专利名称：花生高效转基因方法
技术领域：
本发明涉及一种植物转基因技术，尤其涉及一种花生高效转基因技术。
背景技术：
转基因技术能打破物种界限，利用常规手段难以利用的优异基因，从而创造出抗 各种生物与非生物胁迫或优质的植物新品种，同时还是基因分离及基因功能分析的重要工具。花生不仅是主要的油料作物，而且是重要的优质食用植物蛋白来源。通过转基因 技术提高花生抗黄曲霉侵染或产毒的能力，有望解决严重影响人体健康的黄曲霉毒素污染 问题。对某些病毒病而言，花生种质抗源贫乏，转基因技术可用于增强花生品种对这些病毒 病的抗性。利用RNA干涉技术下调花生过敏原基因表达，也已展现出良好的前景。转基因 技术可望用于改善花生蛋白质氨基酸组成、提高含油量。由于可以生食，花生被普遍认为是 一种良好的生产人用或动物用口服疫苗或其它医用产品的生物反应器，而基于油质体的表 达系统，可为分离纯化目的产品提供便利。农杆菌介导法和基因枪轰击法是花生上目前普遍采用的转基因方法。研究表明， 根癌农杆菌侵染花生的效果因菌株、细菌密度、预处理、接种方法、花生基因型和外植体类 型而异。印度国际半干旱热带作物研究所(ICRISAT)建立的根癌农杆菌介导的花生转基因 技术在西班牙型花生几24上取得了成功。成熟种子子叶在芽诱导培养基上培养2周，再转 至芽伸长培养基上培养2周。摘取外植体带芽的部分做2-3次、每次4周的继代培养。伸长 到3-4cm的芽在生根培养基上培养2-3周诱导生根。获得一代转基因花生所需时间较长， 至少需要7-8个月。且此法仅适用于西班牙型花生品种。美国佐治亚大学的Peggy Ozias-Akins实验室建立的花生基因枪法转基因流程， 已被多个实验室直接采用或略加修改后采用。此法的靶组织是胚性组织，源自培养于含 3-30mg/L毒莠定MS或FN-Lite培养基上的未成熟子叶、幼叶或成熟种子胚芽。从开始培养到 获得一致的培养物需要3-6个月时间。长期培养物用于转化常会产生不育问题。hph基因作 为选择标记效果极好。轰击的组织在含20mg/L潮霉素的半固体或液体培养基上筛选3个月。 再生与繁殖各需3和5个月。此法获得一代转基因花生所需时间较长，至少需要15-19个月。 在四个市场型(弗吉尼亚型、兰娜型、西班牙型和瓦伦西亚型)品种上均有成功的报道。花生上应用的转基因方法还有PEG介导法及花粉管通道法等。作为籽粒豆类，花 生组培难度较大，再生体系只在少数几个基因型上建立起来，因此除花粉管通道法外的其 它方法普遍具有基因型依赖性的缺陷，由于组培再生耗时较长，转基因植株常常遭受不育 性的困扰。依赖于组织培养的转基因技术需要较多设备。这已成为花生转基因技术规模化 应用的主要障碍。
发明内容
本发明的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种花生高效转基因方法，其弥补现行花生转化率低，操作繁琐的不足。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案其包括基因注入步骤，基因注入是指 将含目的基因的植物表达载体在特定时间注入田间生长的特定花生花器内；所述的目的基 因表达载体，是指浓度为600-1800ng/ml的载体溶液；所述的特定时间，是指花生盛花期特 定时段；所述的花器，是指花朵翼瓣间和/或花萼管。以田间生长的花生花器为受体，注入一定量含特定目的基因的植物表达载体，此 法操作简单，不需要昂贵设备。基于周光宇(1974)提出的将外源DNA直接导入植物的设想及其在棉花、水稻等作 物上应用的成功经验，在花生上初步建立了植株水平的花器注射转基因技术。开花当日上 午7 9时将外源DNA或目的基因构建体溶液缓缓注入受体花器，注射量滴于翼瓣间的以 注满为止；注入花萼管的，以花生龙骨瓣处内冒出气泡为止。这一方法的有效性已为斑点杂 交、PCR-Southern杂交、gus活性分析以及蛋白质电泳所证实。用该法将野生种A. glabrata 总DNA导入花17、鲁花8号、鲁花9号等花生栽培品种，其后代的形态、产量和品质等性状均 产生了明显变异。创造出耐旱性增强、显著增产或蛋白质含量提高1.9个百分点的新种质。 将牛胸腺DNA和酪蛋白DNA基因导入花生品种白沙1016和鲁花10号，发现0:代株形、分枝、 果形、熟性、育性等性状均出现较大分离，总变异率为34. 94. 1%。用质粒通过此法转 化花生，发现转化率在0. 4% 0. 5%之间。将海滩盐生植物秋茄和海边月见草总DNA导入 花生获得的后代种子(T2)在140mMNaCl溶液中浸种催芽，发芽率分别为47. 5%和44. 1%， 而对照种只有15. 7%。将mtlD基因转入花生，对后代进行耐盐性测定、PCR及Southern杂 交分析，表明该基因已整合入花生基因组中，转基因1代种子在140mM NaCl溶液中发芽率 是原品种的1. 4倍。由于不需要组织培养的步骤，易获得后代种子，这种转基因方法应具有 广泛的基因型适用性。该转基因技术操作简单，不需贵重仪器，便于普及推广。受花器注射转基因技术的启发，本发明将化学诱变剂注入花生花器，成功获得了 花生荚果显著变大和变小的突变体和高产、优质的花生突变体，并积累了大量经验。本发明 就是在前述研究工作的基础上提出的，极大地提高了花生的基因转化率。与现有转基因技术相比，本发明不需要进行组织培养、所需设备简单低廉、耗时 短，载体用量少、费用低，尤其转基因的转化率高，可以满足花生规模化转基因的要求，对于 花生转基因研究、重要功能基因的分离及分析等均具有重要意义。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明做详细描述图1是注射EGFP基因后收获的一粒花生种子EGFP基因扩增产物部分测序图。
