一种应用于猪、鸡养殖的制剂的制作方法

文档序号:112052
专利名称:一种应用于猪、鸡养殖的制剂的制作方法
技术领域
本发明涉及一种应用于猪、鸡养殖的制剂,具体是由粘膜乳杆菌制成的制剂在促进猪、鸡的生长,防治猪、鸡疾病或提高饲料转化率中的应用。
背景技术
2006年底在全国爆发的大菱鲆药残事件给我们敲响了警钟。欧盟已于2006年全面禁止抗菌药作为饲料添加剂在动物养殖中的应用。为保证食品安全,美国等发达国家对肉类、海产品等抗菌药残留进行检测。随着中国加入世贸组织,名优产品出口被普遍看好。 但由于国内养殖不科学使用抗生素等有害药物的现象严重,大大限制了产品的出口。抗菌药替代产品是猪和鸡养殖业中迫切需要的。

发明内容
本发明的目的是提供一种促进猪、鸡的生长,防治猪、鸡疾病或提高饲料转化率的制剂,该制剂由粘膜乳杆菌制成。本发明的制剂的制备优选是通过下述步骤实施的,但不局限于此制备工艺,公知的能实现的制备工艺均可以采取可能含粘膜乳杆菌的样本,然后将样品置于灭菌厌氧瓶内,吹入氮气同时充分混合,迅速从中取一定量的样品加入18mL灭菌的稀释液中,吹入氮气同时充分混勻,在无菌操作台内,进行10—1、10_2、10_3、ΙΟ"4, ΙΟ"5, ΙΟ"6, ΙΟ"7梯度稀释,取 ΙΟ"5, ΙΟ"6, ΙΟ"7三个稀释梯度,分别涂布于粘膜乳杆菌选择性单菌落分离固体培养基上,置于厌氧罐内,厌氧37°C下培养48小时,选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中,置于厌氧罐内,厌氧37°C下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后,将菌体冷冻真空干燥,调制出干燥菌粉,然后根据《伯杰细菌鉴定手册》、相关细菌鉴定文献或16S rRNA序列对比分析进行粘膜乳杆菌鉴定和毒性试验,将无毒性的粘膜乳杆菌干燥菌粉按需要比例添加辅料制成片剂、胶囊、散剂、粉剂或液体制剂等各种剂型,或制成兽药和饲料添加剂,也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到协同作用。粘膜乳杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于纯化水IOOOmL,胰蛋白胨10g,酵母浸膏5g,三水醋酸钠晶体5g,檬酸三铵2g,MgSO4. 7H20 0. 2g,琼脂15g,肉浸膏 10g,葡萄糖 20g,吐温-80 lmL,磷酸氢二钾 2g, MnSO4. 2H20 0. 05g。调 ρΗ6· 2-6. 3,121 °C 高压灭菌15min。粘膜乳杆菌液体扩增培养基优选但不局限于纯化水lOOOmL,胰蛋白胨10g,酵母浸膏5g,三水醋酸钠晶体5g,檬酸三铵2g,MgSO4. 7H20 0. 2g,肉浸膏10g,葡萄糖20g,吐温-80 lmL,磷酸氢二钾 2g,MnSO4. 2H20 0. 05g。调 pH6. 2-6. 3,121°C 高压灭菌 15min。为进一步具体说明本发明,发明人利用上述方法通过粘膜乳杆菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了无毒性的粘膜乳杆菌,本发明所述粘膜乳杆菌并不局限于为说明本发明所述的菌株,只要无毒性的粘膜乳杆菌均是本发明所述,均在本发明的保护范围内。
本发明所述粘膜乳杆菌优选但不限于粘膜乳杆菌DH103保藏编号CGMCC3766、粘膜乳杆菌DH105保藏编号CGMCC3765或粘膜乳杆菌DH106保藏编号CGMCC3763。本发明实施说明中优选使用的粘膜乳杆菌的细菌学性质1、为说明本发明,本发明利用上述方法分离的粘膜乳杆菌分别为粘膜乳杆菌 DH103保藏编号CGMCC3766、粘膜乳杆菌DH105保藏编号CGMCC3765或粘膜乳杆菌DH106保藏编号 CGMCC3763。2、菌落形态显微镜观察杆菌,革兰氏染色阳性。平板形态菌落呈乳白色、表面光滑、圆润、凸出于培养基表面、大小l_2mm。3、生理生化鉴定明胶液化_ ;过氧化氢酶_ ;硫化氢_ ;硝酸盐还原_ ;是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定葡萄糖+ ;核糖+ ;麦芽糖+ ;蔴糖+ ;葡糖酸+ ;D-木糖+ ;蜜二糖+ ;D-棉子糖+ ;D-果糖_ ;丙三醇_ ;赤藓糖醇_ ;L-木糖-;侧金盏花醇_ ;肌醇_ ;山梨醇_ ; 纤维二糖_ ;海藻糖_ ;松三糖_ ;甘露醇_ ;菊粉_。5、分离菌株进行16S rRNA基因测序,测得序列用BLAST与GenBank和RDP数据库中的基因序列进行相似性分析,确定分离菌株均为粘膜乳杆菌。本发明所述的粘膜乳杆菌指活生物个体。