专利名称：油菜饼抗菌肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于生产饲料和食品防腐剂的油菜饼抗菌肽。
背景技术：
在饲料中添加防腐剂、防霉剂等是延长饲料保质期的有效措施之一，但这些饲料 保存剂都是化学药剂，存在残留问题，产生毒副作用，会间接影响到人体健康。抗生素作为 抗菌助长剂添加到饲料中由来已久。它能够减少动物的发病率；抑制肠道中有害微生物， 提高动物对养分的吸收率具有明显的经济效益。但是，抗生素在动物体内和动物产品中的 残留，以及病原菌产生的抗药性问题，对人类的健康和环境产生了负面的影响。随着抗生素 的大量、广泛地用于饲料中和人们对食品质量的要求越来越高，人们对其使用的副作用认 识日益加深，抗生素在饲料业已面临着淘汰或禁用的局面。而化学防腐剂、防霉剂以及抗生 素随着饲料到达胃肠道，会影响体内正常的微生物菌群，破坏其间的平衡，造成消化功能紊 乱，进而引起慢性腹泻等消化道疾病，寻找新型、安全的抗菌剂代替抗生素，已成为当前国 内外饲料学科的一项重要内容。抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)因具有广谱的抗细菌活性，高效的抗 真菌、病毒和原虫的活性；热稳定性好；抗菌机理独特，不易产生抗药性等特性，正引起 人们的关注，有望成为替代抗生素的产品之一。研究发现抗菌肽广泛存在于原核生物、 植物及动物体内，并在生物的天然防御系统中起着重要的作用。抗菌肽包括抗细菌多肽 (antibacterial peptides)禾口抗真菌多月太(antifungal peptides)。目前，不少研究者对抗菌肽做了一些相关的研究。实验研究发现，鲎素对多种饲料 中的有害微生物包括致病性和相对致病性饲料细菌、饲料霉菌等均有高效的杀菌作用，有 望成为一种新型高效、环保的绿色饲料添加剂应用于饲料的保鲜防腐。马卫明等发现猪小 肠抗菌肽对鸡、猪大肠杆菌株、鸡白痢沙门氏菌株、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、鱼致病 性嗜水气单胞菌等11株细菌均有不同程度的抑制作用。温刘发等人通过在畜禽鱼的饲料 中添加抗菌蛋白或抗菌肽，发现无论是在日生长速度、相对增重率、饲料系数、成活率，还是 抗病力方面均有显著提高。此外，国外有报道称，抗菌肽对饲料防霉也有一定的效果。国内的抗菌肽研究主要集中在动物和微生物源抗菌肽的理化性质，作用机制以及 基因工程应用方面，对植物源抗菌肽的研究相对较少。四川大学资源微生物学及微生物生 物技术四川省重点实验室长期都在对植物源抗菌蛋白和肽进行筛选，通过筛选证实很多植 物都含有抗菌蛋白和肽类物质。特别是我国大面积种植的甘蓝型油菜，是油菜生产大国，而 榨油之后的副产品油菜饼也产量巨大，为抗菌肽的获取提供了丰富的资源。本发明提供了油菜饼抗菌肽的分离纯化方法和稳定性测试方法、动物急性毒性试 验方法以及提供一种防止饲料中霉菌的应用方法。
发明内容
本发明涉及来源于油菜饼(Rape-seed meal)的抗菌肽，对饲料中引起霉变的某些真菌有较好的抑制效果。饲料因微生物尤其是霉菌污染而造成饲料品质下降，甚至影响动物的健康，给饲 料生产企业和畜牧生产者带来巨大的经济损失。饲料霉变是各种霉菌在适宜的温度、湿度 和营养环境下迅速生长而造成的，其结果是使饲料发热、结块、有霉味，甚至改变饲料颜色 并产生霉菌毒素。受霉菌感染的饲料，由于霉菌生长消耗饲料中的营养物质，以及在霉菌所 含酶的作用下使饲料的组成成分发生改变或分解，致使饲料的营养价值严重降低。此外，动 物食用被霉菌污染的饲料后，霉菌毒素会残留在动物体及其代谢产物中，因而可能会造成 动物性食品污染，再通过食物链对人体健康产生极大的危害。因此，采用高效低毒的防霉剂 对饲料中霉菌及其毒素进行预防处理，对于保证饲料质量，保护人与动物的生命安全具有 十分重要的意义。近年来研究发现，抗菌肽不仅具有广谱高效杀菌活性，还具有稳定性好、水溶性 好、抗菌机理独特、对高等动物正常细胞无害等特点。抗菌蛋白(肽)在农业包括饲料生产 中的研究也逐渐深入，但研究多集中于在饲料中添加抗菌肽以预防动物疾病，从而成为传 统抗生素的代替物等方面，但是将其开发成为饲料防霉剂方面的研究却很少。本发明的目的是提供一种新的抗菌肽，可用于饲料甚至食品的腐败真菌的防治。 从油菜饼的水溶性物质中分离到具有抗真菌活性的小肽。该活性肽热稳定性强，在PH7 8 的时候抑菌效果最为明显。