中的DNA来研究基因组差异，比如测序研究单核苷酸多 态性，基因突变等；或者通过组织中的蛋白差异来研究一些特异性的标记物，从而筛选并发 现一些能用于早期诊断的分子标记物。然而，RNA—旦组织离体后，就很容易降解；质量差的组织，对于后续的科研工作 的重要性就会大大降低，甚至毫无作用，或者起误导作用。由于环境中充满了各种RNA酶， 从新鲜组织中提取RNA时，样品若不能马上处理，则通常需要立即保存于液氮，而液氮和超 低温冰箱并不能普及到每个实验室或者医院，并且液氮和超低温冰箱的维护也需要较高的 费用。液氮虽然解决了保存问题，但仍然无法有效的解决样品的运输问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种离体组织稳定保护剂及其制备方法，本发明 的离体组织稳定保护剂能在常温下保护离体组织的RNA不被降解。为了解决上述技术问题，本发明提供一种离体组织稳定保护剂的制备方法，包括 以下步骤1)、配制 pH 为 7. 8 8. 2 的 Tris-EDTA ；2)、配制摩尔浓度为3. 8 4. 2mol/L的(NH4)2S04溶液；3)、在680 720ml步骤2)所得的(NH4) 2S04溶液中加入步骤1)所得的 Tris-EDTA 180 220ml，然后于搅拌状态下滴加0. 08 0. 12M的NaOH溶液，直至pH为 8. 1 8. 2 ；再用18. 2M欧姆的去离子水定容至IOOOml ；得离体组织稳定保护剂。作为本发明的离体组织稳定保护剂的制备方法的改进=TriS-EDTA和(NH4)2S04溶液中均以18. 2M欧姆的去离子水作为溶剂。本发明的离体组织稳定保护剂制备方法的最佳技术方案如下1)、配制 pH 为 8.0 的 Tris-EDTA;2)、配制摩尔浓度为4mol/L的(NH4) 2S04溶液；3)、在700ml步骤2)所得的(NH4) 2S04溶液中加入步骤1)所得的Tr i s_EDTA 200ml，然后于搅拌状态下滴加0. IM的NaOH溶液，直至pH为8. 15 ；再用18. 2M欧姆的去离 子水定容至IOOOml ；得离体组织稳定保护剂。上述pH为8. 0的Tris-EDTA的制备方法如下将0. 5 Imol 的 Tris 和 0. 002 0. Olmol 的 EDTA 溶解于 800ml 的 18. 2M 欧姆 的去离子水，利用0. IM的HCl溶液调节pH为8. 0 ；然后用18. 2M欧姆的去离子水定容至 IOOOml ；得 pH 为 8. 0 的 Tris-EDTA。在本发明中，NaOH溶液和HCl溶液均以18. 2M欧姆的去离子水作为溶剂。本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的离体组织稳定保护剂。本发明的离体组织稳定保护剂是一种液态的、无毒的组织保存试剂，能迅速稳定 离体组织，保护非冷冻状态下的离体组织的RNA不被降解。使用本发明的离体组织稳定保 护剂，能实现在任何时间、任何地点收集临床组织样品；且不需要在液氮中冷冻样品或立即 将样品送回实验室冰箱保存，大大提高了样本收集的可操作性，是临床及科研领域内完美 的样本保护剂。由于浸泡在本发明的离体组织稳定保护剂的离体组织能常温下较长时间保 存，因此还可以解决样本(离体组织)在不同地方的运输问题。本发明的离体组织稳定保护剂可在常温下保存，保存期为1 2周；如在_20°C的 低温下则可长时间保存。在保存期内如果出现沉淀物，属正常现象，只需将其置于60度水 浴 锅蒸煮至澄清即可。本发明实际使用时，可将临床样本切割成小于0. 5cm的小块，然后将临床样本浸 泡在本发明的离体组织稳定保护剂中，一般每0. 5g的临床样本对应5. Oml的离体组织稳定 保护剂；从而使本发明的保护剂能渗入到样本的细胞中，从而稳定RNA。随后该浸泡在本发 明的稳定保护剂中的样品可于室温(25°C )保存1-2周，4°C保存3-6个月，或者在-20°C下 长期保存。