本发明是以有效剂量的上述粘膜乳杆菌作为主要药物活性成份,按照一定的制剂工艺,加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、 增溶剂等辅料,制成任何一种适合于使用的剂型,如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、 粉剂等剂型。本发明所述以有效剂量的上述粘膜乳杆菌作为主要药物活性成份制成活菌制剂, 也可以是上述粘膜乳杆菌与双歧杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌中的一种或几种或其他活性成份组合制成活菌制剂,以起到协同作用,提高效果。本发明所指有效剂量是指以上述粘膜乳杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于lX106CFU/g,一般在 1 X 109CFU/g 以上,最高可达至Ij 1 X 10"CFU/g 或 1 X 10"CFU/g 以上。本发明所指有效剂量是指以上述粘膜乳杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于lX106CFU/mL,一般在 1 X 109CFU/mL 以上,最高可达到 1 X 10nCFU/mL 或 1 X 10nCFU/mL 以上。由于本发明首次公开了粘膜乳杆菌作为主要活性成份制成制剂在猪、鸡养殖中的应用,因此含上述粘膜乳杆菌的制剂在猪、鸡养殖中的应用均属于本发明的保护范围。本发明所述的粘膜乳杆菌在制成任何一种剂型时,均具有促进猪、鸡的生长,防治猪、鸡疾病或提高饲料转化率的作用。任何剂型,如果其组份中含有上述粘膜乳杆菌成份制备成制剂,在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有促进猪、鸡的生长,防治猪、鸡疾病或提高饲料转化率的作用,则落入本发明的保护范围之内。本发明所述的粘膜乳杆菌可以制成兽药或饲料添加剂。将上述粘膜乳杆菌制成的兽药或饲料添加剂应用于促进猪、鸡的生长,防治猪、鸡疾病或提高饲料转化率等猪、鸡养殖中,则落入本发明的保护范围之内。
具体实施例方式制备例说明上述已经对粘膜乳杆菌制剂的制备进行说明,这里通过粘膜乳杆菌 DH103保藏编号CGMCC3766、粘膜乳杆菌DH105保藏编号CGMCC3765或粘膜乳杆菌DH106保藏编号CGMCC3763粉剂为例进行具体说明,其他粘膜乳杆菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握,其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握,在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述,公知的能够达到制备目的的方法均可以,实施例的制备说明只是对本发明的说明,并不是对本发明保护范围的限制。制备实施例1粘膜乳杆菌粉剂的制备1菌粉的制备和菌种的鉴定采取小猪、鸡或牛等动物的粪便,然后将粪便置于灭菌厌氧瓶内,吹入氮气同时充分混合,迅速从中取2克粪便加入ISmL灭菌的稀释液中,吹入氮气同时充分混勻,在无菌操作台内,进行IO-1UO-2UO-3UO-4, ΙΟ"5, ΙΟ"6,10_7梯度稀释,取ΙΟ"5, ΙΟ"6,10_7三个稀释梯度, 涂布于粘膜乳杆菌选择性单菌落分离固体培养基上,置于厌氧罐内,厌氧37°C下培养48小时,选择长势良好的单菌落接种到粘膜乳杆菌液体扩增培养基中,置于厌氧罐内,厌氧37°C 下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后,将菌体冷冻真空干燥,调制出干燥菌粉,活菌数均为lX109CFU/g以上,然后进行菌种鉴定,经生理生化和16S rRNA序列对比分析鉴定为粘膜乳杆菌,分别为粘膜乳杆菌DH103保藏编号CGMCC3766、粘膜乳杆菌DH105保藏编号CGMCC3765或粘膜乳杆菌DH106保藏编号CGMCC3763。2毒性试验2. 1动物及分组取40只SPF级别小鼠,6 8周龄,体重15 19g,随机分入粘膜乳杆菌DH103组、粘膜乳杆菌DH105组、粘膜乳杆菌DH106菌和未给药组,每组10只。2. 2制备菌液将上述不同的粘膜乳杆菌菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为 1 X 109CFU/mL 的菌液。2. 3方法各粘膜乳杆菌组和未给药组均给予相同的基础饲料,且饲养条件均一致,各粘膜乳杆菌组每天灌服粘膜乳杆菌菌液0. 5mL,未给药组每天灌服纯化水0. 