动物急性毒性试验结果表明，提取的抗菌肽为无毒物质。通过 与几种防腐剂对饲料中霉菌抑制作用的比较发现，油菜饼粕抗菌肽提取物的防霉性能优于 恩拉鼎(Enradin)、富马酸，仅次于复合型防霉剂霉必克，可以开发成为一种高效的植物源 性饲料防腐剂。本发明的另一个目的是提供一套油菜饼抗菌肽的分离纯化方法。本发明的抗菌肽 可用诸如盐析、分子筛以及多维色谱技术等进行分离。考虑到成本问题，可以以抗菌肽初提 物的形式加以应用。本发明的再一个目的是提供一种油菜饼抗菌肽在饲料防霉中的应用方法，包括用 量和条件等。步骤为1)培养基制备PDA培养基(土豆马铃薯培养基)马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水1000mL, pH自然;121°C 灭菌 30min。2)抗真菌活性检测方法①孢子悬液的制备取长满真菌菌落(已形成分生孢子)的PDA平板，加入适量无菌水，玻璃棒轻轻搅 动洗脱孢子。然后将该洗脱液过滤，除去菌丝，加适量无菌水配制制成3 5X 104个孢子/ mL左有的孢子悬液，置4°C条件下保存。供试菌株为柑橘绿霉和黑曲霉。②打孔法制作PDA平板，吸取100 U L供试菌种的孢子悬液，无菌操作，均勻涂布到平板上， 晾干。用6mm直径的打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加样品或无菌水至平满，正面放 置，28°C培养箱培养5d。测量抑菌圈直径。3)油菜饼抗菌肽的分离纯化
①油菜蛋白粗提液的制备称取一定量油菜饼磨碎，加200mL0. 05mol/L的pH8. 0的Tris-HCl缓冲液，4°C放 置12h后，4°C，4000r/min离心30min取上清液。②硫酸铵沉淀粗蛋白上清液用饱和度为60士5%的硫酸铵沉淀，4°C放置过夜，4°C，14，000r/min离心 20min，取沉淀，用lmL 0. 05mol/L的pH8. 0的Tris-HCl缓冲液溶解。③脱盐将粗提液放入透析袋中，透析液选用0. 05mol/L的pH 8. 0的Tris-HCl缓冲液，每 隔2小时换一次透析液。④分子筛柱层析Sephadex G-100，取提取液上样，用 0. 05mol/L 的 pH8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液洗脱， 流速0. 15mL/min,每3min收集1管，逐管收集，以洗脱液为对照测定每管的0D28(I值。并测 试每管洗脱液的抑菌活性。⑤高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)纯化对具 有抑菌效果的收集液进一步纯化。检测各峰抑菌活性，收集抗菌活性部分。⑥分离液浓缩将具有抗菌活性的分离液冷冻干燥，粉末用适当体积的0. 05mol/L的pH8. 0的 Tris-HCl缓冲液溶解备用。4)油菜饼抗菌肽的活性测定①将真菌接种在PDA平板上，28°C培养三天，让其形成成熟的孢子。供试菌株玉米 赤霉、柑橘绿霉、黑曲霉、黄曲霉。②用接种针勾取少量孢子(无菌操作)混入2ml无菌水中，剧烈震荡后加入约 200ml 50°C左右的PDA培养基(已加入了 100 y g/ml的氨卞青霉素)中，立即混勻倒板，冷 却待用。③活性测定时，用6mm直径打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加样品至平板， 正面放置，28°C培养箱培养5d。测量抑菌圈直径。5)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离小肽的Tricine-SDS-PAGE，分离胶浓度4%，浓缩胶浓度15%，样品分别添加 还原性样品缓冲液(含巯基乙醇)和非还原性样品缓冲液(不含巯基乙醇)，在沸水中煮 5-10分钟，冷却离心后取20 u 1上样。6)抗菌肽的稳定性分析①热稳定性检测将抗菌肽分离液于40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C、120°C下分别处理 15min,以柑橘绿霉为供试菌，以原抗菌肽分离液作为对照，重复3次，测定其抑菌圈直径， 每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其热稳定性。②酸碱稳定性检测将抗菌肽分离液5mL用lmol/L HC1调整pH为3、4、5、6、7五个处理；另取5mL抗 菌蛋白(肽)分离液用111101/1妝011调整？11为9、10两个处理，以原抗菌肽分离液(pH8)作 为对照，以柑橘绿霉为受试菌，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其稳定性。
