专利名称：一种建立巨桉四倍体植株的诱导及培育体系的方法
技术领域：
本发明属于林业生物技术育种领域或植物细胞工程领域，特别涉及提出了一种建 立巨桉无性系Eg5多倍体诱导及培育体系的方法。
背景技术：
巨桉(Eucalyptus grandis)是桉属双蒴盖亚属横脉组柳桉系中的高大乔木，原分 布于澳大利亚东海岸。它生长迅速，造林后10年内树高年生长量可达2-3m，干形通直，圆 满，可广泛用于造纸、建筑、人造板和薪炭林等用途。因此，它是速生丰产林的最常用的树种 之一，也是栽培面积最大的桉树种之一。巨桉现已广泛种植于我国南方的福建、四川、云南、 湘南、赣南和两广北部亚热带地区。巨桉Eg5 (良种编号闽S-SC-EG-005-2007)是福建永安林业集团选育的巨桉优良 无性系，已通过福建省林木品种审定委员会审定，由福建省林业厅予以公告，并受到良种保 护法规的保护。经过倍性育种育成的多倍体植物一般具有以下2个典型特征1)器官的“巨大 性”，如植物茎杆、叶片、花、果实、细胞、气孔等均较大，因此，可以提高作物产量；2)抗逆性 增强，如增强作物的抗病、抗旱、抗寒性，使作物适应性变广。因此，多倍体育种在农林业生 产中有非常积极的意义。桉树是一种外来物种，并且，根据胡洲鹤的研究结果，使用简单的秋水仙素处理后 染色体只在原有的22条的基础上增加了 3 5条，并没有实现加倍。使用谭德冠在刚果12 号桉上的诱导方法，用不同浓度的秋水仙素(其中添加了渗透剂二甲基亚砜)来诱导巨桉 芽的多倍体，只得到20% 30%的诱导率，诱导率过低。
发明内容
为了弥补现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种建立巨桉四倍 体植株的诱导及培育体系的方法；该方法使诱导率达到60%以上。并且，针对在秋水仙素 处理后茎段出现的玻璃化现象，设计了专用的培养基，能有效抑制玻璃化现象的出现，获得 了健壮的大田移栽生根苗。本发明的目的通过下述技术方案实现一种建立巨桉四倍体植株的诱导及培育体 系的方法。该方法包括以下操作步骤(1)将巨桉无菌组培苗带有腋芽或顶芽的茎段置于装有处理液的容器中，所述处 理液含有质量百分比浓度为0. 1 0. 5%的秋水仙素和质量百分比浓度为5 12%的助剂 SD ；将容器密闭后置于摇床上以80 120r/min的振荡速度，在35 40°C条件下加倍处理 12 18小时；处理完毕后，使用无菌水冲洗茎段，直至完全除去秋水仙素残留液，得到经过 加倍处理的茎段；(2)将经过加倍处理的茎段接种到专用增殖培养基中进行培养，每隔15 20天即 转接到新配制的增殖培养基中，转接3 5次后再进行生根培养；
所述增殖培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钙 (Ca(NO3)2 ·4Η20)537 576mg/L，硝酸钾(KNO3) 480 520mg/L，硫酸镁(MgSO4 ·7Η20)355 390mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4) 150 190mg/L，氯化钙(CaCl2 · 2H20) 77 116mg/L，硫酸锰 (MnSO4 · 4H20) 20. 2 24. 5mg/L,硫酸锌(ZnSO4 · 7Η20) 7. 7 11. 6mg/L,硼酸(H3BO3) 5. 4 7. 2mg/L，硫酸铜(CuSO4 ·5Η20)0· 018 0. 029mg/L，钼酸钠(Na2MOO4 ·2Η20)0· 19 0. 38mg/ L，硫酸亚铁(FeSO4 ·7Η20)25. 3 29. 4mg/L,乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA) 35. 3 38. 6mg/ L，根皮苷2 4mg/L，盐酸硫胺素(νΒ^Ο.ΟΘ〗 0. 112mg/L，盐酸吡哆辛(VB6)0.41 0. 58mg/L,烟酸(VB5) 0. 39 0. 61mg/L,甘氨酸 1. 5 2. 4mg/L,肌醇 91 112mg/L,核黄 素(VB2) 5. 