壳聚糖在防治西兰花细菌性头腐病中的应用的制作方法

文档序号:350750阅读:240来源:国知局

专利名称::壳聚糖在防治西兰花细菌性头腐病中的应用的制作方法
技术领域
:本发明涉及植物保护技术的生物防治领域,尤其涉及壳聚糖在防治西兰花细菌性头腐病中的应用。
背景技术
:西兰花(BrassicaoleraceaL.var.italica)又称绿花菜、青菜花,其花球由肥嫩的主轴、多个肉质花梗和发育不全的花蕾组成,19世纪末由欧美传入,近年来在我国东部沿海地区大量种植。西兰花由于它极高的营养价值已经成为世界上一种重要的经济作物。然而,植物病原特别是细菌病原严重制约了西兰花的生产。国外研究已显示机遇性致病菌假单胞菌(Pseudomonasspp.)、边缘假单胞菌(Pseudomonasmarginalis)、荧光假光胞菌(Pseudomonasfluorescens)、胡萝卜软腐欧文氏菌古月萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorasubsp.carotovora)或古月萝卜软腐欧文氏菌马铃暮黑胚亚种(Pectobacteriumcarotovorasubsp.atroseptica)都能引起西兰花花球病害,这些细菌单独或复合侵染,造成作物的减产,损失一般在30%100%。国内李斌等(2009)首次发现荧光假单胞菌(P.fluorescens)在我国宁波地区引起西兰花细菌性头腐病,该病害自2005年起连续危害宁波市特别是宁海县种植的西兰花的生产,其病状表现为花球中出现褐色腐烂斑块,当地农民称之为“烂球病”,严重田块的病害发生率在65%81%。然而,到目前为止,还没有发现有效的化学制剂来防治西兰花细菌性头腐病,应用较广的铜制剂对该病害的效果也不好。因此发明新的有效的生化试剂来抵抗这种病害非常有必要。壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化处理后的产物,通常将脱乙酰度大于55%的甲壳素称作壳聚糖,其学名为聚氨基葡萄糖,化学名(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖,广泛存在于虾、蟹等动物外壳和藻类、真菌的细胞壁中。壳聚糖是一种抗菌谱较广的天然物质,对细菌、酵母菌和真菌等均有不同程度的抑制作用。壳聚糖具有良好的生物相溶性,可生物降解性以及无毒副作用,其分子内含有-OH和-ΝΗ2-活性基团,易与多种有机物发生反应,目前广泛应用在工业、农业、医药、化工、环境保护和水处理等领域。
发明内容本发明提供了一种壳聚糖在防治西兰花细菌性头腐病中的应用,解决了传统杀菌剂防效差、毒害副作用大的问题。壳聚糖在防治西兰花细菌性头腐中的应用,壳聚糖通过抑制细菌性头腐病的感染菌荧光假单胞菌(P.fluorescens)的生长,进而预防和治疗西兰花细菌性头腐病。其具体防治方法可以是将壳聚糖配置成溶液,在发病前或发病后的西兰花头部喷洒,喷洒浓度在0.050.lmg/ml,可以有效降低西兰花细菌性头腐病的病害发生率和病斑直径。本发明还提供了一种壳聚糖在制备防治西兰花细菌性头腐病药剂中的应用,该药剂以壳聚糖为主要成分,添加必要的药用附加剂制得。本发明又提供了一种防治西兰花细菌性头腐病的药剂,该药剂以壳聚糖为主要原料,水为溶剂,其制备过程是先将壳聚糖粉末溶解于体积百分比为1%的乙酸溶液中,然后加水配制成相应浓度的溶液,最后用NaOH调配成PH值为6.0左右,其中乙酸只是为了溶解壳聚糖,对量没有要求。上述壳聚糖脱乙酰度优选为大于75%,最好是大于85%,防效更好。采用上述壳聚糖溶液不仅在离体条件下能抑制荧光假单胞菌(P.fluorescens)的生长,而且在西兰花活体上能有效降低头腐病的发生率和病斑直径。