5mL,饲喂6个月,观察体重及毒性反应。2. 4 结果各组小鼠均未出现异常情况,未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常,无眼球突出,排尿正常,皮肤、呼吸正常,无死亡情况,且各粘膜乳杆菌组的体重增加显著高于未给药组(P<0. 05),表明粘膜乳杆菌菌种有促进生长发育作用,说明效果良好,未见中毒反应。3制备成粉剂等剂型根据上述步骤和方法分离鉴定后,经实验检验无毒性,就可将粘膜乳杆菌菌种制成菌粉,然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型,优选据粘膜乳杆菌菌粉的活菌数,按比例添加淀粉制成粉剂,使活菌数不低于ι χ 109CFU/g,然后装袋。制备实施例2嗜酸乳杆菌菌粉的制备为进一步说明本发明的新颖性和创造性,在应用效果实施例中用嗜酸乳杆菌做对
5照研究。其中选用的嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌DF96106保藏编号CGMCC0313. 4。嗜酸乳杆菌菌粉的制备培养基为(培养基不限于本发明所述的,公知的培养基均可以)大豆蛋白胨(国产)5g,胰胨(Tryptone) 5g,酵母提取物5g,肉膏10g, K2HPO4 IOg,柠檬酸二铵2g,乙酸钠 5g,葡萄糖 20g,吐温 80 1. OmL, MgSO4 · 7H20 4. 8g,MnSO4. 4Η200· 05g,蒸馏水 1000M1,调 PH6. 2-6.4,121°C灭菌15分钟。将嗜酸乳杆菌DF96106接种到上述培养基中,置于厌氧罐内,厌氧37°C下扩增培养96小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后,将菌体冷冻真空干燥,调制出干燥菌粉,活菌数为lX109CFU/g以上。应用效果实施例说明本发明以粘膜乳杆菌DH103保藏编号CGMCC3766、粘膜乳杆菌DH105保藏编号CGMCC3765或粘膜乳杆菌DH106保藏编号CGMCC3763为代表说明粘膜乳杆菌的应用效果。应用效果实施例1 粘膜乳杆菌在猪养殖中的应用1材料与方法1. 1 材料1.1.1试验产品粘膜乳杆菌活菌粉剂,嗜酸乳杆菌活菌粉剂,活菌数均为1 X 109CFU/g以上。1. 1.2 试验猪选择30日龄的断奶健康仔猪150头(公母各半),随机分为5组,每组30头。1.2 方法1. 2. 1试验时间为30天。1. 2. 2该试验采取干料饲喂,试验组每吨饲料添加试验产品1000克,嗜酸乳杆菌组每吨饲料添加嗜酸乳杆菌活菌粉剂1000克,对照组不加试验产品。2试验结果试验结束后对各组断奶仔猪的日增重、日采食量、料重比、死淘率进行统计分析, 粘膜乳杆菌各组之间无统计学差异(P > 0. 05),粘膜乳杆菌与嗜酸乳杆菌和对照组之间有统计学差异(P < 0. 05),嗜酸乳杆菌与对照组之间无统计学差异(P > 0. 05)。见表1、2.表1不同处理组断奶仔猪的生长表现
权利要求
1.一种应用于猪、鸡养殖的制剂,其特征在于该制剂由粘膜乳杆菌制成。
2.按权利要求1所述应用,其特征在于促进猪、鸡的生长,防治猪、鸡疾病或提高饲料转化率。
3.按权利要求1所述制剂,其特征在于包括兽药或饲料添加剂。
4.按权利要求1所述粘膜乳杆菌,其特征在于粘膜乳杆菌指活的生物个体。
5.按权利要求1所述粘膜乳杆菌,其特征在于包括粘膜乳杆菌DH103保藏编号CGMCC 3766。
6.按权利要求1所述粘膜乳杆菌,其特征在于包括粘膜乳杆菌DH105保藏编号CGMCC 3765。
7.按权利要求1所述粘膜乳杆菌,其特征在于包括粘膜乳杆菌DH106保藏编号CGMCC 3763。
8.按权利要求1所述制剂,其特征在于固体制剂包含的总活菌数不低于IX106CFU/g, 一般在1 X 109CFU/g以上,最高可达到1 X 10nCFU/g或1 X 10nCFU/g以上;或液体制剂包含的总活菌数不能低于1 X 106CFU/mL, 一般在1 X 109CFU/mL以上,最高可达到1 X 10nCFU/mL 或 ι χ IoiiCfuAiL 以上。
全文摘要
本发明涉及一种应用于猪、鸡养殖的制剂,具体是由粘膜乳杆菌制成的制剂在促进猪、鸡的生长,防治猪、鸡疾病或提高饲料转化率中的应用。
文档编号A23K1/18GK102239963SQ20101018308
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者崔云龙, 李洪福 申请人:青岛东海药业有限公司
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