7)对真菌抑制作用的扫描电镜观察在柑橘绿霉的抑菌实验中，未加入油菜饼抗菌肽提取液的平板未发生抑菌效果， 加入油菜饼抗菌肽提取液的平板产生了抑菌效果，分别切下前者菌丝正常生长的培养基 (A)和后者(B)抑菌圈内的培养基，进行电镜观察。8)油菜饼抗菌肽提取物的动物急性毒性试验选昆明种小白鼠20只，其中雌性10只，雄性10只，体重为20士2g。将实验动物 随机分为2组，每组10只，一个给药组和一个对照组。雌雄分开喂养。按小鼠每10克体重 灌胃0. 4ml (已达最大体积)受试药物(油菜饼抗菌肽提取液，0. 8g/mL)，一日内给药一次。 给药后立即观察至6小时，以后每天观察，连续7天，第8天解剖观察。9)油菜饼蛋白提取物对饲料中霉菌抑制作用。①抑菌活性试验采用平皿抑菌圈法，将配好的不同浓度的防霉物质——油菜饼抗菌肽、恩拉鼎预 混剂、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0. 8%、0. 25%,0. 08%,0. 05%定量地加到定量 的已溶化的霉菌培养基中混勻，倒入灭菌的培养皿中，待培养基冷却后在中心部位接种各 种测试菌株。由于恩拉鼎主要用于防治家畜的消化道疾病，在防霉作用方面未见报道，故试 验时它的添加量增加为正常使用量的250倍。同时设置空白组，置于恒温恒湿箱内(28°C) 培养，观察霉菌的生长情况。②饲料防霉实验油菜饼抗菌肽提取物、恩拉鼎、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8%、 0.25%、0.08%、0.05%的添加量添加到粉料中，并设空白组(CK)。上述各成分分别进行强 化试验和常规试验。强化试验该方法是提高饲料水分含量，恶化环境(高温、高湿)，促使饲料尽快发 霉，根据霉变严重程度及测定霉菌总数来判断防霉效果。在18%含水量的粉料中按设计的 比例添加防霉物质，置培养箱(温度36°C，相对湿度95%以上)培养。常规试验在正常饲料(粉料的自然水分为12. 58% )中按设计的比例添加防霉 物质，同时设置空白组，在自然环境下储放(试验期间温度为25°C 30°C，空气相对湿度为 80%左右)，各试验样品采用独立包装，便于取样。定期进行水分、霉菌总数的测定，每天定 时观测室温、料温、空气相对湿度和饲料霉变情况等。③测定方法霉菌菌落总数的测定按GB/T 13092-2006饲料中霉菌总数的测定方法测定。水分的测定按GB/T 6435-1986饲料水分的测定方法测定。
具体实施例方式1)培养基制备PDA培养基(土豆马铃薯培养基)马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水lOOOmL，pH自然；121°C 灭菌 30min。2)抗真菌活性检测方法①孢子悬液的制备取长满真菌菌落(已形成分生孢子)的PDA平板，加入适量无菌水，玻璃棒轻轻搅
6动洗脱孢子。然后将该洗脱液用4层无菌纱布过滤，除去菌丝，加适量无菌水配制制成3 5X104个孢子/mL左右的孢子悬液，置4°C条件下保存。供试菌株为柑橘绿霉和黑曲霉。②打孔法制作PDA平板，吸取100 u L供试菌种的孢子悬液，无菌操作，均勻涂布到平板上， 晾干。用6mm直径的打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加样品或无菌水至平满，正面放 置，28°C培养箱培养5d。测量抑菌圈直径。3)油菜饼抗菌肽的分离纯化①油菜蛋白粗提液的制备称取油菜饼40g磨碎，加200mL 0. 05mol/L的pH8. 0的Tris-HCl缓冲液，4°C放置 12h 后，4°C，4000r/min 离心 30min 取上清液。②硫酸铵分级沉淀粗蛋白上清液200mL，分成5份，用硫酸铵沉淀，饱和度分别为30 %，40 %，50 %，60 %和 70% 4°C放置过夜，4°C，14，000r/min 离心 20min，取沉淀，用 lmL 0. 05mol/L 的 pH8. 0 的 Tris-HCl缓冲液溶解。检测其抑菌效果，筛选出具有最好抑菌效果的饱和度，按此饱和度进 行盐析。