当采用脱乙酰度为85%,浓度为0.lmg/ml的壳聚糖溶液在发病前或发病后的西兰花头部喷洒,分别可以降低发病率约80%和55%,分别减小病斑直径约95%和75%。图1为实施例2中不同浓度的壳聚糖溶液A对荧光假单胞菌(P.fluorescens)生长的影响;图2为实施例2中不同浓度的壳聚糖溶液B对荧光假单胞菌(P.fluorescens)生长的影响;图3为实施例4中不同浓度的壳聚糖溶液A预处理对西兰花病害发生率的影响;图4为实施例4中不同浓度的壳聚糖溶液A预处理对西兰花病害抑制率的影响;图5为实施例4中不同浓度的壳聚糖溶液A预处理对西兰花病斑直径的影响;图6为实施例4中不同浓度的壳聚糖溶液A预处理对西兰花病斑直径抑制率的影响;图7为实施例4中不同浓度的壳聚糖溶液B预处理对西兰花病害发生率的影响;图8为实施例4中不同浓度的壳聚糖溶液B预处理对西兰花病害抑制率的影响;图9为实施例4中不同浓度的壳聚糖溶液B预处理对西兰花病斑直径的影响;图10为实施例4中不同浓度的壳聚糖溶液B预处理对西兰花病斑直径抑制率的影响;图11为实施例5中不同浓度的壳聚糖溶液A后处理对西兰花病害发生率的影响;图12为实施例5中不同浓度的壳聚糖溶液A后处理对西兰花病害抑制率的影响;图13为实施例5中不同浓度的壳聚糖溶液A后处理对西兰花病斑直径的影响;图14为实施例5中不同浓度的壳聚糖溶液A后处理对西兰花病斑直径抑制率的影响;图15为实施例5中不同浓度的壳聚糖溶液B后处理对西兰花病害发生率的影响;图16为实施例5中不同浓度的壳聚糖溶液B后处理对西兰花病害抑制率的影响;图17为实施例5中不同浓度的壳聚糖溶液B后处理对西兰花病斑直径的影响;图18为实施例5中不同浓度的壳聚糖溶液B后处理对西兰花病斑直径抑制率的影响。具体实施例方式实施例1制备壳聚糖溶液将脱乙酰度为75%和85%的壳聚糖粉末分别溶解于体积百分比为的乙酸中,配制成浓度为5mg/ml的壳聚糖溶液A和壳聚糖溶液B,用NaOH调节pH至6.0,在室温下摇24小时,用高压灭菌锅121°C灭菌20分钟,待用。实施例2检测壳聚糖不同浓度时的抑菌活性本实施例的荧光假单胞菌(P.fluorescens)PFB-Ol由浙江大学生物技术研究所提供,该菌株为试验材料,其特异性对试验结果没有影响,下同。在实施例1制得的5mg/ml的壳聚糖溶液A或壳聚糖溶液B里加入无菌的去离子水配制成浓度为0.01,0.05和0.10mg/ml的壳聚糖溶液。在各浓度的壳聚糖溶液中接种相同体积的荧光假单胞菌(P.fluorescens)菌悬液(108CFU/ml),160r/min、28°C条件下振荡培养2小时,实验以pH为6.0的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照,最终采用计数法检测培养液中的菌体数。每个处理设两个重复。当选用壳聚糖溶液A时,检测结果如图1所示,壳聚糖溶液在不同浓度时对荧光假单胞菌(P.fluorescens)表现出显著的抑菌活性,而且随着浓度的增加抑菌活性逐渐增强。与对照相比,壳聚糖溶液在浓度0.01mg/ml时细胞数量下降了1.90(LogCFU/ml),在浓度0.05mg/ml时细胞数量下降了3.42(LogCFU/ml),但浓度0.lmg/ml时的细胞数量与0.05mg/ml的细胞数量没有显著差别。当选用壳聚糖溶液B时,检测结果如图2所示,与对照相比,壳聚糖溶液在浓度0.0lmg/ml时细胞数量下降了0.73(LogCFU/ml),在浓度0.lmg/ml时细胞数量下降了4.98(LogCFU/ml),因此壳聚糖溶液在0.lmg/ml时抑菌活性最高。实施例3检测壳聚糖在不同接种时间下的抑菌活性吸取实施例1制得的5mg/ml的壳聚糖溶液A或壳聚糖溶液B100μ1,加入4.9ml无菌去离子水配制成浓度为0.10mg/ml的壳聚糖溶液。