在实际进行RNA分离时，只需将组织从稳定保护剂中取出，按照常规采集后进行 的常规操作即可。在-20°C下被冰冻的样品可用研钵研磨，或者使其解冻后按照处理新鲜组 织的方式进行常规操作，而不影响RNA的质量。综上所述，本发明的离体组织稳定保护剂能够成功维持RNA的完整性，大大提高了 RNA相关科学研究的工作效率。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是经本发明保护剂处理和未经处理的样本中提取的总RNA的电泳图；图2是经本发明保护剂处理和未经处理的样本中提取的总RNA的峰图；上述图1中，从第1-12条道的样本分别对应为1—0小时；2—无保护剂室温下1小时，3—无保护剂室温下4小时，4—无保护剂室温下24小时，5-无保护剂室温下1周；6—无保护剂4°C下3个月； 7—本发明的保护剂中室温下1小时，8—本发明的保护剂中室温下4小时，9一本 发明的保护剂中室温下24小时，10-本发明的保护剂中室温下1周，11-本发明的保护剂 中4°C下3个月，12—标记条带(ladder)。上述图2中， Ohr-O小时；Ihr-RT-无保护剂室温下1小时，4hr_RT—无保护剂室温下4小时， 24hr-RT—无保护剂室温下24小时，Iweek-RT-无保护剂室温下1周；3m0nth-4C—无保 护剂4°C下3个月；lhr-RT-sto—本发明的保护剂中室温下1小时，4hr-RT-sto—本发明的保护剂中 室温下4小时，24hr-RT-sto—本发明的保护剂中室温下24小时，7day-RT-St0—本发明的 保护剂中室温下1周，3m0nth—st0 4C—本发明的保护剂中4°C下3个月，ladder—标记 条带。
具体实施例方式实施例1、一种离体组织稳定保护剂的制备方法，依次进行以下步骤1)、配制 pH 为 8.0 的 Tris-EDTA称取Imol的Tris和0. Olmol的EDTA，溶解于800ml的18. 2M欧姆的去离子水中， 用直径2cm的搅拌子在磁力搅拌器中300rpm搅拌，直至固体全部溶解，然后用移液枪缓慢 加入0. IM的HCl溶液，每加50ul左右的HCl溶液，就在25度的室温下，用pH计进行检测， 直至PH为8.0为止。再加18. 2M欧姆的去离子水，用容量瓶定容至1000ml。2)、配制(NH4) 2S04 溶液称取4mol的(MM)2SO4用18. 2M欧姆的去离子水定容至IL ；用直径2cm的搅拌子 在磁力搅拌器中300rpm搅拌，直至(NH4) 2S04全部溶解；得(NH4)2S04溶液。3)、配制稳定液在700ml的(MM)2SO4溶液中加入200ml pH为8. 0的Tris-EDTA，然后用移液枪 缓慢加入0. IM的NaOH溶液，每加一滴NaOH，搅拌均勻后，在25度的室温下，用pH计进行检 测，直至PH为8. 15为止。再加18. 2M欧姆的去离子水，用容量瓶定容至1000ml。得离体组 织稳定保护剂。实验1、一、获取临床样本，并设置实验组和对比组取balb/c小鼠，断颈处死，以手术剪剪开胸腔，切取肝脏组织，并分成11份，每份 切成0. 5cm3大小；得11份组织样品。立即进行以下操作以1. 5ml的离心管作为容器，将上述任意5份组织样品分别浸润在4度预冷的实 施例1所得的离体组织稳定保护剂中(每0. 5g的组织样品对应5. Oml的离体组织稳定保 护剂)；4份在室温中保存，1份在4°C保存；分别在第1小时、第4小时、第24小时和1周对 室温中保存的组织样品进行RNA的提取，在3个月对4°C保存的组织样品进行RNA的提取； 从而分别获得5个实验组。同理，以1. 5ml的离心管作为容器，直接将上述任意5份组织样品分别放入离心管 中；4份在室温中保存，1份在4°C保存；分别在第1小时、第4小时、第24小时和1周对室温中保存的组织样品进行RNA的提取，在3个月对4°C保存的组织样品进行RNA的提取；从 而分别获得5个对比组。