0 7. Omg/L,激动素(KT) 0. 4 0. 6mg/L，萘乙酸(NAA) 0. 15 0. 25mg/L,琼脂 6100 6800mg/L和蔗糖30000 45000mg/L，余量为蒸馏水。所述步 骤(1)和步骤(2)是在无菌条件下进行操作。所述增殖培养基优选由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钙556mg/L，硝酸 钾500mg/L，硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，氯化钙96mg/L、硫酸锰22. 5mg/L、硫酸 锌 8. 6mg/L,硼酸 6. 2mg/L,硫酸铜 0. 025mg/L,钼酸钠 0. 25mg/L,硫酸亚铁 27. 3mg/L,乙二 胺四乙酸二钠37. 3mg/L，根皮苷2. 5mg/L，盐酸硫胺素0. lmg/L，盐酸吡哆辛0. 5mg/L，烟酸 0. 5mg/L，甘氨酸 2. Omg/L,肌醇 100mg/L，核黄素 6. 0mg/L,激动素 0. 5mg/L,萘乙酸 0. 2mg/L, 琼脂6800mg/L和蔗糖45000mg/L，余量为蒸馏水。步骤(1)所述茎段的长度为0. 7 1. 3cm。步骤(1)所述处理液的用量为每IOOmL处理液处理20 30枚茎段。步骤(2)所述生根培养采用的培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸 钾(KNO3) 614 654mg/L，硝酸铵(NH4NO3) 530 570mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4) 47 67mg/ L,硫酸镁(MgSO4 · 7H20) 113 133mg/L，氯化钙(CaCl2 · 2H20) 137 157mg/L，碘化钾 (KI) 0. 8 0. 9mg/L,硼酸(H3BO3) 5. 2 7. 2mg/L,硫酸锰(MnSO4 · 4H20) 20. 3 24. 5mg/ L,硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 7. 6 9. 4mg/L，钼酸钠(Na2MoO4 · 2H20) 0. 2 0. 3mg/L，硫酸铜 (CuSO4 ·5Η20)0· 02 0. 03mg/L，氯化钴(CoCl2 ·6Η20)0· 02 0. 03mg/L,乙二胺四乙酸二钠 (Na2 'EDTA) 34. 3 40. 3mg/L，硫酸亚铁(FeSO4 ·7Η20)25· 8 29. 8mg/L，肌醇 90 IlOmg/ L,甘氨酸1. 6 2. 6mg/L,盐酸硫胺素(VB1)O. 08 0. 12mg/L,盐酸吡哆醇(VB6)O. 4 0. 6mg/L,烟酸(VB5) 0. 4 0. 6mg/L,吲哚丁酸(IBA) 0. 42 0. 62mg/L, ABT 生根粉 0. 39 0. 69mg/L，蔗糖25000 40000mg/L和琼脂6100 6800mg/L，余量为蒸馏水。步骤(1)所述巨桉为审定品种Eg5无性系。本发明以巨桉无性系组培苗的腋芽和顶芽为处理材料，用秋水仙素处理，进行染 色体加倍；然后将处理后的腋芽及顶芽着生的茎段置入特制专用培养基中，使其健康的生 长发育，生根后转入大田移栽，炼苗后即可出圃造林。在巨桉使用秋水仙素的诱导过程中，如果想获得较高的诱导率，就需要提高秋水 仙素的浓度或延长秋水仙素溶液的浸泡时间；但是，这样做会导致待处理的嫩芽死亡，而嫩 芽的死亡又会导致诱导率的降低；并且，单一使用秋水仙素溶液会导致在诱导处理后有较 多嵌合体的出现。所以，需要在处理时加入渗透剂。在渗透剂和秋水仙素溶液混用的情况 下，可以使用较低的秋水仙素溶液或缩短处理时间，从而降低死亡率，同时，这也有效地减 少了嵌合体的出现。但是，现有的二甲基亚砜、二甲基乙酰胺或氮酮等渗透剂，作用效果不理想，在诱导率上并没有显著的提高。