在壳聚糖溶液中接种荧光假单胞菌(P.fluorescens)菌悬液(108CFU/ml),160r/min、28°C条件下振荡培养0,2,4,6,12,24小时后检测荧光假单胞菌(P.fluorescens)的生长情况。实验以pH为6.0的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照,每个处理设两个重复。当选用壳聚糖溶液A时,结果如表1显示,作为对照的无菌去离子水中接种荧光假单胞菌(P.fluorescens)2小时后细胞数量下降了0.20(LogCFU/ml),接下来菌量保持稳定。而处理组壳聚糖溶液中荧光假单胞菌(P.fluorescens)细胞数量显著下降,与对照相比,接种2小时后,壳聚糖溶液中的细胞数量减少了2.60(LogCFU/ml),在接种12小时后,壳聚糖溶液中的细胞数量减少了3.29(LogCFU/ml)(见表1)。表明壳聚糖溶液的抑菌活性在接种时间024小时内逐渐增强。表1壳聚糖溶液A不同接种时间对P.fluorescensPFB-01的抑菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>当选用壳聚糖溶液B时,结果如表2显示,作为对照的无菌去离子水中接种荧光假单胞菌(P.fIuorescens)2小时后细胞数量下降了0.20(LogCFU/ml),接下来菌量保持稳定。而处理组壳聚糖溶液中荧光假单胞菌(P.fluorescens)细胞数量显著下降。与对照相比,接种2小时后,壳聚糖溶液中的细胞数量减少了4.43(LogCFU/ml),在接种12小时后,壳聚糖溶液中的细胞数量减少了5.55(LogCFU/ml)(见表2)。表明壳聚糖溶液的抑菌活性在接种时间012小时内逐渐增强,在1224小时内反而降低。表2壳聚糖溶液B不同接种时间对P.fluorescensPFB-Ol的抑菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例4壳聚糖处理过的西兰花上接种荧光假单胞菌试验材料为未使用过杀菌剂和壳聚糖的西兰花。在实施例1制得的5mg/ml的壳聚糖溶液A或壳聚糖溶液B里加入无菌的去离子水配制成浓度为0.05和0.10mg/ml的壳聚糖溶液。在西兰花上用杀菌剂(100ug/ml的噻唑锌)和上述壳聚糖溶液做喷雾处理,对照实验用无菌水喷雾处理,待干。然后在西兰花株头部接种50μ1菌悬液(108CFU/ml),每株植株接种10个位点,每个处理设三株植株。将接种后的植株放置于温度28°C、相对湿度90%的人工气候箱中,光照条件下培养16小时,黑暗条件下培养8小时。一周后检测发病率和病斑大小。当选用壳聚糖溶液A时,结果如图3和图4所示,病原菌接种后的病发率达83.3%,用壳聚糖或者杀菌剂处理过的植株再接种荧光假单胞菌(P.fluorescens)病发率显著下降。0.10mg/ml和0.05mg/ml的壳聚糖溶液的处理效果都比杀菌剂略差,但没有显著差别。与0.05mg/ml的壳聚糖溶液相比,0.10mg/ml的壳聚糖溶液反而增加了病害发生率,降低了抑制率。如图5和图6所示,病原菌接种后病斑直径为6.1mm,用壳聚糖或者杀菌剂处理过的植株再接种荧光假单胞菌(P.fluorescens)病斑直径显著下降。0.10mg/ml和0.05mg/ml的壳聚糖溶液的处理效果都比杀菌剂略差,但没有显著差别。与0.05mg/ml的壳聚糖溶液相比,0.10mg/ml的壳聚糖溶液降低了病斑的大小和发生率。当选用壳聚糖溶液B时,结果如图7和图8所示,病原菌接种后的病发率达83.3%,用壳聚糖或者杀菌剂处理过的植株再接种荧光假单胞菌(P.fluorescens)病发率显著下降。