③脱盐将粗提液放入透析袋中，透析液选用0. 05mol/L的pH 8. 0的Tris-HCl缓冲液，每 隔2小时换一次透析液。④分子筛柱层析Sephadex G-100，取提取液上样，用 0. 05mol/L 的 pH8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液洗脱， 流速0. 15mL/min，每3min收集1管，逐管收集，以洗脱液为对照测定每管的0D28(I值。并测 试每管洗脱液的抑菌活性。 冑双 1 才目fei普夕去(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) i^it对具有抑菌效果的收集液进一步纯化。检测各峰抑菌活性，收集抗菌活性部分。⑥分离液浓缩将具有抗菌活性的分离液冷冻干燥，粉末用适当体积的0. 05mol/L的pH8. 0的 Tris-HCl缓冲液溶解备用。4)油菜饼抗菌肽的活性测定①将真菌接种在PDA平板上，28 °C培养三天，让其形成成熟的孢子。供试菌株玉米 赤霉、柑橘绿霉、黑曲霉、黄曲霉。②用接种针勾取少量孢子(无菌操作)混入2ml无菌水中，剧烈震荡后加入约 200ml 50°C左右的PDA培养基(已加入了 100 y g/ml的氨卞青霉素)中，立即混勻倒板，冷 却待用。③活性测定时，用6mm直径打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加样品至平板， 正面放置，28°C培养箱培养5d。测量抑菌圈直径。5)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离小肽的Tricine-SDS-PAGE，分离胶浓度4%，浓缩胶浓度15%，样品分别添加 还原性样品缓冲液(含巯基乙醇)和非还原性样品缓冲液(不含巯基乙醇)，在沸水中煮 5-10分钟，冷却离心后取20 u 1上样。
6)抗菌肽的稳定性分析①热稳定性检测将抗菌肽分离液于40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C、120°C下分别处理 15min,以柑橘绿霉为供试菌，以原抗菌肽分离液作为对照，重复3次，测定其抑菌圈直径， 每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其热稳定性。②酸碱稳定性检测将抗菌肽分离液5mL用lmol/L HC1调整pH为3、4、5、6、7五个处理；另取5mL抗 菌蛋白(肽)分离液用111101/1妝011调整？11为9、10两个处理，以原抗菌肽分离液(pH8)作 为对照，以柑橘绿霉为受试菌，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其稳定性。7)对真菌抑制作用的扫描电镜观察在柑橘绿霉的抑菌实验中，未加入油菜饼抗菌肽提取液的平板未发生抑菌效果， 加入油菜饼抗菌肽提取液的平板产生了抑菌效果，分别切下前者菌丝正常生长的培养基 (A)和后者(B)抑菌圈内的培养基，进行电镜观察。8)油菜饼抗菌肽提取物的动物急性毒性试验选昆明种小白鼠20只，其中雌性10只，雄性10只，体重为20士2g。将实验动物 随机分为2组，每组10只，一个给药组和一个对照组。雌雄分开喂养。按小鼠每10克体重 灌胃0. 4ml (已达最大体积)受试药物(油菜饼抗菌肽提取液，0. 8g/mL)，一日内给药一次。 给药后立即观察至6小时，以后每天观察，连续7天，第8天解剖观察。9)油菜饼蛋白提取物对饲料中霉菌抑制作用。①抑菌活性试验采用平皿抑菌圈法，将配好的不同浓度的防霉物质——油菜饼抗菌肽、恩拉鼎预 混剂、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0. 8%、0. 25%、0. 08%、0. 05%定量地加到定量 的已溶化的霉菌培养基中混勻，倒入灭菌的培养皿中，待培养基冷却后在中心部位接种各 种测试菌株。由于恩拉鼎主要用于防治家畜的消化道疾病，在防霉作用方面未见报道，故试 验时它的添加量增加为正常使用量的250倍。同时设置空白组，置于恒温恒湿箱内(28°C) 培养，观察霉菌的生长情况。抑菌活力(％ )=(对照菌盘扩展直径_含抗菌物质菌盘扩展直径)X 100% /对 照菌盘扩展直径。②饲料防霉实验油菜饼抗菌肽提取物、恩拉鼎、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8%、 0.25%、0.08%、0.05%的添加量添加到粉料中，并设空白组(CK)。