中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法

文档序号:112092
专利名称:中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法
技术领域
本发明涉及一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法。
技术背景
中华鲟(Acipenser sinensis Gray)为典型的河海洄游鱼类,国家一级保护动物。 目前,利用野生中华鲟亲鱼开展人工繁殖放流已成为该物种保护的重要措施之一,但由于 酷渔滥捕、水域污染和水利工程建设等人为活动造成其自然资源不断衰退,中华鲟已处于 濒危等级。在野生中华鲟人工繁殖过程中常常遇到雄鱼不足和雄鱼与雌鱼性腺发育不同步 的问题,利用超低温冷冻保存技术把中华鲟精子长期有效的保存起来,待遇到成熟的雌性 中华鲟亲鱼,即可对精液解冻,并与成熟鱼卵进行人工授精,以解决雌雄亲鱼性腺发育不同 步的问题。国外关于其它鱼类精液超低温冷冻保存研究的报道较多,相关技术也较为成熟, 国内也有关于中华鲟精液超低温冷冻保存研究的报道,但有关利用中华鲟超低温冷冻精液 人工授精操作方法尚未见报道。现有技术的缺点(1)国内鲟鱼的人工繁殖研究保护工作起步较晚,采用冷冻精液进行人工授精作 为人工繁殖的辅助措施,目前仅限于研究探索阶段,尚未应用到生产实践中。(2)国内外尚未见有关中华鲟冷冻精液人工授精操作方法的报道。

发明内容
为了克服上述缺陷,本发明提供一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法,掌握 一种可应用于生产有效的中华鲟冻精人工授精操作方法。本发明采用以下技术方案方案1 中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法,步骤如下(1)采集中华鲟雄鱼的精子,进行冷冻保存;(2)轻压中华鲟腹部能挤出卵或发现中华鲟产卵时开始对冷冻精子解冻;(3)卵子产出后,立即与解冻精子进行人工授精冻精授精采用不同激活溶液分 步进行激活授精,即将300ml卵子加入5ml解冻精子快速混合,随即加入激活溶液(10-20mM Tris,5-10mM NaCl,0· 1-0. 25mM KCl,pH 8. 5) 50ml 激活,柔和搅拌 20 秒后,再次加入解冻 精子5ml混合,20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合搅拌,20秒后加入孵化用水搅拌,然后 加入10%滑石粉脱粘,孵化用水冲洗后,将同批受精卵归并同一孵化筛中进行孵化。上述超低温冷冻精液是在-196°C的超低温保存的优质中华鲟冻精。本发明具有如下优点1、冻精分步激活授精方法有助于提高冻精活力,提高受精率;2、该方法已在野生中华鲟人工繁殖生产和子代中华鲟全人工繁殖生产中得到良 好应用,可有效解决当前中华鲟人工繁过程中雄鱼不足、雌雄亲鱼不能同步成熟的问题,为通过人工增殖方式对中华鲟进行保护,提供有力的技术支撑;3、本发明中所采用的激活溶液配方能够提高受精率和孵化率;4、该方法也适用于其他鲟鱼类的冷冻精液人工授精。
具体实施例本发明的技术方案具体实施例如下。在中华鲟人工繁殖过程中常常会遇到雄鱼不足的问题,该专利通过利用超低温冷 冻保存技术把中华鲟精子进行长期有的效保存,以解决雌雄亲鱼性腺发育不同步及充分利 用有限资源,从长远来讲对中华鲟资源的恢复和保护具有十分重要的意义。该实验是通过 利用超低温冷冻保存技术保存的子一代中华鲟精子进行了人工繁殖实验和效果分析,旨在 完善中华鲟全人工繁殖技术体系,为更好地保护中华鲟种质资源提供技术支撑。实施对象-196 °C超低温保存的中华鲟优质冻精。精卵来源用于全人工繁殖的中华鲟精液子与卵子,来自中华鲟研究所在纯淡水条件下驯养 的性腺发育成熟的子一代中华鲟雄鱼和雌鱼各一尾,分别于2009年9月29日和2009年11 月22日采用促黄体释放激素类似物(LRH-A2)对成熟的雄鱼和雌鱼进行注射催产,催产水 温度为18. 8-19°C,采取挤压法采集精子和卵子;精液在保鲜袋中充氧后于2-4°C冰箱内保 存,经超低温冷冻投入液氮中保存,人工繁殖实验时冷冻精子再解冻与子一代中华鲟成熟 鲟卵进行人工授精。精子冷冻及解冻利用离心管和装有液氮的液氮罐,取活力大于90%的鲜精按体积比1 3与 2-4°C的抗冻稀释液混合,平衡lOmin,分装1. 5ml离心管,采用二步降温法,即距液氮面上 2-3cm处平衡IOmin后,沉入液氮罐底部保存。精液在液氮中保存53天后取出,于38_40°C 水浴解冻lmin。解冻后的精液于2-4°C的冰箱中保存,待镜检。冻精活力镜检及激活剂筛选根据鲟鱼冻精的生理特性分别采用蒸馏水和以Tris、NaCl, CaCl 12、MgCl2, KCl 及D-Glucose (葡萄糖)等各组分不同配比配制不同浓度的激活剂激活冻精,通过激活冻精 活力镜检效果评价筛选冻精激活剂。