其中,0.10mg/ml的壳聚糖溶液的处理效果比杀菌剂好,能有效降低西兰花的病害发生率,而0.05mg/ml的壳聚糖溶液和杀菌剂的处理效果没有显著差别。如图9和图10所示,病原菌接种后病斑直径为6.1mm,用壳聚糖或者杀菌剂处理过的植株再接种荧光假单胞菌(P.fluorescens)病斑直径显著下降。其中,0.10mg/ml的壳聚糖溶液能显著降低病斑大小,而0.05mg/ml的壳聚糖溶液和杀菌剂的处理效果没有显著差别。实施例5壳聚糖处理发病的西兰花在实施例1制得的5mg/ml的壳聚糖溶液A或壳聚糖溶液B里加入无菌的去离子水配制成浓度为0.05和0.10mg/ml的壳聚糖溶液。在健康的西兰花上接种50μ1菌悬液(108CFU/ml),待干。用杀菌剂(100ug/ml的噻唑锌)或上述壳聚糖溶液做喷雾处理,对照实验用无菌水喷雾处理。每个处理设三株植株。将接种后的植株放置于温度28°C、相对湿度90%的人工气候箱中,光照条件下培养16小时,黑暗条件下培养8小时。一周后检测发病率和病斑大小。当选用壳聚糖溶液A时,结果如图11和图12所示,病原菌接种后不做任何处理植株病发率达76.7%,用壳聚糖或者杀菌剂处理发病的植株病发率显著下降。0.05mg/ml和0.10mg/ml的壳聚糖溶液的处理效果都差于杀菌剂,且0.05mg/ml的壳聚糖溶液与杀菌剂有显著差别。0.10mg/ml壳聚糖溶液的处理效果比0.05mg/ml的壳聚糖溶液来的好。如图13和图14所示,病原菌接种后不做任何处理的病斑直径为5.4mm,用壳聚糖或者杀菌剂处理过的植株再接种病原菌病斑直径显著下降。0.05mg/ml和0.10mg/ml的壳聚糖溶液的处理效果都差于杀菌剂,且0.05mg/ml的壳聚糖溶液与杀菌剂有显著差别。0.10mg/ml壳聚糖溶液的处理效果比0.05mg/ml的壳聚糖溶液来的好。当选用壳聚糖溶液B时,结果如图15和图16所示,病原菌接种后不做任何处理植株病发率达76.7%,用壳聚糖或者杀菌剂处理发病的植株病发率显著下降。0.05mg/ml的壳聚糖溶液的处理效果略差于杀菌剂,而0.10mg/ml的壳聚糖溶液的处理效果略好于杀菌齐U,但都没有显著差别。如图17和图18所示,病原菌接种后不做任何处理的病斑直径为5.4mm,用壳聚糖或者杀菌剂处理过的植株再接种病原菌病斑直径显著下降。0.05mg/ml的壳聚糖溶液的处理效果略差于杀菌剂,而0.10mg/ml的壳聚糖溶液的处理效果略好于杀菌剂,但都没有显著差别。权利要求壳聚糖在防治西兰花细菌性头腐病中的应用。2.壳聚糖在制备防治西兰花细菌性头腐病药物中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于所述的壳聚糖的脱乙酰度大于75%。4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述的壳聚糖的脱乙酰度大于85%。全文摘要本发明公开了一种壳聚糖在防治西兰花细菌性头腐病中的应用,壳聚糖通过抑制细菌性头腐病的感染菌荧光假单胞菌(P.fluorescens)的生长,进而预防和治疗西兰花细菌性头腐病。当采用脱乙酰度为85%,浓度为0.1mg/ml的壳聚糖溶液在发病前或发病后的西兰花头部喷洒,分别可以降低发病率约80%和55%,分别减小病斑直径约95%和75%。文档编号A01N43/16GK101822249SQ201010162100公开日2010年9月8日申请日期2010年4月30日优先权日2010年4月30日发明者刘宝平,周青,唐乔梅,李斌,谢关林申请人:浙江大学
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