结合国内外最新研究成果，本发明创新性的把原来用作除草剂助剂的SD助剂(其 有效成分是一种三萜甙类化合物)作为渗透剂，达到了满意的效果。与使用二甲基亚砜相 比，使用助剂SD，诱导率可以从35%显著地提升到60% ；而使用二甲基亚砜时，达到最高 诱导率时的秋水仙素溶液浓度为0. 25%，但如果使用SD，达到最高诱导率时使用的秋水仙 素溶液的浓度仅为0. 15% ；不管是在小规模实验过程中，还是为了满足大规模工厂化生产 需要而实施的诱导过程，往往需要大量芽的诱导，这就需要使用较多的秋水仙素，但秋水仙 素价格昂贵一般为350 400元/克。因此，为了达到最大诱导率，秋水仙素使用浓度从 0. 25%降到0. 15%，且明显地节省了生产成本。与现已公开报道的秋水仙素四倍体诱导方法相比，本发明方法还有以下创新处 理时的温度不采用常温，而是35 40°C的高温。因为巨桉细胞的有丝分裂与温度关系较为 密切，在一定温度范围内，温度越高，细胞的有丝分裂越旺盛，处于分裂前期的细胞会增多， 而秋水仙素只对处于分裂前期的细胞起作用，产生加倍效果。所以，温度升高会使诱导率提 高。另外，温度适度升高，也会导致细胞膜和外界的物质交换活跃，细胞膜透性有一定程度 的增大，促使秋水仙素溶液更容易到达待处理部位，增强诱导效果。但温度过高，会造成高 温胁迫效应，导致植物生理活动出现紊乱，酶失活，甚至蛋白质变性等不良后果，有可能致 使待诱导的茎段死亡，从而导致了诱导率的降低。因为秋水仙素处理对植物而言是一种逆境，所以，即使是加倍成功的诱导芽，往往 也呈现出生长势弱、畸形、玻璃化、不易成活等现象，导致加倍成功的诱导芽不能够正常的 生长和发育，不能够生存下来。使用巨桉Eg5加倍前可以正常生长发育的培养基无法实现 加倍处理后幼苗的扶壮，所以，需要研制专门培养基用于扶壮处理后的植株。本发明专用培 养基具有如下优点⑴加入了 2 4mg/L的根皮苷；(2)不含有NH4+离子，培养基中的氮含 量低；(3)细胞分裂素使用激动素而不是6-苄基腺嘌呤；(4)蔗糖浓度提高到45000mg/L ； (5)不是在Ms或其它培养基基础上的简单的物质用量的改变，而是对Ms培养基中所使用的 化学试剂进行了变换。使用其它培养基，无法将苗的玻璃化率(玻璃化的苗/苗总数)降 低到50%以下，而采用本发明使用的专用培养基，则可将诱导苗的玻璃化率降低到了 5% 以下；并且，对诱导苗也有明显的扶壮效果，使弱苗数量从30%降低到5%以下。本发明与现有技术相比具有如下的优势(1)本发明创新性的将一种除草剂助剂SD用到了秋水仙素的诱导过程中，可以使 用较低的秋水仙素浓度达到最大诱导率，节省用量；另外，使用SD替代了氮酮、二甲基亚砜 等传统渗透剂，诱导率达到60 65%。(2)本发明的技术方案构成了一个诱导和组培快繁合为一体的技术体系，使具有 生长速度显著加快的多倍体苗不仅能够产生，而且能够培育成活，形成一棵健壮的小苗，用 于林业生产。(3)在加倍处理时，使用的茎段长度为0. 7 1. 3cm，然后，经过3 5次转接，进 行了生根培养和大田移栽后，已经长成20 30cm高的植株，取其新生的幼嫩根尖和顶端的 茎生长点，检测其染色体数均为4x，非嵌合体和二倍体——此时，进行诱导率的统计，所以， 本发明方法的染色体加倍效果好、且稳定可靠。
图1为茎尖染色体计数的显微镜观察图，其中a为未经诱导处理的植株，b为经本 发明诱导处理的植株。图2 为根尖染色体计数的显微镜观察图，其中a为未经诱导处理的植株，b为经本 发明诱导处理的植株。
具体实施例方式下面结合具体的实例与附图对本发明作进一步详细的叙述，但本发明的实施方法 灵活，不仅仅限于此例所述的具体操作方式。实施例1(1)将20枚巨桉Eg5无菌组培苗的带有腋芽或顶芽的茎段(茎段长度为0. 7 1. 3cm)置于装有IOOmL处理液的容器中，所述处理液含有质量百分比浓度为0. 