解冻精子人工授精雌鲟自催产达效应时间,轻压腹部能挤出卵或发现鲟鱼产卵时开始解冻冷冻精 子,并同时采集卵子。将冻精从液氮中取出,于38-40°C水浴锅中Imin解冻,取少量精液涂 在载玻片上,滴加适量的蒸馏水混勻激活,立即在显微镜下观察精子的活力,选取激活率大 于65%冻精与采集的卵子进行授精。冻精激活授精采用激活溶液(IOmMTris, IOmM NaCl,0. ImM KCl,pH 8. 5)和 20mM 葡萄糖激活溶液分步激活授精,即300ml卵子加入5ml解冻精子快速混合,随即加入激活剂 50ml激活,轻轻搅拌20秒后,加入解冻精子5ml混合,20秒后加入20mM葡萄糖溶液混合搅 拌,20秒后加入孵化水搅拌,然后加入10%滑石粉脱粘,孵化用水冲洗后,将同批受精卵归 并同一孵化筛中进行孵化,发育至原肠期后统计受精率和孵化率。
在本次子一代中华鲟冻精授精实验的应用中,成功的获得了冻精受精的鲟鱼苗,结果表明利用超低温冷冻保存技术将精子长期有效保存起来,解决中华鲟在人工繁殖过程 中雌雄亲鱼性腺发育不同步问题,充分利用有限亲鱼资源进行繁殖的途径是可行的,为完 善中华鲟全人工繁殖技术体系,更好地保护中华鲟种质资源提供有力的技术支持。
权利要求
一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法,其包括如下步骤(1)采集中华鲟雄鱼的精子,进行冷冻保存;(2)轻压中华鲟腹部能挤出卵或发现中华鲟产卵时对冷冻精子进行解冻;(3)卵子产出后,立即与解冻精子进行冻精人工授精,冻精授精采用不同激活溶液进行分步激活授精即将300ml卵子加入5ml解冻精子快速混合,随即加入激活剂50ml激活,柔和搅拌20秒后,加入解冻精子5ml混合,20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合搅拌,20秒后加入孵化用水搅拌,然后加入10%滑石粉脱粘,孵化用水冲洗后,将同批受精卵归并同一孵化筛中进行孵化。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,将采集的精子经超低温冷冻直接投入液氮 中保存。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,授精的水温度为18.8-19°C。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,精子的冷冻采用离心管和装有液氮的液氮 罐,取活力大于90%的鲜精按体积比1 3与2-4°C的抗冻稀释液混合,平衡lOmin,分装 1.5ml离心管,采用二步降温法,即距液氮面上2-3cm处平衡IOmin后,直接投入液氮中冷冻保存。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,精子的解冻是将精液从液氮中取出, 38-40°C水浴Imin即可解冻,解冻后的精液在2_4°C冰箱存放。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的激活剂配方(1)10-20mM Tris,5-10mM NaCl,0· 1-0. 25mM KCl, ρΗ 8.5;(2)10-20mMD-Glucose。
7.根据冻精的生理特性和不同激活溶液的功能差异采用分步激活授精方法,有肋于提 高冻精活力,提高冻精受精率。
全文摘要
一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法,其包括如下步骤(1)采集中华鲟雄鱼的精子,进行冷冻保存;(2)轻压中华鲟腹部能挤出卵或发现中华鲟产卵时开始解冻冷冻精子;(3)卵子产出后,立即与解冻精子进行冻精人工授精,冻精授精采用不同激活溶液进行分步激活授精,即将300ml卵子加入5ml解冻精子快速混合,随即加入激活溶液(10-20mM Tris,5-10mM NaCl,0.1-0.25mM KCl,pH 8.5)50ml激活,柔和搅拌20秒后,再次加入解冻精子5ml混合,20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合搅拌,20秒后加入孵化用水搅拌,然后加入10%滑石粉脱粘,孵化用水冲洗后,将同批受精卵归并同一孵化筛中进行孵化。
文档编号A01K61/00GK101836615SQ20101018463
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者万建义, 田家元, 舒德斌, 郭柏福 申请人:中国长江三峡集团公司中华鲟研究所
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