上述各成分分别进行强 化试验和常规试验。强化试验该方法是提高饲料水分含量，恶化环境(高温、高湿)，促使饲料尽快发 霉，根据霉变严重程度及测定霉菌总数来判断防霉效果。在18%含水量的粉料中按设计的 比例添加防霉物质，置培养箱(温度36°C，相对湿度95%以上)培养。常规试验在正常饲料(粉料的自然水分为12. 58% )中按设计的比例添加防霉 物质，同时设置空白组，在自然环境下储放(试验期间温度为25°C 30°C，空气相对湿度为 80%左右)，各试验样品采用独立包装，便于取样。定期进行水分、霉菌总数的测定，每天定 时观测室温、料温、空气相对湿度和饲料霉变情况等。
③测定方法霉菌菌落总数的测定按GB/T 13092-2006饲料中霉菌总数的测定方法测定。水分的测定按GB/T 6435-1986饲料水分的测定方法测定。10)结果油菜饼粗蛋白纯化方法中盐析用硫酸铵的最适饱和度为60%，从油菜 饼的水溶性成分中分离得到小肽的提取物，其分子量在6. 2 8. 2KD之间。并且在温度升 高到90°C依然保持活性，在pH7 8的时候抑菌效果最为明显。该小肽物质对受试真菌有 明显的抑制作用。这种活性肽能够很明显地影响真菌菌丝和孢子的正常生理形态，但对小 鼠无不良影响。通过与几种防腐剂对饲料中霉菌抑制作用的比较发现，油菜饼抗菌肽提取 物的防霉性能优于恩拉鼎、富马酸，仅次于复合型防霉剂霉必克。
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权利要求
一种油菜饼抗菌肽的分离纯化、稳定性和安全性测试方法，包括(1)培养基制备；(2)抗真菌活性检验；(3)将一定量的油菜饼磨碎，加200mL 0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，4℃放置12h后，4℃，4000r/min离心30min取上清液；再通过饱和度为60±5％的硫酸铵沉淀、脱盐(透析液选用0.05mol/L的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液)、分子筛柱层析(Sephadex G-100，取提取液上样，用0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱)以及高效液相色谱法对粗蛋白进行纯化，将纯化后的分离液冷冻干燥成粉末，用适当体积的0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解备用；(4)将提取的油菜饼抗菌肽进行活性测定；(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳测定油菜饼抗菌肽的分子大小；(6)对提取的油菜饼抗菌肽进行热稳定性、酸碱稳定性分析；(7)扫描电镜观察油菜饼抗菌肽对真菌的抑制作用；(8)选昆明种小白鼠，做油菜饼抗菌肽提取物的动物急性毒性试验；(9)通过抑菌活性试验和饲料防霉实验检验油菜饼抗菌肽提取物对饲料中霉菌的抑制作用。
2.权利要求1的粗蛋白提取材料，是油菜饼粕。
3.权利要求1的纯化粗蛋白方法，所述硫酸铵沉淀所需的硫酸铵饱和度为60士5%。
4.权利要求1的纯化粗蛋白方法，所述脱盐所需透析液为0.05mol/L的pH8. 0的 Tris-HCl缓冲液。
5.权利要求1的纯化粗蛋白方法，所述柱层析材料为S印hadexG-100，洗脱液为 0. 05mol/L 的 pH8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液。
6.权利要求1的供试菌株为玉米赤霉、柑橘绿霉、黑曲霉、黄曲霉。
全文摘要
本发明提供了一种新的对饲料中的霉菌有很好抑制作用的抗菌肽。该抗菌肽来源于油菜饼，其抑菌活性较高、分子量小、稳定性强、安全无毒，在饲料防腐试验中显示出比单一化学防霉剂更好的抑菌效果。本发明还提供了油菜饼抗菌肽的分离纯化方法、稳定性测试方法、动物急性毒性试验方法以及提供一种防止饲料中霉菌的应用方法。
文档编号A23K1/00GK101849608SQ201010176000
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者侯若彤, 冯甦, 杨志荣, 聂远洋, 赵建, 颜亮 申请人:四川大学