的秋水 仙素和质量百分比浓度为5%的助剂SD (南通飞天化学实验有限公司生产)；将容器密闭后 置于摇床上以lOOr/min的振荡速度，在40°C条件下加倍处理12小时；处理完毕后，使用无 菌水冲洗茎段，直至完全除去秋水仙素残留液，得到经过加倍处理的茎段；(2)将经过加倍处理的茎段接种到增殖培养基中进行培养，每隔18天即转接到新 配制的增殖培养基中，转接3次后再进行生根培养；所述增殖培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钙556mg/L，硝酸钾 500mg/L,硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，氯化钙96mg/L、硫酸锰22. 5mg/L、硫酸锌 8. 6mg/L，硼酸 6. 2mg/L,硫酸铜 0. 025mg/L,钼酸钠 0. 25mg/L,硫酸亚铁 27. 3mg/L,乙二胺 四乙酸二钠37. 3mg/L,根皮苷2. 5mg/L,盐酸硫胺素0. lmg/L,盐酸吡哆辛0. 5mg/L,烟酸 0. 5mg/L，甘氨酸 2. Omg/L，肌醇 100mg/L，核黄素 6. Omg/L，激动素 0. 5mg/L，萘乙酸 0. 2mg/L, 琼脂6800mg/L和蔗糖45000mg/L，余量为蒸馏水。所述生根培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钾634mg/L，硝酸铵 550mg/L,磷酸二氢钾57mg/L，硫酸镁123mg/L，氯化钙147mg/L，碘化钾0. 83mg/L,硼酸 6. 2mg/L，硫酸锰22. 3mg/L,硫酸锌8. 6mg/L,钼酸钠0. 25mg/L,硫酸铜0. 025mg/L,氯化钴
0.025mg/L,乙二胺四乙酸二钠37. 3mg/L，硫酸亚铁27. 8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/ L,盐酸硫胺素0. lmg/L,盐酸吡哆醇0. 5mg/L,烟酸0. 5mg/L,吲哚丁酸0. 5mg/L，ABT生根粉 (北京艾比蒂研究开发中心生产)0. 5mg/L，蔗糖30000mg/L和琼脂6500mg/L，余量为蒸馏 水；以上操作均是在无菌条件下进行的，以防止待处理组培苗的污染。实施例2(1)将30枚巨桉Eg5无菌组培苗的带有腋芽或顶芽的茎段(茎段长度为0. 7
1.3cm)置于装有IOOmL处理液的容器中，所述处理液含有质量百分比浓度为0. 3%的秋水 仙素和质量百分比浓度为8%的助剂SD (南通飞天化学实验有限公司生产)；将容器密闭后 置于摇床上以80r/min的振荡速度，在35°C条件下加倍处理18小时；处理完毕后，使用无 菌水冲洗茎段，直至完全除去秋水仙素残留液，得到经过加倍处理的茎段；(2)将经过加倍处理的茎段接种到增殖培养基中进行培养，每隔20天即转接到新 配制的增殖培养基中，转接4次后再进行生根培养；
所述增殖培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钙537mg/L，硝酸钾 480mg/L,硫酸镁355mg/L，磷酸二氢钾150mg/L，氯化钙77mg/L，硫酸锰20. 2mg/L,硫酸锌 7. 7mg/L，硼酸 5. 4mg/L,硫酸铜 0. 018mg/L,钼酸钠 0. 19mg/L,硫酸亚铁 25. 3mg/L,乙二胺 四乙酸二钠35. 3mg/L,根皮苷2mg/L，盐酸硫胺素0. 092mg/L,盐酸吡哆辛0. 41mg/L,烟酸 0. 39mg/L，甘氨酸 1. 5mg/L，肌醇 91mg/L，核黄素 5. Omg/L，激动素 0. 4mg/L，萘乙酸 0. 15mg/ L，琼脂6100mg/L和蔗糖30000mg/L，余量为蒸馏水；所述生根培养采用的生根培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钾 614mg/L,硝酸铵530mg/L，磷酸二氢钾47mg/L，硫酸镁113mg/L，氯化钙137mg/L，碘化钾
0.8mg/L，硼酸 5. 2mg/L,硫酸锰 20. 3mg/L,硫酸锌 7. 6mg/L,钼酸钠 0. 2mg/L,硫酸铜 0. 02mg/ L，氯化钴0. 02mg/L,乙二胺四乙酸二钠34. 3mg/L，硫酸亚铁25. 8mg/L，肌醇90mg/L，甘氨酸