将第11份样品当场实时进行RNA的提取(即对应0小时)，作为标准组；二、按照常规方法对RNA进行提取可利用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit货号74104，从而提取各个组织中的RNA。三、利用Agilent 2100Nano6000kit (步骤中所有kit均可从安捷伦公司购得，货 号1511-6012)，检测不同时间段提取的RNA。检测结果如图1显示下图显示6个时间段(0小时，1小时，4小时，24小时，1周， 3个月)，经本发明稳定保护剂保护和未经本发明稳定保护剂保护的样本中提取的总RNA的 电泳图。总RNA中的rRNA总RNA的90%以上，而完整的rRNA由1800bp的18S和4000bp 左右的28S构成，因此，完整的总RNA —般只有两条清晰的条带，而一旦RNA发生降解后，条 带就会发生弥散，并降解成多条带。图1和图2显示，未经本发明保护的样本的RNA，在4小时就开始出现较淡的弥散 条带，室温下24小时以及4度下3个月，28S基本降解完毕；而有本发明的稳定剂保护的 RNA,即使在室温下放置1周，或4度下放置3个月，条带依然清晰。以不同小鼠重复上述实验1，结论相同。以人体的胃部组织替代上述实验1的小鼠肝脏组织，其余类同实验1 ；结论是未 经本发明保护的样本的RNA室温下4小时即出现降解；而有本发明的稳定剂保护的样本 RNA，在室温下放置1周没有出现降解现象。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种离体组织稳定保护剂，其特征是包括以下步骤1)、配制pH为7.8～8.2的Tris-EDTA；2)、配制摩尔浓度为3.8～4.2mol/L的(NH4)2SO4溶液；3)、在680～720ml步骤2)所得的(NH4)2SO4溶液中加入步骤1)所得的Tris-EDTA180～220ml，然后于搅拌状态下滴加0.08～0.12M的NaOH溶液，直至pH为8.1～8.2；再用18.2M欧姆的去离子水定容至1000ml；得离体组织稳定保护剂。
2.根据权利要求1所述的离体组织稳定保护剂的制备方法，其特征是所述Tris-EDTA 和(NH4)2S04溶液中均以18. 2M欧姆的去离子水作为溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的离体组织稳定保护剂的制备方法，其特征是所述pH为 8. 0的Tris-EDTA的制备方法如下将0. 5 Imol的Tris和0. 002 0. Olmol的EDTA溶解于800ml的18. 2M欧姆的去离 子水，利用0. IM的HCl溶液调节pH为8. 0 ；然后用18. 2M欧姆的去离子水定容至IOOOml ； 得 PH 为 8. 0 的 Tris-EDTA。
4.如权利要求1 3中任意一种方法制备而得的离体组织稳定保护剂。
全文摘要
本发明公开了一种离体组织稳定保护剂，包括以下步骤1)配制pH为7.8～8.2的Tris-EDTA；2)配制摩尔浓度为3.8～4.2mol/L的(NH4)2SO4溶液；3)在680～720ml的(NH4)2SO4溶液中加入Tris-EDTA 180～220ml，然后于搅拌状态下滴加0.08～0.12M的NaOH溶液，直至pH为8.1～8.2；再用18.2M欧姆的去离子水定容至1000ml；得离体组织稳定保护剂。本发明的离体组织稳定保护剂能在常温下保护离体组织的RNA不被降解。
文档编号A01N1/02GK101816299SQ20101016141
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者吴箭, 姜超, 宓娅娜, 洪旭涛, 王珺, 陈莹莹 申请人:杭州锐创生物技术有限公司