具体实施例方式EGFP基因导入一、试验材料及表达载体材料本试验采用4个基因型，包括花生品种(系)花育22号、花育31号、鲁花12 号、06-测 B8。载体带有EGFP基因的植物表达载体。
二、试验方法1.基因导入于隔离区内进行花生转基因操作。浓度为600 1800ng/ml的含EGFP基因的植物 表达载体注入，由不同时间、不同部位组合的4种注射方法4181、4182、4182、々282，在2009 年6月26-30日进行。处理的花在枝条相应节位栓绳标记。统计注射花数量、收获种子粒 数。2. PCR鉴定转化体收获的花生籽仁分别编号，按本室建立的利用小部分子叶组织快速提取DNA方法 制备PCR模板。50 u 1 PCR体系内含DNA模板2 yl、10 y M EGFP特异引物(EGFP-F1 :5，-GACCATGTGATCGCGCTTCTCGTT-3，，EGFP-R1 :5，-ACCCTCGTGACCACCCTGACCTAC-3，)各 1 U 1> Tiangen 2XTaq Platinum PCR Master Mix 25ul。程序为 94°C 3min ;94°C lmin， 61.6°C 40sec,72°C lmin，35个循环；最后于72 °C延伸5min。EGFP特异扩增产物长度为 483bp。经琼脂糖凝胶电泳检测有预期长度PCR产物后，PCR产物直接测序。阳性对照以带 有EGFP的质粒DNA做模板，阴性对照取未注射的相应花生基因型的种子提取DNA做模板。 得到的DNA序列以DNAStar软件包中的SeqMan构建叠连群，进行比较。计算测试种子数/ 注射花朵数、PCR阳性种子数/测试种子数、PCR阳性种子数/注射花朵数。三、结果统计EGFP基因载体注入4个花生基因型，总共处理了 6200朵花，收获种子994粒，其中 925粒经PCR测试，369粒呈阳性。平均而言，PCR测试种子粒数占处理花朵数的14. 92%, PCR阳性种子粒数占全部测试种子粒数的35. 87%,占处理花朵数的5. 33%。4个花生基因 型均得到了 PCR阳性种子。共提交39粒花生种子EGFP特异引物PCR产物直接测序，其结 果与EGFP序列完全相同(部分测序结果见说明书附图1)。A1B2处理效果(统计结果见表 1)总体好于其它3种处理，A1B2处理中4个基因型均以载体浓度为1000-1300ng/ml效果 最优，转化率(阳性种子粒数/处理花朵数)为11. 33% 32. 00%。下表为A1B2注射法注入DNA不同浓度对花生基因转化率的影响
5 注表中 I 代表 600-800ng/ml ；II 代表 1000_1300ng/ml ；III 代表 1500_1800ng, ml。
权利要求
一种花生高效转基因方法，包括基因注入步骤，其特征在于，基因注入是指将含目的基因的植物表达载体在特定时间注入田间生长的特定花生花器内；所述的目的基因表达载体，是指浓度为600-1800ng/ml的载体溶液；所述的特定时间，是指花生盛花期特定时段；所述的花器，是指花朵翼瓣间或/和花萼管。
2.根据权利要求1所述的花生高效转基因方法，其特征在于基因表达载体的注入量， 滴于翼瓣间的以注满为止。
3.根据权利要求1所述的花生高效转基因方法，其特征在于基因表达载体的注入量， 注入花萼管的，以花生龙骨瓣处内冒出气泡为止。
全文摘要
本发明涉及一种植物转基因技术，尤其涉及一种花生高效转基因技术。本发明的花生高效转基因方法，包括基因注入步骤，基因注入是指将含目的基因的植物表达载体在特定时间注入田间生长的特定花生花器内；所述的目的基因表达载体，是指浓度为600-1800ng/ml的载体溶液；所述的特定时间，是指花生盛花期特定时段；所述的花器，是指花朵翼瓣间或/和花萼管。与现有转基因技术相比，本发明不需要进行组织培养、所需设备简单低廉、耗时短，载体用量少、费用低，尤其转基因的转化率高，可以满足花生规模化转基因的要求，对于花生转基因研究、重要功能基因的分离及分析等均具有重要意义。
文档编号A01H5/00GK101864450SQ20101018254
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者唐月异, 姜永兴, 崔凤高, 张建成, 李贵杰, 杨伟强, 王传堂, 王秀贞, 禹山林, 陈殿绪 申请人:山东省花生研究所