1.6mg/L，盐酸硫胺素0. 08mg/L,盐酸吡哆醇0. 4mg/L,烟酸0. 4mg/L,吲哚丁酸0. 42mg/L, ABT生根粉(北京艾比蒂研究开发中心生产)0. 39mg/L，蔗糖25000mg/L和琼脂6100mg/L， 余量为蒸馏水；以上操作均是在无菌条件下进行的，以防止待处理组培苗的污染。实施例3(1)将25枚巨桉Eg5无菌组培苗的带有腋芽或顶芽的茎段(茎段长度为0. 7
I.3cm)置于装有IOOmL处理液的容器中，所述处理液含有质量百分比浓度为0. 5%的秋水 仙素和质量百分比浓度为12%的助剂SD(南通飞天化学实验有限公司生产)；将容器密闭 后置于摇床上以120r/min的振荡速度，在38°C条件下加倍处理15小时；处理完毕后，使用 无菌水冲洗茎段，直至完全除去秋水仙素残留液，得到经过加倍处理的茎段；(2)将经过加倍处理的茎段接种到增殖培养基中进行培养，每隔15天即转接到新 配制的增殖培养基中，转接5次后再进行生根培养；所述增殖培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钙576mg/L，硝酸钾 520mg/L，硫酸镁390mg/L，磷酸二氢钾190mg/L，氯化钙116mg/L，硫酸锰24. 5mg/L，硫酸锌
II.6mg/L,硼酸 7. 2mg/L,硫酸铜 0. 029mg/L,钼酸钠 0. 38mg/L,硫酸亚铁 29. 4mg/L,乙二胺 四乙酸二钠38. 6mg/L,根皮苷4mg/L，盐酸硫胺素0. 112mg/L,盐酸吡哆辛0. 58mg/L,烟酸 0. 61mg/L,甘氨酸 2. 4mg/L,肌醇 112mg/L，核黄素 7. Omg/L,激动素 0. 6mg/L，萘乙酸 0. 25mg/ L，琼脂6800mg/L和蔗糖45000mg/L，余量为蒸馏水；所述生根培养采用的生根培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钾 654mg/L,硝酸铵570mg/L，磷酸二氢钾67mg/L，硫酸镁133mg/L，氯化钙157mg/L，碘化钾 0. 9mg/L，硼酸 7. 2mg/L,硫酸锰 24. 5mg/L,硫酸锌 9. 4mg/L,钼酸钠 0. 3mg/L,硫酸铜 0. 03mg/ L，氯化钴0. 03mg/L,乙二胺四乙酸二钠40. 3mg/L，硫酸亚铁29. 8mg/L，肌醇110mg/L，甘氨 酸2. 6mg/L，盐酸硫胺素0. 12mg/L，盐酸吡哆醇0. 6mg/L，烟酸0. 6mg/L，吲哚丁酸0. 62mg/L, ABT生根粉(北京艾比蒂研究开发中心生产)0. 69mg/L，蔗糖40000mg/L和琼脂6800mg/L， 余量为蒸馏水；以上操作均是在无菌条件下进行的，以防止待处理组培苗的污染。实施例4将实施例1所得的生根培养后的巨桉苗进行大田移栽，长成20 30cm高的植株 后，观察形态发生变异(这种形态上的变异有与未经诱导的植株相比，叶面积变大15% 40%，叶色深绿，叶片变厚5% 10%;茎变粗7% 14%，节间缩短10% 22% )的植株， 取其新生的幼嫩根尖和顶端的茎尖进行以下处理和显微观察茎尖染色体压片及计数法于上午9:00取下幼嫩茎顶端的生长点，并立即置于 18°c，0. 002mol/L的8-羟基喹啉溶液中预处理3小时，使用蒸馏水清洗3遍，再用乙醇冰 醋酸=3 1体积比的卡诺氏固定液在4°C条件下固定10h，取出后用蒸馏水清洗3遍，置 于lmol/L的盐酸溶液中在60°C条件下解离12分钟，使用蒸馏水清洗5 6遍，使用卡宝品 红染色15分钟后压片，使用光学显微透镜观察染色体数，结果如图1所示，a为未经诱导处 理的2倍体植株的茎尖染色体计数的显微镜观察图，b为经本发明诱导处理的植株的茎尖 染色体计数的显微镜观察图，可观察到染色体增倍，即为4倍体。根尖染色体压片及计数法在 中午12:00取待测植株的根尖最前端的分生区部分 使用0. 2%的秋水仙素预处理2小时，然后，使用Camoy固定液固定15-18小时，置于lmol/ L的稀盐酸溶液中在60°C恒温水浴中酸化6分钟，然后，置于载玻片上，滴加改良石碳酸品 红染液染色30分钟后，盖上盖玻片，使用橡皮擦轻敲盖片，然后，使用光学透视显微镜放大 1000倍观察染色体数目，结果如图2所示，a为未经诱导处理的2倍体植株的根尖染色体 计数的显微镜观察图，b为经本发明诱导处理的植株的根尖染色体计数的显微镜观察图，可 观察到染色体增倍，即为4倍体。上文中所述的改良石碳酸品红溶液的制备方法为1)配 制原液A 取3g碱性品红溶于IOOmL体积分数70%的酒精中，可长期保存；2)配制原液B : 取IOmL原液A加入90mL体积分数为5%的石炭酸水溶液；3)配制染色液取45mL原液B 加入6mL冰醋酸和6mL体积分数37%的甲醛；4)配制改良石炭酸品红溶液取上述染色液 2 101^，加入90 98mL的体积分数45%的醋酸和1. 8g山梨醇；5)所得改良石碳酸品红 溶液染液放置2周后使用。实施例5使用流式细胞仪确认染色体加倍操作步骤分为3步(1)细胞核悬液制备称取100 500mg实施例1所得的生根培养后的巨桉苗的嫩 茎及幼叶，在滴有2ml提取缓冲液的培养皿中研碎，260目尼龙网筛过滤，lOOOr/min条件下 离心及漂洗3次，收集沉积细胞，以备染色。上述提取缓冲液成分15mmol/L Tris-HCl (pH 值为 7. 5)，80mmol/L KCl,20mmol/L NaCl，0. 20mol/L EDTA-Na2,15mmol/L 的巯基乙醇和 0. 05% 的 TritonX-100。(2)染色体的特异性染色制备的核悬液离心后弃去上层清液，加入2mL染色缓 冲液，黑暗常温条件下染色30min。500目尼龙网筛过滤，滤液用流式细胞仪专用的标准试 管收集后，随即上机测定。上述染色缓冲液成分提取缓冲液+3000U/mLRNA酶A+lOug/mL PI (溴化乙锭)。(3)使用美国 BECT0N-DICKINS0N 公司，型号为 Racs vantageSE DIVA 的流式细胞 仪进行倍性测定。使用二倍体巨桉无性系Eg5的DNA含量为对照。该流式细胞仪的激发光 源可激发经荧光染色的染色体DNA分子发出荧光，然后，测定装置检测激发出的荧光强度， 与测定装置相连的计算机分析软件可对荧光强度进行分析，得出荧光强度和植株DNA相对 含量间的对应关系。经检测发现，待测四倍体植株中细胞的DNA相对含量为对照植株DNA相对含量的 2倍。由此可以确认待测的巨桉苗为四倍体植株。
上述实施例 为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种建立巨桉四倍体植株的诱导及培育体系的方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)将巨桉无菌组培苗带有腋芽或顶芽的茎段置于装有处理液的容器中，所述处理液含有质量百分比浓度为0.1～0.5％的秋水仙素和质量百分比浓度为5～12％的助剂SD；将容器密闭后置于摇床上以80～120r/min的振荡速度，在35～40℃条件下加倍处理12～18小时；处理完毕后，使用无菌水冲洗茎段，直至完全除去秋水仙素残留液，得到经过加倍处理的茎段；(2)将经过加倍处理的茎段接种到增殖培养基中进行培养，每隔15～20天即转接到新配制的增殖培养基中，转接3～5次后再进行生根培养；所述增殖培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钙537～576mg/L，硝酸钾480～520mg/L，硫酸镁355～390mg/L，磷酸二氢钾150～190mg/L，氯化钙77～116mg/L，硫酸锰20.2～24.5mg/L，硫酸锌7.7～11.6mg/L，硼酸5.4～7.2mg/L，硫酸铜0.018～0.029mg/L，钼酸钠0.19～0.38mg/L，硫酸亚铁25.3～29.4mg/L，乙二胺四乙酸二钠35.3～38.6mg/L，根皮苷2～4mg/L，盐酸硫胺素0.092～0.112mg/L，盐酸吡哆辛0.41～0.58mg/L，烟酸0.39～0.61mg/L，甘氨酸1.5～2.4mg/L，肌醇91～112mg/L，核黄素5.0～7.0mg/L，激动素0.4～0.6mg/L，萘乙酸0.15～0.25mg/L，琼脂6100～6800mg/L和蔗糖30000～45000mg/L，余量为蒸馏水；所述步骤(1)和步骤(2)是在无菌条件下进行操作。
2.根据权利要求1所述的一种建立巨桉四倍体植株的诱导及培育体系的方法，其特征 在于步骤(1)所述茎段的长度为0. 7 1. 3cm。
3.根据权利要求1所述的一种建立巨桉四倍体植株的诱导及培育体系的方法，其特征 在于步骤(1)所述处理液的用量为每IOOmL处理液处理20 30枚茎段。
4.根据权利要求3所述的一种建立巨桉四倍体植株的诱导及培育体系的方法，其特征 在于所述增殖培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钙556mg/L，硝酸钾500mg/ L，硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，氯化钙96mg/L、硫酸锰22. 5mg/L、硫酸锌8. 6mg/L, 硼酸6. 2mg/L,硫酸铜0. 025mg/L,钼酸钠0. 25mg/L,硫酸亚铁27. 3mg/L,乙二胺四乙酸二钠 37. 3mg/L,根皮苷2. 5mg/L,盐酸硫胺素0. 1 Omg/L,盐酸吡哆辛0. 5mg/L,烟酸0. 5mg/L,甘氨 酸 2. Omg/L,肌醇 100mg/L，核黄素 6. 0mg/L,激动素 0. 5mg/L，萘乙酸 0. 2mg/L,琼脂 6800mg/ L和蔗糖45000mg/L，余量为蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的一种建立巨桉四倍体植株的诱导及培育体系的方法，其特 征在于步骤(2)所述生根培养采用的培养基由以下按质量体积比计的组分组成硝酸钾 614 654mg/L，硝酸铵530 570mg/L，磷酸二氢钾47 67mg/L，硫酸镁113 133mg/ L,氯化钙137 157mg/L，碘化钾0. 8 0. 9mg/L,硼酸5. 2 7. 2mg/L,硫酸锰20. 3 24. 5mg/L,硫酸锌 7. 6 9. 4mg/L,钼酸钠 0. 2 0. 3mg/L,硫酸铜 0. 02 0. 03mg/L,氯化 钴0. 02 0. 03mg/L,乙二胺四乙酸二钠34. 3 40. 3mg/L，硫酸亚铁25. 8 29. 8mg/L，肌 醇90 110mg/L,甘氨酸1. 6 2. 6mg/L,盐酸硫胺素0. 08 0. 12mg/L,盐酸吡哆醇0. 4 0. 6mg/L,烟酸 0. 4 0. 6mg/L,吲哚丁酸 0. 42 0. 62mg/L, ABT 生根粉 0. 39 0. 69mg/L, 蔗糖25000 40000mg/L和琼脂6100 6800mg/L，余量为蒸馏水。
6.根据权利要求1所述的一种建立巨桉四倍体植株的诱导及培育体系的方法，其特征 在于步骤(1)所述巨桉为审定品种Eg5无性系。
全文摘要
本发明公开了一种建立巨桉四倍体植株的诱导及培育体系的方法。该方法的步骤包括(1)将巨桉无菌组培苗的带有腋芽或顶芽的茎段置于装有处理液的容器中，所述处理液中含有秋水仙素和助剂SD；将容器密闭后置于摇床上振荡，在35～40℃条件下加倍处理12～18小时；然后使用无菌水冲洗茎段，除去秋水仙素残留液，得到经过加倍处理的茎段；(2)将经过加倍处理的茎段接种到增殖培养基中进行培养，每隔15～20天即转接到新配制的增殖培养基中，转接3～5次后再进行生根培养。本发明创新之处是将助剂SD用到诱导过程，既可使用较低的秋水仙素浓度，节省用量，降低成本，又能显著提高诱导率，由现有的20％～30％提高到60～65％。
文档编号A01H1/08GK101869052SQ20101017135
公开日2010年10月27日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者徐建民, 李光友, 杜志鹄, 陆钊华, 陈儒香, 韩超 申请人:中国林业科学研究院热带林业研究所